官能ビス - ペプチドの固相合成方法を "安全キャッチ"を使用して

次の実験の全体的な目標は、固相技術を使用して官能基化されたBSPペプチドを合成することです。これは、保護されたBISアミノ酸をヒドロキシエチル安息香酸樹脂に充填することによって達成されます。次に、深い保護カップリングサイクルを繰り返して、官能基化されたbisアミノ酸を結合させ、BISペプチドを伸長させて目的の機能を示します。

最後に、第1のbisアミノ酸をαアミノ酸で修飾して、DIケトピラジン形成により樹脂からBISペプチドを切断する。液体クロマトグラフィー質量分析に基づいて、官能基化BSPペプチドを良好な粗純度で合成し、約10%の一貫した単離収率を示す結果が得られました。この技術の意味するところは、BISペプチドが固体樹脂上に組み立てられるため、溶液中での反応や副生成物がろ過によって容易に除去されるよりも操作が容易であるため、bisペプチドの並行合成およびライブラリー合成にまで及びます。

この手法の視覚的なデモンストレーションは、すべての反応が可能な限り完了に近づくために必要な多くの重要な詳細があるため、多くのステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。固相合成では、中間体を精製する方法はありません。したがって、クリーンな最終生成物を得るためには、すべての反応を可能な限り駆動する必要があります。

実験手順のチェックリストを作成することをお勧めします。これは、手順が反復的な性質を持つため、混乱を避けるためです。このプロトコールは、最初のBSPペプチドのローディング、最初のBSPペプチドの保護、および同時に樹脂キャッピングから始まります。開始するには、114ミリグラムのH-M-B-A-A樹脂を秤量して最初のBSPペプチドを8ミリリットルの反応容器にロードし、マグネチックスターバーを追加します。

容器の上部をゴム製のセプタムで覆い、アルゴンヌでチューブを少なくとも5分間パージします。その間に、書面によるプロトコルに記載されているように、活性化されたBISアミノ酸溶液を調製します。このビデオに添付して、溶液をシリンジで反応容器に移し、翌日アルゴンヌの下で一晩攪拌し、セプタムを取り外して反応混合物を排出します。

レジンに約2ミリリットルのクロロメタンを加えてレジンを洗浄します。30秒から1分間かき混ぜてから水気を切ります。このプロセスをDCMで4回繰り返し、次にレジンをジメチルホルムアミドで5回洗浄します。

最初のビスアミノ酸の深い保護と樹脂キャッピングを同時に行うには、酢酸とDCM中の33%臭化水素の溶液を反応容器に2ミリリットルゆっくりと加えます。DCMで樹脂を5回水気を切り、洗浄した後、15分間攪拌します。Dプロテクションシーケンスをもう一度繰り返します。

次に、レジンをDCMで5回、続いてDMFで5回洗浄し、DMF中のD-I-P-E-Aの5%容量溶液で2回洗浄してレジンを中和します。その後、DCMで5回、DMFで5回再度洗浄します。これで、保護された官能基化されたbisアミノ酸のカップリングを行うことができます。

まず、無水DCMで3回洗浄することにより、樹脂含有反応容器に不活性雰囲気を再導入します。次に、セプタムとアルゴンヌラインパージを取り付け、1〜2ミリリットルの無水DCMを加えて30秒間攪拌して容器を洗浄します。次に、アルゴンヌラインバブラーが上昇し始めるまで容器を排水します。

このプロセスを少なくとももう一度繰り返します。次に、アルゴンヌ雰囲気下で炎上乾燥試験管に官能基化bisアミノ酸の溶液を調製します。47マイクロリットルのDICを加え、90分間攪拌します。

次に、666マイクロリットルに35マイクロリットルのD-I-P-E-Aを加え、DMFを樹脂に含み、さらに5分間攪拌します。あらかじめ活性化したBISアミノ酸溶液をシリンジで容器に移し、翌日一晩撹拌します。反応混合物を排出し、アルゴンの下で無水DCMで2回洗浄します。

この手順の重要なステップは、bizアミノ酸カップリングです。ジケトピペラジンのリングクロージャーを確実にするために、追加の活性化剤を使用してより長い反応時間を採用しています。ジケトピラジンの閉鎖を促進するために、HOATとDIC溶液をアルゴン下で1時間攪拌します。

次に、セプタムを取り外し、反応混合物を排出します。レジンをDCMで5回、DMFで5回洗浄します。このセクションでは、官能基化されたBISアミノ酸の深い保護、F mocの深い保護、および最初のBISアミノ酸のアシル化について説明します。

保護した官能基化bisアミノ酸を深く保護するためには、反応容器にTFAとTIPSの溶液2ミリリットルをゆっくりと加え、水気後1時間撹拌し、DCMで樹脂を約30秒間洗浄した後、DCM洗浄を5回繰り返して水気を流します。次に、A-D-C-M-D-M-F洗浄後に、ディーププロテクションレジン洗浄シーケンス全体を繰り返します。DMF中のD-I-P-E-Aの5%容量溶液で2回洗浄し、レジンを中和します。

次に、もう一度D-C-M-D-M-F洗浄を行います。ここから、BISペプチドは、他の官能基化されたbisアミノ酸と伸長させるか、主要な窒素カルボン酸またはその両方で官能化することができます。FM基を保護するためには、DMF中の20%パイプパリジンの2ミリリットル溶液を加え、反応を20分間混合します。

レジンをDMFで5回水気を切り、洗います。レジンをさらに洗浄した後、このプロセスをもう一度繰り返します。A:調製したアミノ酸溶液を反応容器に添加して最初のbisアミノ酸を単離し、最終ステップとして6時間攪拌します。

レジンをDCMで5回、DMFで5回洗浄します。このプロトコールの最後の部分には、レジン結合アミノ酸からのバッハ基の除去とレジンからの切断が含まれます。まず、1対1のT-F-A-D-C-M溶液を2ミリリットルずつ反応容器に加え、30分間撹拌します。

レジンをDCMで5回水気を切り、洗います。次に、このプロセスをもう一度繰り返します。レジンを30秒間、DCMで5回、DMFで5回洗浄し、水気を切ります。

次に、無水DMFに10%D-I-P-E-Aの溶液を2ミリリットル加え、24〜48時間撹拌します。最後に、反応混合物を事前に秤量した丸底フラスコに集めます。この溶液の 30 マイクロリットルを LC MS ファイルで 450 マイクロリットルのテトラ ハイドロ FU に移し、分析のために提出します。

DMFの追加アリコートでレジンを洗い、丸底フラスコに集めます。以下の方法を使用して、合成全体にわたる樹脂の化学変換をモニターできます。遊離ヒドロキシル基を検出するには、まず使い捨てピペットで約1ミリグラムの乾燥樹脂を除去してメチルレッド試験を実施します。

4ミリリットルの反応容器ですすいでください。本文に記載されているように調製したメチルレッド溶液を加え、5〜10分間撹拌します。レジンを水気を切り、DCMで5回洗浄すると、オレンジ色または赤色のレジンビーズが遊離水酸基の存在を示します。

この試験は、最初のbisアミノ酸および樹脂キャッピングステップの負荷を評価するために使用できます。二次的な手段を検出するには、使い捨てピペットを介して約1ミリグラムの乾燥樹脂を小さなバイアルに移すことにより、クロラールテストを実施します。DMF溶液中の0.8ミリモルクロラールとDMF溶液中の2%酸性アルデヒドの両方を3滴加えます。.

そして、室温で5〜10分間座ってみましょう。この場合、青色または紫色の樹脂ビーズは、樹脂結合化合物上に遊離二次手段が存在することを示しています。活性化効率を確認するために、活性化トラップ試験を実施し、合成中の活性化化合物は、活性溶液の5〜10マイクロリットルを、手で混合した50マイクロリットルのオレインを含む液体クロマトグラフィー質量分析バイアルに移すことによって評価できます。

数秒間、溶液が黄色に変わり、450 マイクロリットルのテトラ ハイドロ ウランで希釈して、LC MS 分析に提出します。最終製品と活性化中間体は、C 18 逆相カラムと 0.1% ギ酸を含む水アセチルニトリルの溶媒システムを備えた LCM S システムを使用して評価できます。このL-C-M-S-U-Vトレースは、粗製品の良好な純度の一例を提供します。

21.3 分で見つかったスペクトルの主要なピークには、予想される生成物質量と一致するマスクがあることがわかります。これは、原油製品の質量スペクトルで視覚化でき、ピークは、質量に対応する主要なピークを示し、ナトリウムイオンの質量を加えたもの、およびIV DDE保護基の質量を差し引いた質量を示します。ここに示されているのは、精製されたスペクトルの LCMS UV トレースで、21.3 分後に非常に純度の高い生成物が明らかになったことと、この精製されたトライアピークの同一性を確認する質量スペクトルです。

このビデオを見れば、開発後に機能性ビスペプチドを合成するためにソリッドフェイス技術を使用する方法を十分に理解できるはずです。この技術は、bizペプチドの分野の研究者が、一度習得するとタンパク質間相互作用と触媒作用の応用を探求する道を開きました。この手法は、適切に実施されれば、4〜5日で官能基化されたbizペプチド三量体の合成につながる可能性があります。

この手順を試みるときは、この手順に従ってビーズを反応溶液と洗浄溶液に浸しておくことを忘れないでください。立体化学や代替機能がタンパク質結合や触媒活性に及ぼす影響など、追加の疑問に答えるために、パラレル合成やライブラリ合成などの他の方法を実行することができます。有機試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、適切な個人用安全装置やヒュームフードの使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。