マイクロ波照射を用いて潜在的な抗寄生虫治療薬としてのバックボーン環状ペプチドライブラリの開発

この手順の全体的な目標は、新しい抗寄生虫治療薬のためのマイクロ波照射を使用して、コンフォメーションの多様性を持つ焦点を絞った骨格環状ペプチド模倣ライブラリを開発することです。この方法は、タンパク質間相互作用を特異的に標的とする新しいツールの開発に役立ちます。この手順を開始するには、2.5ミリリットルの所望のアミノ酸、1ミリリットルの活性剤、および0.5ミリリットルの活性剤ベースをポリプロピレンカートリッジに加える。

カートリッジを自動マイクロ波シンセサイザーに入れ、25ワット、摂氏75度でカップリング反応を300秒間進行させます。反応が完了したら、レジンを7ミリリットルのN、N-ジメチルホルムアミド、またはDMFで室温で120秒間洗浄します。前のステップを5回繰り返した後、7ミリリットルのDMF中の20%ピペリジンを0.1モルの1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)とともにポリプロピレンカートリッジに加え、45ワット、摂氏75度で30秒間インキュベー

終了したら、反応混合物を排出します。次に、0.1モルのHOBtを含むDMF中の20%ピペリジン7ミリリットルをポリプロピレンカートリッジに加え、45ワット、摂氏75度で180秒間インキュベートします。反応混合物を水気を切った後、レジンを7ミリリットルのDMFで室温で120秒間洗浄します。

次に、レジンを7ミリリットルのジクロロメタン(DCM)で室温で120秒間洗浄します。無水物カップリングの場合は、7ミリリットルの1-メチル-2-ピロリジノン(NMP)でレジンを室温で120秒間洗浄します。終了したら、反応混合物を排出します。

前のステップを3回繰り返した後、50ミリリットルのポリプロピレンチューブ内の5ミリリットルのNMPに対応する無水物の10当量を溶解します。次に、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)1当量と、N、N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)10当量を溶液に加えます。この混合物を樹脂に加え、25ワット、75°Cで300秒間インキュベートします。

NMPで樹脂を洗浄した後、7ミリリットルのDMFで室温で120秒間洗浄してください。このとき、キャッププラグとストップコックを装着したポリプロピレンカートリッジにレジンを移し替えます。レジンをDCMで洗浄したら、レジン1gあたり1%のトリフルオロ酢酸、5%のトリイソプロピルシラン、94%DCMの混合物をポリプロピレンカートリッジに15〜25ミリリットル加えます。

ポリプロピレンカートリッジをシェーカーに置き、室温で5分間振とうします。これに続いて、真空剤を塗布してポリプロピレンカートリッジから溶液を排出します。上記の手順を3回繰り返した後、レジンを7ミリリットルのDCMで室温で120秒間洗浄します。

これらのステップは、いくつかの樹脂中のトリチル保護基がDCM-トリフルオロ酢酸溶液中で部分的に切断されていることがわかったため、非常に重要です。メチルトリチル基の除去は、複数回の洗浄を必要とするゆっくりとしたプロセスです。50ミリリットルのポリプロピレンチューブに、5ミリリットルのジブロモメタンに5相当のベンゾトリアゾール-1-リオキシ-トリス-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸を溶解します。.

次に、10相当のDIEAを溶液に加えます。DCMリンスした樹脂に混合物を加え、25ワット、75°Cで300秒間インキュベートします。その後、レジンを7ミリリットルのDCMで室温で120秒間洗浄します。

DCMで2回洗浄した後、レジンをポリプロピレンカートリッジに移し、ジエチルエーテルで2回洗浄します。レジンを真空デシケーターで室温で水酸化カリウムで少なくとも3時間乾燥させます。次に、10ミリリットルの予冷済みトリフルオロ酢酸切断カクテルを樹脂1グラムごとに追加します。

ポリプロピレンカートリッジをシェーカーに置き、室温で3時間振とうします。その後、レジンをろ過して50ミリリットルのポリプロピレンチューブに劈開液を回収します。チューブに35ミリリットルの冷たいジエチルエーテルを追加します。

氏4度で1、207倍gで5分間遠心分離します。次に、エーテル層をデカントします。カイザー試験では、16.5ミリグラムのシアン化カリウムを25ミリリットルの蒸留水に溶解して溶液Aを調製します。

溶液の1ミリリットルを49ミリリットルのペリジンで希釈します。次に、1グラムのニンヒドリンを20ミリリットルのエタノールに溶解して溶液Bを調製します。40グラムのフェノールを20ミリリットルのエタノールに溶解して溶液Cを調製します。

溶液を調製した後、樹脂からいくつかのビーズを試験管に移します。チューブに各溶液を3滴加え、混合します。最後に、加熱ブロックの試験管を摂氏110度で5分間加熱します。

バックボーン環状ペプチドの合成は、FMOC、t-ブチルプロトコルに従った固体支持体上の自動マイクロ波シンセサイザーを使用して行った。生成物を質量分析法で分析し、その純度をHPLCを用いて決定しました。生物学的スクリーニングにより、ペプチドpL1は、ヒトで最も重篤なリーシュマニア症である内臓リーシュマニア症を引き起こす寄生虫であるリーシュマニア・ドノバニに対して活性があることが示されました。

ペプチドpL1は、対照処理と比較して寄生虫の生存率を75%低下させました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば3〜5日で習得できます。開発後、この技術は、さまざまな分野の研究者が基礎研究や治療における薬理学的調節因子としてペプチドを探求する道を開きました。

このビデオを見れば、タンパク質間相互作用を特異的に標的とするための立体構造の多様性を持つペプチド模倣体の焦点を絞ったライブラリーを開発する方法について、十分に理解できるはずです。トリフルオロ酢酸での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、換気の良いフードで作業するときは、目の保護具、白衣、手袋を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。