ワイルド毛虫から血液細胞を抽出するための単純なプロトコル
2012年11月15日
昆虫血球は、昆虫開発のすべての段階を通して免疫および非免疫の両方の多くの重要な機能を、実施しています。血球の種類と機能の私達の現在の知識では、昆虫の遺伝的モデルに関する研究から得られている。ここでは、野生の毛虫から血球を定量化し、可視化、抽出するための方法を提示する。
この手順の全体的な目標は、野生の毛虫から細胞を抽出し、視覚化し、カウントすることです。これは、最初にキャタピラーを氷の上に置いて麻酔をかけ、抗凝固剤を含む緩衝液を注入し、キャタピラーを氷に戻して、抽出前に細胞が循環に戻るようにすることで達成されます。2番目のステップは、きれいなメスを使用して、キャタピラの後端に浅い切開を行うことです。
次に、柔らかい鉗子を使ってキャタピラを優しく絞ります。次に、緩衝液のヘモリンパミックスをマイクロピペットを使用して吸引し、マイクロ遠心チューブに収集します。最後のステップは、ヘモリンパ液を等量の緩衝液と穏やかに混合し、10マイクロリットルの溶液をヘモサイトメーターに移して、細胞の数を視覚化してカウントすることです。
最終的に、このヘモサイト抽出法は、さまざまな毛虫種からの細胞を数えるための迅速かつ効果的な方法として使用でき、昆虫の細胞性免疫応答の生理学的側面を調べるためのツールとして保存できます。この技術の主な利点は、非常に減少した近接で毛虫からヘモソットを抽出するために使用できることです。他のキャタピラーモデルは、プロの一人をカットして出血させ、出てくる液体から彼の細胞を抽出します。
さらに、この手法は、他の昆虫種から血液型を抽出するために使用できます。この方法は、昆虫の細胞性免疫応答が食事の質、発達段階、またはさまざまな病原体への曝露によってどのように変化するかなど、エコ免疫学の分野における重要な質問に答えるために使用できます。この手順を開始するには、ヘモサイト抽出の前に、最後から 2 番目の幼虫を氷の上で冷やして麻酔
をかけます。その後、きれいな16ゲージの毛細管針の鈍い端を、20ミリリットルのガラスシリンジに接続されているチューブに取り付けます。回収溶液の入ったチューブは、ラボベンチで開いたままにしておきます。キャピラリーに約10〜15マイクロリットルのバッファーをゆっくりと充填します。
次に、解剖顕微鏡の隣に置かれた粘土のボールに針を置きます。キャタピラーをペトリ皿に入れます。昆虫は、球形がはっきりと見えるように横向きに配置する必要があります。
解剖顕微鏡で観察しながら、一対の鉗子で毛虫を所定の位置に保持し、昆虫のキューティクルが一般的に柔らかい球形の1つに針を近づけます。次に、毛細血管の針を昆虫の体にそっと押し付けます。針がキューティクルを貫通したら、全量の溶液をキャタピラに注入します。
キャタピラーの体は注射後に腫れますが、破裂したりにじみ出したりしてはいけません。キャタピラーを氷のペトリ皿に戻します。緩衝液が傷口から漏れるのを防ぐために、昆虫を背側に置きます。
ヘモリンプ抽出に使用される各キャタピラーに対して注射を繰り返します。次に、すべての昆虫を氷の上で30分間冷やします。次に、キャタピラーを解剖顕微鏡下のシャーレに入れます。
腸や他の内臓を傷つけずに滅菌メスを使用して、毛虫の後部に約2〜3ミリメートルの長さの浅い切開を慎重に行います。次に、10マイクロリットルのピペットチップで約10〜20マイクロリットルのヘモリンプミックスを収集しながら、一対の柔軟なプラスチック鉗子を使用してキャタピラーを静かに絞ります。繰り返しになりますが、内部組織を傷つけないように注意してください。
その後、残った毛虫を捨てます。各キャタピラーからヘモリンプを別々のラベル付きシリコン処理された0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに集めます。.次に、個々のキャタピラーから採取した各ヘモリンプサンプルに約10〜20マイクロリットルのインキュベーション溶液を追加します。
このステップでは、血リンパサンプルを常に氷の上に置いてください。カウントの直前に血リンパサンプルとインキュベーション溶液を混合します。彼は細胞を動かします。
この処理により、細胞の適切な分離が可能になり、凝集を防ぐことができます。清潔なピペットチップを使用して、インキュベーション溶液と混合した10マイクロリットルのヘモリンパサンプルをヘモサイトメーターに移します。次に、複合顕微鏡を使用して、ヘモサイトメーターの中央グリッドの大きな正方形のうち少なくとも15の細胞の数をカウントし、記録します。
これらの値を加算して、15 個の正方形の血球数の合計を求めます。次に、ヘモサイトメーターとそのカバースライドを、蒸留水と脱イオン水を入れたウォッシュボトルを使用して完全にすすぎます。その後、キムワイプで乾拭きます。
残りのヘモリンプサンプルについても手順を繰り返し、各キャタピラーのヘモリンプボリューム1ミリリットルあたりの平均細胞数を計算します。明視野顕微鏡画像は、核ヒンアイキャタピラから抽出されたhe細胞を20倍の倍率で示しています。この手順に続いて、採取した血球を使用して細胞性免疫応答を研究し、食作用やキャップ、選択カプセル化、pHオキシダーゼ活性などのアッセイを設定することができます。
さらに、R-N-A-D-N-Aおよびタンパク質は、昆虫におけるこれらの細胞性免疫応答を研究するために、さらなるアッセイのために未使用に収集することができます。このビデオを見た後、血リンパを抽出する目的で毛虫を注射する方法と、生きた血球を含む血リンパを採取する方法についてよく理解しているはずです。
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概要
本記事では、野生のイモムシから血細胞を抽出、定量化、および可視化する方法を紹介します。血細胞は、昆虫の発育過程を通じて、免疫機能および非免疫機能の両方において重要な役割を果たしています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 昆虫免疫学
- 血球機能
- 発生生物学
背景
- 血球は昆虫の免疫応答において不可欠な役割を果たします。
- 血球の分化型を理解することは、昆虫生物学の研究に有用です。
- 現在の知見は主に遺伝子モデルに基づいています。
- 本研究では、既存の知見を拡大するため、野生のケムシに焦点を当てます。
研究目的
- 血球抽出のための信頼性の高い手法を開発すること。
- 血球を可視化し、その機能をより深く理解すること。
- 血球を定量し、昆虫の生理学における役割を評価すること。
使用方法
- 氷を用いてイモムシを麻酔させる。
- 抗凝固剤を含む緩衝液を注入する。
- 血球の抽出を容易にするため、浅い切開を加える。
- 血リンパを吸引し、解析用の緩衝液と混合させる。
主な結果
- 血球の抽出および可視化に成功した。
- 血球計数器を用いた血球の定量化。
- 野生のケムシにおける本手法の実現可能性を実証した。
- 血球の循環および機能に関する知見を提供した。
結論
- 本手法により、野生のケムシにおける血球の効率的な研究が可能になります。
- 昆虫の免疫応答に関する理解を深めることができます。
- 比較研究のために、他の昆虫種にも適用可能です。
よくある質問
業界における実用的な関連性
野生のケムシから血細胞を信頼性高く抽出および定量化することで、非モデル昆虫種における自然免疫メカニズムの研究が可能となり、昆虫免疫学における初期段階のターゲットバリデーションが促進されます。本プロトコルは、免疫細胞を分離するための標準化されたワークフローを提供し、トランスレーショナルリサーチやエコ免疫学に関連する比較研究および機能解析を容易にします。この手法により、免疫応答の特性評価における予測信頼性が向上し、昆虫モデルを用いた探索パイプラインにおけるリスク調整後の意思決定に寄与します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 非モデル種の昆虫免疫細胞の多様性と機能の解析を可能にする。
- メカニズム研究のための一次免疫細胞へのアクセスを提供することで、生物学的なリスク低減を支援する。
- 下流の免疫学的アッセイを通じて、機能的なターゲットの検証を促進する。
- 昆虫を用いた研究における免疫応答の仮説に対する予測の信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 定量および機能的な免疫アッセイ向けに、検証済みの血球サンプルを調製します。
- 細胞の抽出と計数を標準化し、実験間の再現性を向上させます。
- 病原体や化合物の影響をスクリーニングするための、血球のスケールアップ可能な調製を可能にします。
- アッセイの標準化および比較分析に必要な、信頼性の高い細胞数を提供します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 野生個体群における免疫プロファイリングを可能にすることで、エコイムノロジー（生態免疫学）研究と整合します。
- 野外での採取からラボベースの機能アッセイまでの連続性をサポートします。
- トランスレーショナルリサーチに向けた昆虫モデルのリスク調整済み導入を促進します。
- 免疫調節および病原体相互作用の研究において、メカニズムに基づくリスク低減（de-risking）を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この血球抽出プロトコルは、初期探索とアッセイ開発の接点に位置するものであり、野生昆虫モデルを用いた仮説駆動型の免疫細胞研究を可能にします。
- 探索生物学： 非モデル昆虫における免疫細胞の多様性と機能に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 後続の免疫アッセイに向けた、標準化された定量的な血球調製物を提供します。
- 解析： 条件間の免疫応答を比較するための細胞数および形態学的データを提供します。
- トランスレーショナル研究： 生態免疫学および比較研究において、フィールド採集と研究室での免疫プロファイリングを橋渡しします。
- エンタープライズ再利用： 様々な鱗翅目および関連昆虫種に適応可能な、再利用可能なプロトコルを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：免疫細胞研究における予測の信頼性を高め、昆虫免疫学におけるメカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：血球の抽出と計数を標準化し、再現性と拡張性のあるワークフローを実現します。
- 戦略的価値：昆虫ベースの免疫研究およびエコ免疫学のパイプラインにおいて、十分な根拠に基づいたGo/No-go判断を可能にします。
- ポートフォリオへの影響：機能研究およびトランスレーショナル研究に向けた、リスク調整済みの昆虫モデルの優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 昆虫の取り扱いおよびマイクロダイセクション技術の専門知識が必要です。
- 解剖顕微鏡、複合顕微鏡、血球計数器、および滅菌器具へのアクセスが必要です。
- サンプル収集および細胞計数プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 軽微な修正を加えることで、様々な鱗翅目および関連する昆虫種に適応可能です。
- サンプルの収量および細胞生存率は、種や発生段階によって異なる場合があります。
