ワイルド毛虫から血液細胞を抽出するための単純なプロトコル

この手順の全体的な目標は、野生の毛虫から細胞を抽出し、視覚化し、カウントすることです。これは、最初にキャタピラーを氷の上に置いて麻酔をかけ、抗凝固剤を含む緩衝液を注入し、キャタピラーを氷に戻して、抽出前に細胞が循環に戻るようにすることで達成されます。2番目のステップは、きれいなメスを使用して、キャタピラの後端に浅い切開を行うことです。

次に、柔らかい鉗子を使ってキャタピラを優しく絞ります。次に、緩衝液のヘモリンパミックスをマイクロピペットを使用して吸引し、マイクロ遠心チューブに収集します。最後のステップは、ヘモリンパ液を等量の緩衝液と穏やかに混合し、10マイクロリットルの溶液をヘモサイトメーターに移して、細胞の数を視覚化してカウントすることです。

最終的に、このヘモサイト抽出法は、さまざまな毛虫種からの細胞を数えるための迅速かつ効果的な方法として使用でき、昆虫の細胞性免疫応答の生理学的側面を調べるためのツールとして保存できます。この技術の主な利点は、非常に減少した近接で毛虫からヘモソットを抽出するために使用できることです。他のキャタピラーモデルは、プロの一人をカットして出血させ、出てくる液体から彼の細胞を抽出します。

さらに、この手法は、他の昆虫種から血液型を抽出するために使用できます。この方法は、昆虫の細胞性免疫応答が食事の質、発達段階、またはさまざまな病原体への曝露によってどのように変化するかなど、エコ免疫学の分野における重要な質問に答えるために使用できます。この手順を開始するには、ヘモサイト抽出の前に、最後から 2 番目の幼虫を氷の上で冷やして麻酔

その後、きれいな16ゲージの毛細管針の鈍い端を、20ミリリットルのガラスシリンジに接続されているチューブに取り付けます。回収溶液の入ったチューブは、ラボベンチで開いたままにしておきます。キャピラリーに約10〜15マイクロリットルのバッファーをゆっくりと充填します。

次に、解剖顕微鏡の隣に置かれた粘土のボールに針を置きます。キャタピラーをペトリ皿に入れます。昆虫は、球形がはっきりと見えるように横向きに配置する必要があります。

解剖顕微鏡で観察しながら、一対の鉗子で毛虫を所定の位置に保持し、昆虫のキューティクルが一般的に柔らかい球形の1つに針を近づけます。次に、毛細血管の針を昆虫の体にそっと押し付けます。針がキューティクルを貫通したら、全量の溶液をキャタピラに注入します。

キャタピラーの体は注射後に腫れますが、破裂したりにじみ出したりしてはいけません。キャタピラーを氷のペトリ皿に戻します。緩衝液が傷口から漏れるのを防ぐために、昆虫を背側に置きます。

ヘモリンプ抽出に使用される各キャタピラーに対して注射を繰り返します。次に、すべての昆虫を氷の上で30分間冷やします。次に、キャタピラーを解剖顕微鏡下のシャーレに入れます。

腸や他の内臓を傷つけずに滅菌メスを使用して、毛虫の後部に約2〜3ミリメートルの長さの浅い切開を慎重に行います。次に、10マイクロリットルのピペットチップで約10〜20マイクロリットルのヘモリンプミックスを収集しながら、一対の柔軟なプラスチック鉗子を使用してキャタピラーを静かに絞ります。繰り返しになりますが、内部組織を傷つけないように注意してください。

その後、残った毛虫を捨てます。各キャタピラーからヘモリンプを別々のラベル付きシリコン処理された0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに集めます。.次に、個々のキャタピラーから採取した各ヘモリンプサンプルに約10〜20マイクロリットルのインキュベーション溶液を追加します。

このステップでは、血リンパサンプルを常に氷の上に置いてください。カウントの直前に血リンパサンプルとインキュベーション溶液を混合します。彼は細胞を動かします。

この処理により、細胞の適切な分離が可能になり、凝集を防ぐことができます。清潔なピペットチップを使用して、インキュベーション溶液と混合した10マイクロリットルのヘモリンパサンプルをヘモサイトメーターに移します。次に、複合顕微鏡を使用して、ヘモサイトメーターの中央グリッドの大きな正方形のうち少なくとも15の細胞の数をカウントし、記録します。

これらの値を加算して、15 個の正方形の血球数の合計を求めます。次に、ヘモサイトメーターとそのカバースライドを、蒸留水と脱イオン水を入れたウォッシュボトルを使用して完全にすすぎます。その後、キムワイプで乾拭きます。

残りのヘモリンプサンプルについても手順を繰り返し、各キャタピラーのヘモリンプボリューム1ミリリットルあたりの平均細胞数を計算します。明視野顕微鏡画像は、核ヒンアイキャタピラから抽出されたhe細胞を20倍の倍率で示しています。この手順に続いて、採取した血球を使用して細胞性免疫応答を研究し、食作用やキャップ、選択カプセル化、pHオキシダーゼ活性などのアッセイを設定することができます。

さらに、R-N-A-D-N-Aおよびタンパク質は、昆虫におけるこれらの細胞性免疫応答を研究するために、さらなるアッセイのために未使用に収集することができます。このビデオを見た後、血リンパを抽出する目的で毛虫を注射する方法と、生きた血球を含む血リンパを採取する方法についてよく理解しているはずです。