ワイルド毛虫から血液細胞を抽出するための単純なプロトコル

本手順の全体的な目的は、野生のケムシから血球を抽出し、可視化して計測することです。まず、ケムシを氷上に置いて麻酔をかけ、抗凝固剤を含む緩衝液を注入し、再び氷上に戻して血球が循環系に再進入するのを待ってから抽出を行います。次のステップでは、清潔なメスを用いて、ケムシの後端に浅い切開を加えます。

次に、ソフト鉗子を用いて芋虫を静かに圧迫します。続いて、マイクロピペットを使用してバッファー溶液と血リンパ液の混合物を吸引し、マイクロ遠心チューブに回収します。最後のステップとして、血リンパ液を等量のバッファー溶液と静かに混ぜ合わせ、その溶液を10 µL、血球計数器（ヘモサイトメーター）に移し、血球を可視化して計数します。

最終的に、この血球抽出法は、さまざまなイモムシ種から血球を迅速かつ効果的に計数するための手法として、また、昆虫の細胞性免疫応答の生理学的側面を調べるためのツールとして活用できます。この手法の主な利点は、後部腹端を極めて短く切断したイモムシからも血球を抽出できる点にあります。他のイモムシモデルでは、前肢の1つを切断し、流出する液体から血球を抽出する出血法が行われています。

さらに、この手法は他の昆虫種から血球を抽出するためにも利用可能です。本法を用いることで、食事の質、発育段階、あるいは異なる病原体への曝露によって昆虫の細胞性免疫応答がどのように変化するかなど、エコ・イムノロジー（生態免疫学）分野における重要な疑問を明らかにすることができます。この手順を開始するには、血球抽出の20分前に、次前齢幼虫を氷上で冷却して麻酔させてください。

その後、清潔な16ゲージのキャピラリーニードルの鈍端を、20 mLガラスシリンジに接続されたチューブに装着します。回収溶液が入ったチューブは、実験台の上に開いたままにしておきます。キャピラリーに約10〜15 µLの緩衝液をゆっくりと満たします。

次に、解剖顕微鏡の横に配置した粘土の塊に針を固定します。キャタピラーをペトリ皿に入れます。球状体がはっきりと見えるように、昆虫を側向きに配置してください。

解剖顕微鏡で観察しながら、ピンセットでキャタピラーを固定し、昆虫のクチクラが一般的に柔らかい球形部位の近くに針を配置します。次に、毛細管針を昆虫の体にゆっくりと押し付けます。針がクチクラを貫通したら、溶液の全量をキャタピラーに注入します。

注入後、イモムシの体は膨らみますが、破裂したり液が漏れ出したりしてはいけません。イモムシを冷却したペトリ皿に戻します。バッファーが傷口から漏れ出さないよう、昆虫を背面側に向けた状態で配置してください。

血リンパ抽出に使用した各イモムシに対して、同様の注入を繰り返します。その後、すべての昆虫を氷上で30分間冷却させます。次に、イモムシをシャーレに入れ、解剖顕微鏡下に配置します。

滅菌済みのメスを用い、腸やその他の内臓を傷つけないように注意しながら、イモムシの後方に2〜3 mmの浅い切開を丁寧に入れます。次に、柔軟なプラスチック製ピンセットでイモムシを軽く絞りながら、10 µLのピペットチップで血リンパ混合液を約10〜20 µL回収します。ここでも、内部組織を傷つけないよう十分に注意してください。

その後、イモムシの死骸を廃棄します。個々のイモムシから採取したヘモリンフを、それぞれラベルを貼ったシリコン処理済みの0.5 milliliter マイクロ遠心チューブに回収します。次に、個々のイモムシから回収した各ヘモリンフサンプルに、インキュベーション溶液を約10 to 20 µL加えます。

このステップでは、血リンパ試料を常に氷上に保持してください。血球数を計測する直前に、血リンパ試料とインキュベーション溶液を混合します。

この処理により、血球の適切な分離が可能となり、凝集を防ぐことができます。清潔なピペットチップを用いて、インキュベーション溶液と混合した血リンパ液サンプル 10 µL をヘモサイトメーターに転送します。次に、複合顕微鏡を用いて、ヘモサイトメーターの中央格子の大きな正方形のうち、少なくとも15箇所にある血球数を計数し、記録します。

これらの値を合算し、15区画における血球数の総和を求めます。次に、蒸留脱イオン水を入れた洗浄ボトルを用いて、ヘモサイトメーターとそのカバーガラスを十分に洗浄します。その後、キムワイプで水気を拭き取ります。

残りのhemo limpサンプルに対して同様の手順を繰り返し、各イモムシにおけるhemo limp容量1 mLあたりのhe cytesの平均数を算出します。明視野顕微鏡像は、nucle hin aiイモムシから抽出したhe cytesを20倍の倍率で示したものです。この手順で回収したhe cytesは、細胞性免疫応答の研究や、食作用、cap、select encapsulation、pHオキシダーゼ活性などのアッセイの構築に使用できます。

さらに、昆虫におけるこれらの細胞性免疫応答を研究するために、RNA、DNA、およびタンパク質を回収して後続のアッセイに利用することができます。このビデオを視聴することで、血リンパを抽出するための毛虫への注入方法と、生存している血球を含む血リンパの回収方法について十分に理解できるはずです。