Name: ワイルド毛虫から血液細胞を抽出するための単純なプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶ、ワイルド毛虫から血液細胞を抽出・可視化・定量化する手法。抗凝固剤入りバッファー注入、切開、吸引の手順で、昆虫の免疫応答と生理機能を研究するための迅速かつ効果的な方法です。

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TMSは、この研究の間にハーラン·トラスト·フェローシップ（GWU）によってサポートされていました。フィールドコレクションと繁殖L.のための資金蛭とE. delphiniiは JTLにNSFの助成DEB 0642438によって提供されました。

1。材料の準備<ol><li>ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブとマイクロピペットプラーを使用して針（1-2μmの先端と3〜4mmのテーパー）を準備します。機器設定：ランプ：561;速度：20;熱：560;ディレイ：1;プル：100;圧力：500。 </li><li>ウシ胎児血清（FBS）の10％および抗凝固バッファの20％（98 mMのNaOHを用い、186のNaCl、1.7mMのEDTAおよび41 mMクエン酸、pH 4.5を補ったグレース培地（GM）の60％捕集溶液を調製）。上記溶液を滅菌条件下で新たに調製し、常に氷上に維持されています。 </li><li> GMの90％FBSを10％ウシ：インキュベーション緩衝液を準備します。このソリューションは、新たに調製し、常に氷上に維持されています。 </li><li>少なくとも15μlの合計×収集·インキュベーション·ソリューションの両方の昆虫の数を準備します。 </li></ol> 2。コレクション·ソリューションとの毛虫の注入<ol><li>最後から二番目のプラグを麻酔血球抽出に先立って20分間氷上でそれらを冷却することによりタールの幼虫。 </li><li> 20ミリリットルのガラス製注射器（ 図2）に接続されているチューブにきれいな毛管針（16ゲージ）の鈍端を取り付けます。収集ソリューションは、ラボ·ベンチで開いて、ゆっくりと緩衝液を用いてキャピラリーを埋める入ったチューブのままにしておきます。毛細血管は、通常毛虫のサイズに応じて、収集ソリューションの約10〜15μlで満たされている（毛虫合計体重の10 mg当たり約1μlの溶液=総体重の0.01％）。解剖顕微鏡の横に配置された粘土のボールの上に針を置きます。 </li><li>ペトリ皿に毛虫を置きます。昆虫は、気門が（ 図3）はっきりと見えるように、その側に配置されるべきである。 </li><li>解剖顕微鏡で見ながら、ピンセットで所定の位置に毛虫を保持し、気門の1つに針の近くに配置する場所で宗派のキューティクルは、一般的に軟質である。優しく昆虫の身体に対してキャピラリーニードルを押してください。針がキューティクルに浸透した後は、キャタピラ（ 図3）に溶液の全体積を注入します。毛虫に気泡を注入避けることが重要である。毛虫の体は注射後（ 例えば 、20％の体積の増加）膨潤するが、破裂したり、にじみ出るべきではありません。 </li><li>傷（ 図3）から漏れるのを防ぐためにバッファ背虫を配置し、氷に毛虫を返します。 </li><li>体液の抽出に使用される各毛虫の手順2.1から2.4を繰り返します。この段階では、すべての昆虫が進む前に、30分間氷上で冷却することができます。 </li></ol> 3。血液細胞の抽出<ol><li>解剖顕微鏡下でシャーレに毛虫を置きます。 </li><li>無菌scalpeを使用して毛虫の臼歯部では浅い（2-3 mm長）を切開する<html> L（ 図3）。腸や他の臓器に損傷を与えないように注意してください。目標は慎重に穿刺にキューティクルであり、個々の昆虫から血球を含有する緩衝液/血リンパミックスを収集します。 </li><li> 10μlのピペットチップで体液ミックス（約10〜20μl）を収集しながら、再び内部の組織（ 図3）を傷つけないように注意しながら、柔軟なプラスチック製のピンセットを使って静かに毛虫を絞る。血リンパは毛虫の体から搾り液滴から収集されます。毛虫の遺体を捨ててください。 </li><li>別のラベルの付いたシリコーン処理、0.5mlのマイクロ遠心チューブに、個々の毛虫から体液を採取します。 </li><li>個々の毛虫から収集された各体液試料にインキュベーション溶液の等量（約10〜20μl）を追加します。すべての回で氷の上に体液サンプルを保管してください。 </li><li>実験に用いた各毛虫の手順3.1から3.5を繰り返します。 </li></ol>血液細胞の定量LE &quot;&gt; 4。 <ol><li>体液試料および血球計数直前に培養液を混ぜる。この治療法は、血球の適切な分離を可能にし、凝集を防ぐことができます。 </li><li>血球計算板の上に、インキュベーション溶液と混合体液サンプル10μlを転送するためにクリーンなピペットチップを使用しています。 </li><li>血球計算板の中央グリッド（ 図3）の化合物の顕微鏡を使用して、大きい正方形（0.1ミリメートル：0.04ミリメートル2、深さが1の正方形の面積）の少なくとも15の血球の数をカウントし、記録します。 15正方形の血球数の総和を得るためにこれらの値を追加します。 </li><li>徹底的に蒸留、脱イオン水で洗浄瓶を用いて血球計算板とカバーのスライドを洗浄し、各サンプル間キムワイプ（キンバリークラーク）で拭いて乾かしてください。 </li><li>各体液サンプルについてステップ4.1から4.4を繰り返します。 </li><li>血リンパvolumのmlあたり血球の平均数を計算次のように各毛虫のe、： </li></ol>血球計算グリッドの各四角形の総容積：（0.04 mm 2の面積）×（0.1ミリメートルの深さ）= 0.004ミリメートル3×15乗= 0.06ミリメートル3全15カウントの正方形=総量。 （全15カウントの正方形/総量カウント15の正方形の血球の総数の合計）×2希釈係数=血球/ mm 3の数×1,000 =血球/体液のミリリットル数。

<ol><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).</li>
<li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes%3A+masters+of+multitasking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542(2007).</li>
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<li>Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+in+lepidopteran+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunity in lepidopteran insects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181(2010).</li>
<li>Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmatocyte-spreading+peptide+%28PSP%29+plays+a+central+role+in+insect+cellular+immune+defenses+against+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection.</a> J. Exp. Biol. 212 (12), 1840(2009).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehélin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+what+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: what type of cell is that.</a> J. Insect Physiol. 52 (5), 417(2006).</li>
<li>Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+larval+and+pupal+hemocytes+of+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%2C+determined+by+monoclonal+antibodies+and+density+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation.</a> J. Insect Physiol. 50 (9), 805(2004).</li>
<li>Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+hemocyte+counts+with+different+developmental+parameters+during+the+last+larval+instar+of+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63(2008).</li>
<li>Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects%2C+nematodes+and+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695(2010).</li>
<li>Qayum, A. A., Telang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+Collecting+and+Staining+Hemocytes+from+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti.</a> J. Vis. Exp. (51), e2772(2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

医学的に重要な昆虫や鱗翅目昆虫のモデルから血球を抽出するための方法は、以前に9、14が報告されている。血球抽出方法は、昆虫種によると、昆虫とその形態学的特徴の発達段階に適応している。たとえば、 マンドゥカの幼虫体液から分離は容易に腹部15の端の近くに湾曲した角を切り取ることによって行うことができる。ナメクジの幼虫（Limacodidae）この腹部構造を欠いているため、我々は、小型のフィールド収集幼虫から体液を抽出するための異なったプロトコルを開発してきました。この方法はさらに、実験のために保存したり、処理することができる血球多数の細胞を含む十分な血リンパボリュームを分離するための効率的な証明している。また、蚊の成虫から血球コレクションは足、翼と腹部16の先端を慎重に除去を含む時間のかかる工程を含む</suP&gt;。同様のステップは、我々のプロトコルでは必須ではありません、従ってスラグ毛虫から血球の分離は簡単かつ迅速なプロセスです。私たちの技術のような制限があり、1）すべての血球抽出法と同様に、昆虫は、アッセイの日に犠牲にしなければ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> P-1000 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス管</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> B100-50から10 </td><td>外径：1.0、ID：0.50ミリメートル</td></tr><tr><td>グレース培地</td><td>シグマ</td><td> G8142 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH3007102 </td><td>不活性化された熱</td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11252から40 </td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー血球計数器</td><td> Hausser科学</td><td> 3200 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチックtubiNG </td><td>トライテック</td><td> TT-3-32OD </td><td>外径：3/32&#39;&#39;、番号：1/32 &#39; </td></tr><tr><td>ガラス医療シリンジ</td><td>フォルトゥナ·オプティマ</td><td> D-97877 </td><td> 50mlの体積</td></tr><tr><td>平滑末端針</td><td>小型部品</td><td> NE-162PL-25 </td><td> 16ゲージ×1 &quot;長さ</td></tr></tbody></table>

ワイルド毛虫から血液細胞を抽出するための単純なプロトコル

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

昆虫血球は（哺乳類白血球に相当）昆虫のライフサイクル全体で1いくつかの生理学的過程において重要な役割を果たしている。鱗翅目（蛾や蝶）や双翅目（ハエ真）の受注に属する昆虫の幼虫の段階では、血球はリンパ腺（専門造血器官）や胚細胞から形成され、大人の段階まで行うことができる。胚性血球細胞は、炎症時の開発および走化性調節における細胞遊走に関与している。彼らはまた、細胞のアポトーシスに参加し、胚発生に必須である2。血球は、細胞拡散、細胞凝集、結節の形成、食作用および外国の侵略者3のカプセル化などのいくつかの機能を含む昆虫自然免疫応答の細胞アームを仲介する。彼らは、広報など、また、感染時に特定の昆虫の体液性防御をオーケストレーションするための責任がある抗菌ペプチドおよび他のエフェクター分子4,5のoduction。血球形態と機能は、主にショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエ 6,7、蚊ネッタイシマカやハマダラカ 8,9とスズメガの幼虫、 たばこスズメガ 10、11を含む、遺伝的または生理学的な昆虫モデルで研究されてきた。しかし、少しの情報は、現在野生の12から収集されたもの、特に、非モデル昆虫種の血球の多様性、分類、形態と機能について存在する。 ここでは、野生の毛虫から血球を抽出するためのシンプルで効率的なプロトコルを記述します。我々は最後から二番目の齢Lithacodes蛭 （黄色肩幅のスラグ蛾）（ 図1）とEuclea delphinii（とげのオーク·スラグ）幼虫（鱗翅目：Limacodidae）を使用し、体液の十分なボリューム（昆虫血液）を表示単離され、血球の数値は個々の幼虫からカウントすることができます。この方法は効率的にこれらの種においてだけでなく、フィールドから収穫他の関連する鱗翅目の幼虫における血球の種類を研究するために使用することも、容易に微生物や寄生生物13感染後血球機能を調査するために設計された免疫学的測定法と組み合わせることができます。

本明細書中で説明されたプロトコルは、個々の幼虫から昆虫体液の10〜20μlの最小体積の収集を可能にします。このメソッドを使用して収集血球は細胞凝集、メラニンの欠陥、組織片などの汚れから保護されています。したがって血球は容易に顕微鏡下で観察し、計数することができ、いくつかの昆虫が少ないホスール内で観察することができます。私たちは、サンプル中の血球の大部分はplasmatocytes 3（血球が非対称的に広がって）（ 図4）から成っていたことを観察した。我々は現在、（Stoepler ら 、未発表データ）は詳細にこれらの毛虫で見つかった別の血 ​​球タイプを特徴付けるされています。ここで説明する方法は、フィールド実験から収集された個々の幼虫の総血球数をカウントするための迅速かつ正確な手段を提供します。 血球密度は1〜昆虫種内大幅に異なりますが&lt;/&gt;をSUP、我々が発見したLの血球数値肝蛭の幼虫の1.10×10 6...

昆虫血球は、昆虫開発のすべての段階を通して免疫および非免疫の両方の多くの重要な機能を、実施しています。血球の種類と機能の私達の現在の知識では、昆虫の遺伝的モデルに関する研究から得られている。ここでは、野生の毛虫から血球を定量化し、可視化、抽出するための方法を提示する。

昆虫の血球（哺乳類の白血球に相当）は、昆虫のライフサイクル全体を通じて、いくつかの生理的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。

この手順の全体的な目的は、野生のケムシから血球を抽出、可視化し、計数することです。まず、ケムシを氷の上に置いて麻酔をかけ、抗凝固剤を含む緩衝液を注入した後、抽出前に血球が再び循環系に戻るようにケムシを氷の上に置くことでこれを達成します。次のステップでは、清潔なメスを使用してケムシの後端に浅い切開を加えます。次に、柔らかいピンセットを用いて、イモムシを優しく絞ります。その後、マイクロピペットを用いて緩衝液と血リンパ液の混合物を吸引し、マイクロ遠心チューブに回収します。最後に、血リンパ液を等量の緩衝液で静かに混合し、その溶液を10 µL、ヘモサイトメーターに移して、血球を可視化し、その数を計測します。最終的に、この血球抽出法は、さまざまなイモムシ種の血球数を迅速かつ効果的に測定する方法として、また昆虫の細胞性免疫応答の生理学的側面を調べるためのツールとして活用できます。本手法の主な利点は、前胸背板が非常に小さいイモムシからも血球を抽出できることです。他のイモムシモデルでは、前胸背板のいずれかを切断して出血させ、流出した液体から血球を抽出します。さらに、この手法は他の昆虫種から血球を抽出するためにも利用可能です。本手法を用いることで、食事の質、発生段階、あるいは異なる病原体への曝露によって昆虫の細胞性免疫応答がどのように変化するかなど、エコイムノロジー（生態免疫学）分野における重要な疑問を明らかにすることができます。本手順を開始するには、血球抽出の20分前に、氷上で冷却して次々回齢幼虫を麻酔してください。その後、清潔な16ゲージのキャピラリーニードルの鈍端を、20 milliliterのガラスシリンジに接続されたチューブに装着します。回収溶液の入ったチューブは、ラボベンチの上に開いたままにしておきます。キャピラリーに約10 to 15 µLのバッファーをゆっくりと満たします。その後、解剖顕微鏡の横に配置した粘土の塊の上に針を固定します。イモムシをペトリ皿に入れます。球形構造がはっきりと見えるように、昆虫を横向きに配置してください。解剖顕微鏡で観察しながら、ピンセットでイモムシを固定し、昆虫のクチクラが一般的に柔らかい球状の部分の近くに針を配置します。次に、毛細管針を昆虫の体にそっと押し当てます。針がクチクラを貫通したら、溶液の全量をイモムシに注入します。注入後、イモムシの体は膨らみますが、破裂したり液が漏れ出したりしてはいけません。イモムシを冷却したペトリ皿に戻します。緩衝液が傷口から漏れ出すのを防ぐため、昆虫を背側にして配置してください。hemo limp抽出に使用した各イモムシに対して、同様に注入を繰り返します。その後、すべての昆虫を氷上で30分間冷却します。次に、イモムシをシャーレに入れ、解剖顕微鏡下に配置します。滅菌済みのメスを用い、腸やその他の内部器官を傷つけないよう注意しながら、イモムシの後方領域に2〜3 mm程度の浅い切開を加えます。次に、柔軟なプラスチック製ピンセットでイモムシを軽く絞りながら、10 µLのピペットチップを用いて血リンパ混合液を約10〜20 µL回収します。ここでも、内部組織を傷つけないよう注意してください。その後、イモムシの死骸を廃棄します。各イモムシから採取したヘモリンフを、個別にラベルを貼ったシリコン処理済みの0.5 milliliterマイクロ遠心チューブに回収します。次に、個々のイモムシから回収した各ヘモリンフサンプルに、インキュベーション溶液を約10 to 20 microliters加えます。このステップでは、血リンパサンプルを常に氷上で保持してください。血球数を計測する直前に、血リンパサンプルとインキュベーション溶液を混合してください。この処理により、血球が適切に分離され、凝集が防止されます。清潔なピペットチップを使用して、インキュベーション溶液と混合した血リンパサンプル10 µLをヘモサイトメーターに分注します。次に、光学顕微鏡を用いて、ヘモサイトメーターの中央グリッドにある大きな正方形のうち、少なくとも15箇所の血球数を計測し、記録します。これらの値を合算し、15区画における血球数の総和を求めます。次に、蒸留脱イオン水の洗浄ボトルを用いて、血球計数器とそのカバーガラスを十分に洗浄します。その後、キムワイプで水分を拭き取ります。残りのhemo limpサンプルの手順を繰り返し、イモムシごとのhemo limp体積1mLあたりのhe cytesの平均数を算出します。明視野顕微鏡画像は、nucle hin aiイモムシから抽出したhe cytesを20倍で拡大したものです。この手順に従って回収したhe cytesは、細胞性免疫応答の研究や、食作用、cap、選択的封入、pHオキシダーゼ活性などのアッセイのセットアップに使用できます。さらに、昆虫におけるこれらの細胞性免疫応答を研究するために、未使用のRNA、DNA、およびタンパク質を回収してさらなるアッセイに使用することができます。このビデオを視聴することで、血リンパを抽出するための毛虫への注射方法と、生存している血球を含む血リンパの回収方法について十分に理解できるはずです。

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生物学

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ハワイのボブテイルイカから血球の入手 Euprymna scolopesと共生と非共生細菌への遵守を観察

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黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ</em

このビデオでは、ハエの幼虫の造血の主要な部位であるショウジョウバエのリンパ腺について説明し、免疫組織化学と蛍光イメージングのために臓器を解剖してマウントするプロトコルの例を示しています。...

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造血ポケットへの血球再接着を評価するための血球障害アッセイ

ショウジョウバエの血液細胞、または血球は、常駐部位と循環の間を循環します。 幼虫では、常在性(固着性)血球は誘導性微小環境である造血ポケットに局在し、循環血球は血リンパ液中を自由に動きます。このプロトコルの目標は、これら 2...

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ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血系は、 ショウジョウバエの造血を研究するための魅力的な遺伝モデル作り、多くの共通の特徴を共有します。ここでは、免疫組織化学のための主要な幼虫の造血器官の解剖と取り付けを示しています。また、循環血球と固着液晶セルを含む様々な幼虫の造血コンパートメントをアッセイする方法を記載しています。...

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