Name: 幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学ぶBLTヒト化マウスを用いた幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデル構築法。ヒト胸腺組織と遺伝子修飾造血幹細胞を免疫不全マウスに移植し、抗腫瘍免疫応答をin vivoで評価する革新的な技術です。

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我々は彼らの技術支援のためにアルビン·ウェルチとラリー激痛に感謝したいと思います。 CIRM新学部賞RN2-00902から1。この作品は、米国国立衛生研究所（NIH）賞P50 CA086306、カリフォルニア再生医療研究所（CIRM）助成RC1-00149から1とRS1-00203-1によって一部で賄われていたトランスレーショナル医学のために、カリフォルニア工科大学、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）の共同センター、エイズ研究（CFAR）NIH / NIAID AI028697、UCLAのエイズ研究所、CIRMツールと技術賞RT1-01126、およびUC Multicampus研究プログラムとカリフォルニアからの取り組みのためのUCLAのセンター抗ウイルス薬の発見のためのセンター（番号MRPI-143226）。

<ol><li>McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCID-hu+mouse%3A+murine+model+for+the+analysis+of+human+hematolymphoid+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function.</a> Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).</li>
<li>Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+maintenance+of+SCID-hu+mice+for+HIV+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research.</a> Methods. 12 (4), 343-347 (1997).</li>
<li>Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+functional+human+immune+system+to+mice+with+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency.</a> Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).</li>
<li>Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li>
<li>Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+pre-exposure+prophylaxis+prevents+vaginal+transmission+of+HIV-1+in+humanized+BLT+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice.</a> PLoS Med. 5 (1), e16(2008).</li>
<li>Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarectal+transmission%2C+systemic+infection%2C+and+CD4%2B+T+cell+depletion+in+humanized+mice+infected+with+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1.</a> J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).</li>
<li>Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li>
<li>V, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+HIV+Latency+in+Humanized+BLT+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice.</a> J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).</li>
<li>Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+from+antigen-specific+CD8+T+cells+generated+in+vivo+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

生体 PETイメージングでと相まって修正BLTヒト化マウスモデルは、慢性的なヒトの疾患を研究するための強力なツールです。このシステムは、BLTのマウスモデルとHIV研究のための限られた範囲を超えて進歩それを取る。また、それは彼らが臨床の現場に到達する前に、我々は様々な遺伝子治療プロトコールならびに診断技術を調べることができる素晴らしいシステムです。マウス対霊長類を用いた低コストと相まって、後者はこの非常に有用なモデルとなる。 PETイメージング技術は、我々のアプローチの有効性を評価することができました。我々は、腫瘍の物理的な測定にもっぱら依存していた場合、我々はトランスジェニックT細胞によって生成された抗腫瘍反応の効力を過小評価してきたと思います。広範な瘢痕化および壊死組織は現実に死んだ組織であった大きな腫瘍の外観を与えた。 結論では、変更されたBLTマウスmの効用odelは、他の疾患モデルに拡張することができます。いくつかの欠点がまだそのようなマウスの短い寿命として存続するが、これは<...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> A1049101 </td><td></td></tr><tr><td>イスコフ</td><td></td><td> 12440061 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td></td><td> 16000085 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプIV </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td></td><td> H3506 </td><td></td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 10104159001 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> Piptazo（ゾシン） </td><td>ファイザー</td><td></td><td> <a href="http://labeling.pfizer.com/showlabeling.aspx?id=416" target="_blank">ピペラシリン/タゾバクタムの組み合わせ</a> </td></tr><tr><td>フィコール（のFicoll-Paqueプラス） </td><td> GEヘルスケア·ライフサイエンス</td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> MACSバッファー</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td>コメントを参照してください</td><td> MACSバッファー：0.5％ウシ胎児血清および2 mMクエン酸デキストロース式-添加PBS </td></tr><tr><td> CD34マイクロビーズキット</td><td></td><td> 130-046-702 </td><td></td></tr><tr><td> LSの列</td><td></td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td>レトロネクチン</td><td>タカラ</td><td> T100A </td><td></td></tr><tr><td&gt;マトリゲル</td><td> BD Biosciences社</td><td> 354263 </td><td></td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>バクスター</td><td></td><td> <a href="http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html" target="_blank">http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html</a> </td></tr><tr><td>カルプロフェン（Rimadyl） </td><td>ファイザーアニマルヘルス</td><td></td><td> <a href="https://www.rimadyl.com/default.aspx" target="_blank">https://www.rimadyl.com/default.aspx</a> </td></tr></tbody></table>

幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてbltヒト化マウスを用いた

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

マウスなどの小動物モデルは広範囲にヒトの疾患を研究するために、新しい治療介入を開発するために使用されている。これらの研究から得られた豊富な情報にもかかわらず、マウスの免疫ならびに、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症などのウイルス性疾患の種特異性のユニークな特性は、ヒト化マウスモデルの開発につながった。以前のモデルは、C、B 17のscid / scidマウスと呼ばれるヒト胎児胸腺および胎児肝臓の移植の使用を必要となた/ LIV（SCID-huの）1、2またはヒト末梢血白血球の養子移植不全（SCID-huPBL 2）3。両方のモデルは、主にHIV感染の研究のために利用された。 これらのモデルの両方の主な制限の一つは、HIV感染症を研究するための、より生理学的に適切なモデルを作るために周囲の人間の免疫細胞の安定な再構成の欠如だった。この目的を達成するために、BLTハムanizedマウスモデルが開発されました。 BLTは骨髄/肝臓/胸腺の略です。このモデルでは、6から8週齢NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ（NSG）は、免疫不全マウスにのみ第二のヒト造血幹細胞移植4が続くことに、SCID-huマウスモデルのように、なた/ LIVインプラントを受ける。このシステムの利点は、周囲の人間の免疫システムの完全な再構成である。このモデルは、HIV感染とレイテンシ5-8を研究するために使用されています。 私達は私達が自家hHSC 7,9形質導入の注入が続くなた/ LIVインプラントを構築するために遺伝子改変されたヒト造血幹細胞（hHSC）を使用したこのモデルの修正版を作成した。このアプローチでは、遺伝的に修飾された系統の生成をもたらす。さらに重要なことは、我々は、メラノーマ特異的T細胞受容体を発現している機能的な細胞傷害性T細胞（CTL）を生成する可能性を調べるために、このシステムを適応。このモデルを用いて、我々は、腫瘍退縮（9）を決定するために、ライブの陽電子放射断層撮影（PET）イメージングを活用したトランスジェニックCTLの機能を評価することができました。 このプロトコルの目的は、これらのトランスジェニックマウスを作製し、ライブのPETイメージングを用いたin vivoでの有効性の評価のプロセスを記述することである。我々はヒト組織およびレンチウイルスベクターを使用するので、注意点としては、、私たちの施設は特別な予防措置（BSL2 +）のバイオセーフティーレベル2（BSL2）のCDC、NIHのガイドラインに準拠しています。また、NSGマウスは厳しくこうして免疫不全、彼らの住宅とメンテナンスが最も高い衛生基準（に準拠している必要があり<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a> ）。

移植のプロセスのフローチャートを図1Aに示されています。なた/ LIVインプラントの写真を図1Bに示されている。胸腺組織は、通常、開発、ヒトCD4とCD8 T細胞の生理的な分布を持っています。再構成後、動物は、CD4、CD8 T細胞などの免疫細胞系譜の正規分布とヒトの免疫システムを運ぶ。 腫瘍の大きさや生きている組織との間の不一致は、 図2に示されている。 CTスキャン（グレーの領域）が大きい腫瘍の成長を示しているが、 生体内でのPETイメージングは、それは主に壊死、瘢痕組織（ 図2）であることを示した。これは、腫瘍の退縮とクリアランスを評価するためのより高感度かつ正確な方法としてPETイメージングの有用性を強調している。 <img src="/files/ftp_upload/4181/4181fi...

ヒト化マウスを用いた腫瘍特異的T細胞の生成および特徴付けは、ここで説明されます。ヒト胸腺組織、遺伝子組み換えヒト造血幹細胞を免疫不全マウスに移植されています。抗腫瘍免疫応答の生体観察を可能に設計されたヒト免疫系の再構成でこの結果。

幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

マウスなどの小動物モデルは、ヒトの疾患の研究や新たな治療介入法の開発に幅広く利用されてきました。それらの豊富な成果にもかかわらず、...

本実験の全体的な目的は、構築されたヒト免疫系を持つマウスを作製することです。これはまず、マウスを手術に向けて準備し、次にトロッカーに胸腺の一部を装填することで達成されます。MatrigelをCD 34陰性およびCD 34陽性の導入細胞と混合し、その混合物をトロッカーに注入します。次に、マトリゼルの構築物を腎被膜下に移植します。最終的に、遺伝子組み換えCD8 T細胞による標的腫瘍の拒絶反応を、生体PETイメージングおよび腫瘍の物理的測定によってモニタリングできます。完全なニューロンモデルのような既存の手法と比較した本手法の主な利点は、ヒト胸腺内での遺伝子改変ヒト幹細胞の分化を研究でき、その後、分化した系統のin vivoでの有効性試験が可能になる点です。なお、本手順の演示を行うのは、当研究室の技術者であるGregory Bristol、Bernard Levin、およびSean Kimの3名です。この概略図では、mart1特異的T細胞を保有するキメラマウスを作製するために、本研究で使用した改変BLTモデルの概要を示しています。胸腺インプラントは、自家胎児肝から単離した形質導入済みおよび未導入のCD34細胞から再構成されます。その後、形質導入された細胞の一部を凍結し、4〜6週間後に照射したマウスに注入します。このビデオでは、麻酔により動物が不活発になった後、th生体構築物を植え込む手順を実演します。まず、各マウスの左側を、背中の中心から腹部にかけて、腰から肩まで除毛します。各個体の体重を記録した後、耳にパンチ穴を開けて個体番号を付け、各個体の肩にカルプロフェン0.3 millilitersを皮下注射します。次に、マウスを左向きに右側を下にして寝かせます。16ゲージの先端が丸いファイルチップ付きがん移植用針のトロカーをPBSでフラッシュします。先細鉗子を使用して、胸腺の一片をPBSの入ったディッシュに加え、その後、ロッドを用いてトロカーを水平に保持します。チップの先端のすぐ内側で組織を吸引します。腎被膜の下にトロカーを滑り込ませて組織を注入する工程は、この処置において最も困難な部分の一つです。次に、助手の協力を得てください。エンドまたはオーフのポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、5 µLの冷却済みMatrigelを細胞が入ったチューブに加え、緩やかに撹拌して混合します。トロカーを水平に保ちながら、助手がMatrigelをピペッティングする間に、ロッドをゆっくりと後方に引きます。各マウスのトロッカーに混合します。まず、動物の露出した皮膚をベタダインでスワブし、次にイソプロパノールワイプで拭き取ります。皮膚の下で最も色の濃い部分を2回確認し、脾臓の位置を特定します。鈍端ピンセットで腎臓上の皮膚をつまみ上げ、脾臓から背側に約5 mmの位置にある腎臓を確認します。脾臓と平行に、皮膚を約15 mmの長さで切開します。その下の腹膜筋層においても、同様に切開を行います。オスでは、腎臓が直接視認できるはずです。腹部を軽く押して、腎臓を押し出してください。メスでは、左手で腹部を圧迫して腎臓を露出させたままにし、まず止血鉗子で卵巣を把持し、次に腎臓を外に引き出して、臓器を体外に保持しやすくします。腎被膜の後端に小さな穴を開け、そこにトロッカーを挿入して、トロッカーの開口部が完全に腎被膜で覆われるまで腎臓に沿ってスライドさせます。次に、右手の小指を使用して組織を注入します。最後に、閉じた止血鉗子を用いて、腎臓をゆっくりと元の位置に戻します。腹膜をダブルボウ結びで1針縫い、巾着のように皮膚を絞った後、2箇所の創傷クリップで固定します。最後に、各眼にPBSを1滴滴下し、マウスをケージ内の床材の上に横向きに寝かせます。すべてのマウスに同様に移植した後、動物が腹臥位に戻ったことを確認してから離れます。この最初の図は、ヒト化マウスにおけるTHI生体移植の代表的な画像を示しています。この図では、胸腺組織の正常な発達と、ヒトCD4陽性およびCD8陽性T細胞の生理的な組織分布が実証されています。再構築後、動物はCD4陽性およびCD8陽性T細胞が正常に分布したヒト免疫系を保持しています。メラノーマ腫瘍を担有するマウスの代表的な画像を図に示します。灰色の領域はCTスキャン画像を示しています。色の付いた領域は、PETスキャンによって検出された腫瘍の代謝活性を示しています。本実験において、CTスキャンのみでは白色の円で示された領域に大きな腫瘍塊があることが示されました。しかし、in vivo PETイメージングで示されているように、この領域の大部分は壊死組織と瘢痕組織で構成されており、腫瘍の退縮と消失を評価する上で、PETイメージングがより感度が高く正確な方法であることが強調されました。本手順の後、T細胞の機能に関する疑問を解決するために、T細胞のフェノタイピングやex vivo活性化などの他のアッセイを実施することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、機能的なヒト免疫システムと安定した生着したヒト様腸内細菌叢を持つ二重ヒト化骨BLT(骨髄、肝臓、胸腺)マウスを生成する方法を示しています。...

二重ヒト化BLT(骨髄、肝臓、胸腺)マウスモデルの生成

このプロトコルは、HIV感染に対する幹細胞ベースの操作免疫を持つヒト化骨髄/肝臓/胸腺マウスモデルを構築する方法を説明しています。...

ヒト化マウスモデルにおけるHIV感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ

ここでは、未熟で拡張可能なヒト肝幹細胞の移植後にAlb-toxin receptor mediated cell...

ヒト肝幹細胞を用いたヒト化マウス肝臓の生成

幹細胞は、その固有の腫瘍指向性のために脳腫瘍を治療するための有望な治療キャリアである。非侵襲性の鼻腔内幹細胞送達は、血液脳関門を迂回し、臨床翻訳の可能性を示す。この記事では、神経膠腫のマウスモデルにおける鼻腔内幹細胞送達の基本原理を要約する。...

マウスモデルにおける膠芽細胞腫に対する治療用幹細胞の鼻腔内送達

同所性同種人間原発性脳腫瘍を運ぶ免疫不全マウスにおける準備と同種の人間のリンパ球の脳定位固定装置の管理のためのプロトコルを紹介します。本研究は、実現可能性と intrabrain...

同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送

機能的なヒト免疫系と安定なヒト様腸内微生物叢を特徴とする二重ヒト化BLTマウスを生成する新しい方法について述べた。このプロトコルは、無菌マウスまたはグノトバイオティック施設を必要とせずに従うことができる。...

安定したヒト様腸内微生物叢とヒト免疫系を特徴とする二重ヒト化BLTマウスモデル

このプロトコルは、免疫腫瘍学研究のためのヒト免疫系(HIS)マウスの生成について概説しています。このモデルに移植されたヒト腫瘍に対するヒト免疫療法を試験するためのこのモデルの使用における指示および考慮事項は、腫瘍に対するヒト免疫系の応答を特徴付けることに重点を置いたものとして提示されている。...

ヒト腫瘍を有するヒト化マウスモデルにおける癌免疫療法の試験

免疫療法試験には、一般的な患者の変異によって駆動される免疫能のある自家腫瘍モデルを前臨床試験に利用することが不可欠です。従ってこのプロトコルは共通の忍耐強い突然変異を表すプラスミッドDNAのelectroporationベースの配達を使用して脳腫瘍マウス モデルを発生させる方法を記述し、正確で、再生可能で、一貫したマウス モデルを提供する。...

患者の突然変異シグネチャーを表すプラスミドDNAのエレクトロポレーションベースの送達を使用した in vivo での脳腫瘍のモデリング

このプロトコルの目的は、研究者に頭蓋内移植のための再現性の高い技術を提供することです。...

マウスにおける膠芽腫患者由来異種移植細胞株の立体定位頭蓋内移植

の世代のための迅速、簡単かつコスト効率の良いプロトコルドナー由来のCMV、前売またはEBV感染症を発症する危険性がある同種造血幹細胞移植（HSCT）の受信者に注入するためmultivirus特異的CTL（rctlを）。この製造プロセスはGMPに準拠しており、専門センターを超えてT細胞免疫療法の広範な実施を確保すべきである。...

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

学ぶBLTヒト化マウスを用いた幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデル構築法。ヒト胸腺組織と遺伝子修飾造血幹細胞を免疫不全マウスに移植し、抗腫瘍免疫応答をin vivoで評価する革新的な技術です。

幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

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