幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

ヒト化マウスを用いた腫瘍特異的T細胞の生成および特徴付けは、ここで説明されます。ヒト胸腺組織、遺伝子組み換えヒト造血幹細胞を免疫不全マウスに移植されています。抗腫瘍免疫応答の生体観察を可能に設計されたヒト免疫系の再構成でこの結果。

次の実験の全体的な目的は、操作されたヒト免疫システムを持つマウスを生成することです。これは、最初にマウスを手術用に準備し、次に2番目のステップで胸腺の一部をトロカールにロードすることによって達成されます。マトリゲルをCD34陰性およびCD34陽性形質導入細胞と混合し、次いで混合物をトロカールに添加する。

次に、マトリゲル構築物を腎臓嚢の下に移植します。最終的に、遺伝子操作されたCD eight T細胞による標的腫瘍の拒絶反応は、生きたペットイメージングと物理的な腫瘍測定によって監視できます。この手法の主な利点は、完全なニューロンモデルのような既存の覚醒剤の方法よりも、この方法がヒト胸腺内の遺伝子組み換えヒト幹細胞の発生の研究を可能にし、その後の派生系統の生体内有効性試験が私たちの研究室から3人の技術者、グレゴリー・ブリストル、バーナード・レビンによって行われることを実証することです。 とショーン・キム。

この概略図では、これらの研究で用いた修正BLTモデルを、mart、1つの特異的T細胞を保有するキメラマウスの作製について概説する。このインプラントは、自家胎児の肝臓から単離された形質導入されたCD34細胞と形質導入されていないCD34細胞から再構築されます。次に、形質導入された細胞の一部を凍結し、4〜6週間後に照射したマウスに注入します。

このビデオでは、動物が麻酔から動きが鈍くなった後のthライブコンストラクトの移植が実証されています。まず、各マウスの左側を腰から肩まで、背中の中央と腹の間から剃ります。各動物の体重を記録した後、番号付けのために耳をパンチし、皮下で、各肩に0.3ミリリットルのカープロフェンを注入します。

次に、マウスを左側を向いて右側に置きます。次に、16ゲージのがんインプラント針のトロカールを、PBS付きの丸いヤスリの先端で洗い流します。一対の針鼻鉗子を使用して、胸腺の一部をPBSの皿に追加し、次にトロカールをロッドで水平に保持します。

先端のすぐ内側で組織を吸引します。トロカールを腎臓嚢の下にスライドさせ、組織を注入することは、この手順の最も困難な側面の1つです。次に、ヘルパーを用意します。

eend orphポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、5マイクロリットルの冷マトリゲルを1本の細胞チューブに穏やかに攪拌しながら混合します。トロカールを水平に保ちます。ヘルパーがマトリゲルをピペットで動かしている間、ロッドをゆっくりと引き戻します。

各マウスのトロカールに混ぜます。まず、動物の素肌をベタジンで綿棒で拭き取り、次にイソプロパノールワイプで拭き取ります。2回は、脾臓の位置を示す、皮膚の下の最も暗い場所を決定します。

腎臓は、鈍い鉗子を使用して腎臓の上の皮膚を拾うために脾臓の約5ミリメートルの背側にあります。脾臓と平行な皮膚に約15ミリメートルの長さの切り込みを入れます。下の腹膜筋層にも同様の切り込み

男性では、腎臓は直接見えるはずです。腹部を絞るだけで飛び出します。女性の腎臓を露出させておくために左手で腹部に圧力をかけ続け、最初に止血剤を使用して卵巣を持ち上げ、次に腎臓を引きずり出して臓器を体外に保持します。

腎臓嚢の後端に小さな穴を開け、次にトロカールをこの穴に滑り込ませ、トロカールの開口部が腎臓嚢で完全に覆われるまで腎臓に沿ってスライドさせます。次に、右手の小指を使用して、組織を注入します。次に、閉じた止血器を使用して、腎臓をゆっくりと元の位置に戻します。

腹膜に1針をダブルボウで結び、皮を財布のように絞ってから、2つの巻きクリップに入れます。最後に、PBSを各目に一滴垂らし、寝具の上のケージにマウスを横向きに置きます。すべてのマウスを同じように移植した後、動物が腹ばいに戻ったことを確認してから離れます。

この最初の図は、ヒト化マウスにおけるTHIライブインプラントの代表的な画像を示しています。この図では、胸腺組織の正常な発達と、ヒトのCD 4およびCD 8陽性Tの生理学的組織分布が示されています。再構成後、動物はCD4およびCD8陽性T細胞が正常分布するヒト免疫系を有する

ここでは、黒色腫腫瘍を患っているマウスの代表的な画像を示します。灰色の領域はCTスキャン画像を示しています。色付きの領域は、PETスキャンで検出された腫瘍の代謝活性を示しています。

この実験のCTスキャンだけでは、白丸で示された領域に大きな腫瘍塊が示されました。しかし、in vivo PETイメージングが示すように、この領域は主に壊死組織と瘢痕組織で構成されており、腫瘍の退縮とクリアランスを評価するためのより感度が高く正確な方法としてのPETイメージングの有用性が強調されています。この手順に続いて、T細胞、表現型解析、ex vivo活性化などの他のアッセイを実施して、T細胞機能に関連する疑問に答えることができます。