の細胞特異的な分析シロイヌナズナ蛍光活性化細胞選別を使用した葉

この手順の全体的な目標は、葉から細胞型特異的なプロトプラストの集団を単離することです。これは、葉の特定の細胞タイプでGFPを発現する植物を最初に育てることによって達成されます。2番目のステップは、酵素消化を使用して葉を収穫し、プロトプラストを生成することです。

次に、プロトプラストを蛍光活性化細胞の選別または事実を用いてろ過および選別します。最後のステップは、蛍光顕微鏡を使用してソーティングの精度を確認することです。最終的に、選別されたプロトプラストは、細胞種特異的な遺伝子発現の解析、プロテオミクス解析、または代謝プロファイリングに使用できます。

蛍光活性化細胞の選別は、以前は根にうまく使用されてきましたが、葉細胞の単離にも使用されています。この方法以前のGFPによる標識は、クロロフィル蛍光による干渉のために制限されていました。この方法を視覚的にデモンストレーションすることは迅速であるため重要ですが、細胞ソーティング中に発生する可能性のある広範な生理学的変化を最小限に抑えるためには、慎重なサンプル調製が重要です。

一般に、この方法に不慣れな人は、セルソーターの設定方法や正確なソーティングの確認方法がわからないため、苦労します。この方法は、植物システム生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。葉のような複雑な多細胞器官における遺伝子制御ネットワークを同定する際の問題は、細胞タイプが異なれば遺伝子群も異なることです。

この遺伝情報は、全葉の収穫分析で失われます手順を示しています。私の隣には、私たちの研究室でこの研究の技術サポートを提供しているEllison AsとSanjeev Kumaがいます。まず、9cmの丸いペトリ皿に、プロトプレーティング酵素と転写およびRNA阻害剤を含む20ミリリットルの溶液Aを満たします。

次に、ここに示すサンプルのように複数の葉を含むサンプルの目的の葉材料を収穫します。葉を最大15枚の葉のスタックに配置します。次に、かみそりの刃を使用して、葉を幅1ミリメートルのストリップに切ります。

すぐに平らなピンセットを使用して葉のストリップをペトリ皿に移し、ストリップを静かに分離してから、サンプルに毎回5分間2回真空浸潤します。次に、ペトリ皿を室温で90RPMに設定されたオービタルシェーカーに置き、プロト石膏サンプルを3〜4時間置きます。孵卵中に、ピンセットを使用して、30分間隔で葉のストリップを互いに分離します。

消化後、プロトプラスト溶液を70ミクロンのセルストレーナーで50ミリリットルのチューブに穏やかにろ過します。リーフストリップを削除するために、ストリップは保持されます。プロトプラストはろ過します。

次に、4ミリリットルの溶液Aを使用して、50ミリリットルのチューブに洗浄物を集めたリーフストリップをやさしくすすぎます。次に、プロトプラスト懸濁液を丸底チューブに移し、プロトプラストをGの300倍および室温で5分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、仰臥位のナタントをできるだけ穏やかに吸引し、同じ遠心分離機の条件下でプロトプラストを5ミリリットルの溶液Aで洗浄します。

最後に、仰臥位を除去した後、カットオフP 1000チップを使用して、選別直前にプロトプラストを適切な量の溶液Aに再懸濁し、選別します。未加工のP 1000チップを使用して、Protoplasts溶液中の凝集体を分解します。さらに、50ミクロンのフィヨンフィルターを介してプロトプラストをソーシングチューブにろ過することにより、細胞を解離します。

次に、セルソーシングノズルの詰まりを避けるために、セル溶液を適切に希釈します。最適な細胞調達条件を決定した後、488ナノメートルのアルゴンヌレーザーでGFPポジティブProto plusを同定し、580 30バンドパスフィルターと530 40バンドパスフィルターからの出力を比較します。GFP陽性のプロトプラストは、530高、580低の集団に現れることに注意してください。

非GFPプロトプラストが低530、低580の集団にあるため、死んだ死にかけているプロトプラストと破片が高580の集団に現れ、蛍光顕微鏡で選別されたプロトプラストを可視化し、プロトプラストを直接少なくとも8容量の溶液Aに選別し、濃縮物を選別した後、遠心分離プロトプラストを8容量の溶液Aに選別し、蛍光顕微鏡で可視化して濃縮を確認することができます。この最初の画像は、ガード細胞でGFPを発現するTP 382細胞株の濃縮例を示しています。この方法を使用して得られた増幅前と増幅後の両方で得られる収率の例を次の表にまとめています。

500ピコグラムから50ナノグラムの間で得られる量は、拍手喝采のPICO WTAシステムによる増幅と、その後の定量的PCR、次世代シーケンシング、またはマイクロアレイによる分析に十分です。この次の一連の画像は、さまざまなプロトプラスト細胞株を単離し、前述の方法で選別したものです。これらの最初のプロトプラストはKC2 74に由来し、KC2 74の横断面を残します。

葉は、GFPが血管系で発現していることを示しています。これらのプロトプラストはKC4 64の葉から単離され、KC4 64の葉の横断面は、GFP発現がAダル表皮に見られることを示しています。最後に、これらのプロトプラストは、TP 3 82葉中のTP3 82葉に由来した。

GFPは、ここのガードセルで発現しています。5 80 30 ナノメートルと 5 30 40 ナノメートルのバンドパス パス フィルタからの出力を示す一般的なファックス取得ドット プロットが示されています。示されているソートゲートは、ソート中に通常使用されるものです。

この石炭の4葉由来のプロトプラスト原型を阻害剤の非存在下で漆喰で塗りつぶした最初のストッププロットは、単一の低530、低580の個体群を示しています。一方、野生型の石炭である4葉由来のプロトプラスト原体を阻害剤の存在下で漆喰で塗ったこのドットプロットは、阻害剤によって引き起こされるストレスと着色によって発生する580蛍光のシフトを示しています。これらのドットプロットは、KC seven four、KC 4 64、TP 3 82系統の葉由来のプロトプラストです。

これらのサンプルは、GFPが高530低580の集団に含まれていることを示す阻害剤の存在下でも漆喰で塗りつぶされました。この代表では、まず各フラクションタイプについて定量的PCR実験サンプルを採取しました。次に、サンプルを ovation PICO WTA システムと定量 PCR を使用して増幅しました。

GFP特異的プライマーを用いて行った。示されている値は、赤で最も高い値、緑の最も低い値、アクチン2を参照遺伝子として使用した平均値または単一の値は、黄色の水平バーで示されています。その結果、選別された画分中のGFP細胞含有量の光学的評価が再検証されました。

上位530人、下位580人の集団は、測定可能な最高レベルのGFP発現を示しました。高530、高580の集団が約1000倍低いGFP発現を示したのに対し、低530、低580および低530の高580集団は、対照の全葉および未選別されたプロトプラスト集団のものに匹敵する低レベルのGFP発現を示した。一度習得すると、この技術は、適切に行われれば、植物から選別された細胞集団まで4〜5時間で行うことができる。この手順を実行する際には、セルソーターを常に監視し、必要に応じて再キャリブレーションしてソーティングの精度を維持することを覚えておくことが重要です。

この手順が見つかりました。マイクロレイ解析などの他の方法を実行して、異なる細胞タイプの遺伝子発現レベルを比較対照することができます。この技術が開発された今、私たちはさまざまな発生段階にある特定の葉細胞タイプの遺伝子発現を解析しており、これを農学プロジェクトで生成された葉全体のデータと比較します。

このビデオを見れば、蛍光活性化細胞ソーティングを使用して単一細胞タイプの葉を単離する方法を十分に理解できるはずです。