の細胞特異的な分析シロイヌナズナ蛍光活性化細胞選別を使用した葉

本手順の全体的な目的は、葉から細胞型特異的なプロトプラストの集団を単離することです。これはまず、葉の特定の細胞型でGFPを発現する植物を育成させることで達成されます。次のステップでは、葉を採取し、酵素消化を用いてプロトプラストを調製します。

次に、プロトプラストをろ過し、蛍光活性化細胞分取（FACS）を用いて分取します。最終ステップとして、蛍光顕微鏡を用いて分取の正確性を確認します。最終的に、分取されたプロトプラストは、細胞型特異的な遺伝子発現解析、プロテオーム解析、またはメタボリックプロファイリングに使用できます。

蛍光活性化細胞分取（FACS）は、これまで根を用いた研究で成功を収めてきましたが、本手法では葉細胞の単離に利用します。本手法を用いる前のGFP標識は、クロロフィル蛍光による干渉があるため制限されてきました。細胞分取中に起こりうる広範な生理学的変化を最小限に抑えるためには、迅速かつ慎重なサンプル調製が不可欠であるため、本手法を視覚的に実演することが極めて重要です。

一般的に、この手法に不慣れな方は、セルソーターの設定方法や、正確にソーティングが行われているかを確認する方法が分からないため、苦労することがあります。本手法は、植物システム生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。葉のような複雑な多細胞器官において遺伝子調節ネットワークを特定する場合、細胞型によって異なる遺伝子群が発現していることが課題となります。

この遺伝情報は、葉全体の採取分析において失われます。ここではその手順を実演します。私の隣には、当研究室で本作業の技術支援を担当するEllison AsとSanjeev Kumaが同席しています。まず、プロトプラスト分離酵素および転写・RNA分解酵素阻害剤を含む溶液A 20 mLを、直径9 cmの丸型シャーレに満たします。

次に、ここに示されているサンプルのように、複数の葉を含むサンプルのために必要な葉の材料を採取します。葉を最大15枚まで重ねて配置します。その後、カミソリを用いて、葉を1 mm幅の細長い帯状に切断します。

平ピンセットを用いて、葉のストリップを直ちにペトリ皿に移し、ストリップを静かに分離させた後、真空浸透処理を5分間ずつ2回行います。次に、ペトリ皿を室温、90 RPMに設定したオービタルシェーカーに置き、プロトプラスト試料を3〜4時間処理します。インキュベーション中は、30分おきにピンセットで葉のストリップを互いに分離させてください。

消化後、プロトプラスト溶液を70 micronのセルストレーナーを用いて50 milliliterチューブに緩やかにろ過します。これにより、葉のストリップはストレーナーに残り、プロトプラストのみがろ過されて回収されます。

次に、4 mLの溶液Aを用いて葉片を穏やかに洗浄し、洗浄液を50 mLチューブに回収します。その後、プロトプラスト懸濁液を丸底チューブに移し、室温、300 ×gで5分間、プロトプラストを遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、上清をできるだけ丁寧に吸引し、その後、同様の遠心分離条件で5 mLの溶液Aを用いてプロトプラストを洗浄します。

最後に、上層の浮遊物を除去した後、分注直前にカットしたP 1000チップを使用して、PROTOPLASTSを適切な量の溶液Aで再懸濁します。カットしていないP 1000チップを使用して、プロトプラスト溶液中の凝集塊を分散させます。さらに、50 micronのfillonフィルターを用いてプロトプラストを分注チューブにろ過し、細胞をさらに分散させます。

次に、細胞供給ノズルの詰まりを防ぐために、細胞溶液を適切に希釈します。最適な細胞供給条件を決定した後、488 nmのアルゴンレーザーを用い、530/40帯域通過フィルターの出力と580/30帯域通過フィルターの出力を比較して、GFP陽性プロトプラストを特定します。GFP陽性のプロトプラストは、530が高く580が低い集団として現れることに注意してください。

低530、低580の集団にある非GFPプロトプラストに対し、死滅または死にかけているプロトプラストおよびデブリは高580の集団に現れます。蛍光顕微鏡によるソート済みプロトプラストの可視化のため、ソート後は直接、溶液Aの少なくとも8倍量の容量にプロトプラストを回収し、遠心分離によって濃縮してください。プロトプラストを溶液Aの8倍量にソートして回収し、蛍光顕微鏡で可視化することで、濃縮度を確認できます。最初の画像は、孔辺細胞でGFPを発現するTP 382細胞株の濃縮例を示しています。本手法を用いて得られた、増殖前後の収量の例をこの表にまとめます。

500 picogramsから50 nanogramsの間で得られた量は、ovation PICO WTAシステムによる増幅と、それに続くquantitative PCR、次世代シーケンシング、またはマイクロアレイによる解析に十分な量です。接して示す一連の画像は、上述の方法で単離およびソートされたさまざまなプロトプラスト細胞株を示しています。これらの最初のプロトプラストはKC 2 74から派生したものであり、KC 2 74葉の横断切片です。

葉の画像から、GFPが維管束で発現していることがわかります。これらのプロトプラストはKC 4 64の葉から単離されており、KC 4 64の葉の横断切片では、A dal表皮にGFPの発現が認められます。最後に、これらのプロトプラストはTP 3 82の葉から得られたものです。

ここでは、孔辺細胞にGFPが発現しています。580/30 nmと530/40 nmのバンドパスフィルターからの出力を示す、代表的なFACS解析のドットプロットを示します。表示されているソーティングゲートは、通常ソーティングで使用されるものです。

阻害剤なしでプロトプラスト化したcol4葉由来プロトプラストのこの最初のドットプロットでは、530低値、580低値の単一の集団が示されています。一方、阻害剤存在下でプロトプラスト化した野生型col4葉由来プロトプラストのこのドットプロットでは、阻害剤によって引き起こされたストレスと染色に起因する580蛍光のシフトが示されています。これらのドットプロットは、それぞれKC74、KC464、およびTP382系統の葉由来プロトプラストのものです。

これらのサンプルを阻害剤存在下で処理したところ、GFPが高530・低580の集団に含まれていることが示されました。この代表的な定量PCR実験では、まず各画分タイプからサンプルを取得しました。その後、ovation PICO WTAシステムおよび定量PCRを用いてサンプルを増幅させました。

GFP特異的プライマーを用いて解析を行った。示されている値は、最高値を赤色、最低値を緑色で表し、actin twoをリファレンス遺伝子として用いた平均値または単一値を黄色の水平バーで示している。これらの結果は、分取した画分におけるGFP細胞含有量の光学的な評価を再検証したものである。

high 530 low 580集団において、GFP発現の測定レベルが最も高く現れました。一方、high 530 high 580集団ではGFP発現が約1000倍低く、low 530 low 580およびlow 530 high 580集団では、対照群である葉全体および未分選のプロトプラスト集団と同等の低いGFP発現レベルを示しました。この手法を習得すれば、適切に実施することで、植物から分選済み細胞集団を得るまで4〜5時間で完了できます。この手順を行う際は、分選精度を維持するために、常にセルソーターを監視し、必要に応じて再校正することが重要です。

この手順を確認しました。異なる細胞タイプにおける遺伝子発現レベルを比較・対照させるために、マイクロアレイ解析などの他の手法を用いることができます。この技術が確立されたため、現在は異なる発達段階における特定の葉細胞タイプでの遺伝子発現を分析しており、これをアグロノミクスプロジェクトで生成された葉全体のデータと比較する予定です。

このビデオを視聴することで、蛍光活性化細胞分取法を用いて葉の単一細胞型を分離する方法について十分に理解することができます。