Name: の細胞特異的な分析シロイヌナズナ蛍光活性化細胞選別を使用した葉 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学ぶシロイヌナズナ葉の細胞特異的原生質体分離法。蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いてGFP発現細胞を高精度に分離し、遺伝子発現や代謝プロファイリングを可能にする植物システム生物学の重要技術です。

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細胞型と発達段階特有のプロファイリングにブキャナン-ウォラストンラボでの作業は、欧州委員会の第 6次フレームワークProgammeにおけるアグロ-OMICSプロジェクト（グラント＃LSHG-CT-2006から037704）によってサポートされています。細胞型に特異的なプロファイリングのギフォード·ラボでの作業はBBSRC新治験助成（BB/H019502/1）によってサポートされています。 KC274とKC464 シロイヌナズナラインはAAR·ウェッブ（ケンブリッジ大学）から得た。

1。プロトプラストの生成<ol><li>かみそりの刃で1ミリメートル幅のストリップ（ 図1）への収穫葉材料とカット。のために最大15葉に単一のリーフ以上を含有するサンプルを簡単にカットする前に積み重ねることができます。 </li><li>直ちに20mlの溶液 （400mMのマンニトール、20mMのMES水和物は、20mMのKCl、10mMのCaCl 2、2mMのMgCl 2、0.1％BSAおよび2.5mMのβ-メルカプトエタノールを含む9センチメートルラウンドペトリ皿に葉片を転送protoplasting酵素を含むpHは5.7）（1.2％セルロース、R-10、0.6％セルロースRSと0.4パーセントmacerozyme R-10）とRNase及び転写酵素阻害薬（1×ProtectRNAおよび10μg/ mlのアクチノマイシンD）;優しく独立した葉片と真空度は2×5分間浸透させる。 </li><li> 3〜4時間室温およびプロトプラストを90 rpmに設定オービタルシェーカー上にシャーレを置きます。 <ol><li>インキュベーションの間葉片は、使用することによって、互いに分離されるべきである30分ごとの間隔で、フラットピンセットのセットです。 </li></ol></li><li> 50 mlチューブで70μmのセルストレーナー（フィッシャーサイエンティフィック）を置き、そっとを通じてprotoplastingソリューションをフィルタリングします。これは、プロトプラストが通過できるようにしながらふるいによって保持される葉片を、削除されます。 </li><li>ゆっくりとフィルター同じ篩4 mlの溶液を用いて葉片を洗浄します。 </li><li>丸底チューブにプロトプラストを転送し、ペレットプロトプラスト〜5分間300 xgでプロトプラスト溶液を遠心分離します。 </li><li>穏やかにプロトプラストを乱すことなく、できるだけ多くの上清を可能な限りを吸引。 </li><li> 、遠心分離機で5分間300 xgで5 mlの溶液を用いてプロトプラストを洗浄します。上清を除去</li><li>パスツールピペットやカットオフP1000チップを使用して、 ソリューションの適切な音量でプロトプラストを懸濁する。 </li></ol> 2。葉プロトプラストのFACS </p&gt; <ol><li>すぐにソートする前に、凝集プロトプラストを避けるために（ノンカット）P1000チップを用いてプロトプラストを再懸濁します。 </li><li> 50μmのfilconフィルター（BD Biosciences社）をソートチューブにプロトプラストを転送し、セルソーターのノズルの目詰まりを避けるために、必要に応じて希釈してください。プロトプラスト（これらの設定は、BDの流入セルソーターに最適な20 PSI（シース）と21から21.5 PSI（サンプル）、39.2 kHzの周波数と4000 &lt;事象発生率の圧力で100μmのノズルを使用してソートされます他のセルソーティング·マシン上（BD Biosciences社）。最適化）は、これらの設定を調整する必要があるかもしれません。 </li><li> GFP陽性プロトプラストを488nmのアルゴンレーザーを使用していて、30分の580バンドパスフィルタ（オレンジ）対40分の530バンドパスフィルター（緑）からの出力をプロットする識別されます。 GFP陽性プロトプラストは、高580 POPUの低530 /ロー580人口と瀕死/デッドプロトプラストと残骸の非GFPのプロトプラストと、高い530/low 580人口になりますlation（ 図2）。 <ol><li> RNAを抽出元となるプロトプラストをソートする場合、プロトプラストを還元剤（ 例えば 、β-メルカプトエタノール）を含む溶解緩衝液の少なくとも4つのボリュームに直接ソートする必要があります。また、単一試料のソート時間は、20〜30分であり、いずれかの時点で処理二から三のサンプルの最大値に制限されるべきである。 </li><li>ソートされたプロトプラストの可視化のために、プロトプラスト溶液の少なくとも8巻、その後プロトプラストを集中させる遠心分離によって収集に直接ソートする必要があります。 </li></ol></li></ol> 3。代表的な結果このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別（ 図1）のために使用されるシロイヌナズナの葉からプロトプラストを得るための方法を説明します。 RNaseおよび転写阻害剤の存在下におけるプロトプラストの生成は細胞fを防ぎromは転写応答をマウントする。これは、自家蛍光の有意水準を持っている多くの死者と瀕死プロトプラストを生じさせるの結果を持っていません。この方法を用いて調製したプロトプラストをソートする場合には、ソートに使用される580nmの対530nmの蛍光のグラフにはいくつかの異なる集団を参照することが非常に一般的です。このプロトコルに使用されるソートゲートと一緒にこのような例は、 図3に示します。 プロトプラスト溶液の8巻にソートされ、濃縮を確認するために可視化のために収集することができます。 図2Gは、これは孔辺細胞にGFPを発現TP382ラインを使用しての例を示しています。 増幅前と後の両方で、この方法を用いて得られた収量の例は、 表1に示されている。算定された金額は、オベーションピコWTAのシステム（500 PG-50 ng）を、したがって、sを用いて増幅するために十分である定量PCR（ 図4）は、次世代シーケンシングやマイクロアレイのいずれかの方法でubsequent分析。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig1.jpg" /> 図1実験の全体的なワークフロー。 1）収穫はシロイヌナズナラインをGFP発現から関心のある葉。 2）迅速に約1mm幅のストリップに切断し、直ちにprotoplasting溶液及び真空浸透させるにこれらを転送します。 3）3〜4時間インキュベートする。 4）70μmのふるいを通してゆっくりと濾過プロトプラスト溶液を遠心分離により底チューブ、ペレットプロトプラストを丸める移す。 5）すぐに選別、再懸濁するプロトプラストおよびフィルタは50μmを通じて選別チューブに移す前に。 6）並べGFP陽性およびGFP陰性の実行可能なプロトプラスト。 7）プロトプラストは今どちらか視覚的に分析したり、そのような定量PCR、次世代シーケンシングやマイクロアレイなどの技術を使用して設定できます。 図2本研究で使用したKC464、KC274とTP382行。向軸表皮にGFPの発現を示すKC464葉のA）の横断面。 B）のプロトプラストはKC464葉由来。血管系にGFPの発現を示すKC274葉のC）の横断面。 D KC274葉由来）プロトプラスト。孔辺細胞におけるGFPの発現を示すE）TP382の葉。 F）のプロトプラストは、TP382の葉に由来する。 TP382葉由来プロトプラストの高い530/low 580集団からプロトプラストを含むGFPを示し、葉の細胞の複雑な背景に孔辺細胞をGFP発現のFACSによって得られた濃縮のG）の例。 AF：共焦点顕微鏡画像、G：蛍光顕微鏡画像。画像内のスケールバーは50μmである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig3.jpg" /><html> 図3 30分の580 nmの（オレンジ）対40分の530 nm（緑）バンドパスフィルタ（BDの流入のセルソーター）からの出力の典型的なFACS買収ドットプロット。示さソートゲートは通常、ソート時に使用されたものである。単一の低530/low 580人口を示す阻害剤の非存在下でprotoplasted COL-4葉由来プロトプラスト、、のA）ドットプロット。阻害剤によるストレスや着色のために580蛍光のシフトを示す阻害剤の存在下でprotoplasted重量COL-4葉由来プロトプラスト、AからB）ドットプロット。高530/low 580集団で集団を含むGFPを示す阻害剤の存在下でprotoplastedそれぞれKC74、KC464とTP382ライン、、、から葉由来プロトプラストからCE）のドットプロット。 GFP（高530/low 580）集団内のイベントのパーセンテージが与えられている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 e_content &quot;のfo：キープtogether.withinページ=&quot; always &quot;を&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig4.jpg" /> 図4：図3に示すように、代表的なゲーテッド人口画分におけるGFP発現。複製し2つの生物学は、その後行われたGFP特異的プライマー（ 表2）を用いてオベーションピコWTAのシステムと定量PCRを用いて増幅し、各分画の種類が得られた。示された値は、最も高い（赤）、最低（緑）と平均相対値である。高580人口はこのケースでは2、低530/low 580と単一の生物学的replicateは、単一の値のみが表示されているので、使用されていたため高530/low 580に分割されました。 ACT2（At3g18780）は、すべてのサンプルのための標準として用いた。葉：葉全体。未ソート：ソートされていないプロトプラスト。 GFP1：高530/low 580とRest1：低530/low 580、GFP2：高530/high 580とRest2： 図3とインサートで説明したように、低530/high 580、。結果は、検証Oアールソートされた画分（ 例えば、 図2G）におけるGFP細胞含量のf光学評価。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <table border="1"><tbody><tr><td> サンプル </td><td> 葉数 </td><td> 細胞数 </td><td> RNAの収量 （NG） </td><td> RNAの収量 （増幅; NG） </td></tr><tr><td>全体の葉 全葉B </td><td> 1 1 </td><td> - - </td><td> 8001 10525 </td><td> 4623 *** 4572 *** </td></tr><tr><td>ソートされていないプロトプラスト ソートされていないプロトプラストのB </td><td> 5 5 </td><td> - - </td><td> 2433 2625 </td><td> 1152年*** 3321 *** </td></tr><tr><td> GFP1 Rest1 </td><td> 15 </td><td> 6039（0.39％*） 55389（6.40％*） </td><td> - ** - ** </td><td> 861 489 </td></tr><tr><td> GFP1 B Rest1 B </td><td> 15 </td><td> 10783（0.63％*） 57040（7.49％*） </td><td> - ** - ** </td><td> 537 420 </td></tr><tr><td> GFP2 Rest2 </td><td> 15 </td><td> 18337（1.49％*） 62405（73.49パーセント*） </td><td> - ** - ** </td><td> 360 411 </td></tr></tbody></table> 表1サンプルは、FACSを用いて収集し、ライブGFP発現プロトプラストを含有する画分を決定するために、定量PCRで分析した。またオベーションピコWTAシステム（NuGen）で増幅前後NGの総RNAの収量は、この表に含まれています。 GFP1、GFP2、Rest1とRest2画分を、 図4中の挿入で表示されます。総細胞ソート実行の細胞の*割合は分数のセルの数の横に括弧で与えられます。これらのパーセンテージはに相関していない収集レスト細胞のはるかに大きい数のためのGFP画分よりも早く停止したFACSの並べ替えなど、各サンプルのお互いが &#39;休息&#39;分数のために実行されます。製造元のプロトコールに従って増幅反応への入力として使用** 50 NG、。 <table border="1"><tbody><tr><td> プライマー </td><td> シーケンス </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.fw </td><td> GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.rv </td><td> TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT </td></tr><tr><td> ACT2.fw </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr><tr><td> ACT2.rv </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr></tbody></table> 表2定量PCRプライマー。

<ol><li>Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+Simple+and+Compound+Leaves%3A+A+Critical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review.</a> Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).</li>
<li>Kleber, R., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Quality+Assessment+of+RNA+From+Cell-Specific+Samples+Obtained+by+Laser+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection.</a> Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).</li>
<li>Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gene+Expression+Map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gene Expression Map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li>
<li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Tissue-+and+Organ-specific+Phytochrome+Responses+using+FACS-assisted+Cell-type+Specific+Expression+Profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. (39), e1925(2010).</li>
<li>Beal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+For+Gene+Expression+and+Chromatin+Profiling+of+Individual+Cell+Types+Within+a+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue.</a> Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li>
<li>Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> PNAS. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Root+Expression+Patterns+Revealed+in+a+High-Resolution+Spatiotemporal+Expression+Map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> PNAS. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+identity+mediates+the+response+of+Arabidopsis+roots+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress.</a> Science. 320, 942-945 (2008).</li>
<li>Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
<li>Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+shoot+apical+meristem+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche.</a> PNAS. 106, 4941-4946 (2009).</li>
<li>Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis-related+gene+fusions+is+restricted+by+cell+type+in+transgenic+plants+and+in+transfected+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts.</a> PNAS. 87, 816-820 (1990).</li>
<li>Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+strong+Arabidopsis+guard+cell+promoter+and+it%27s+potential+as+a+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool.</a> Plant Methods. 4, 6(2008).</li>
<li>Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+GFP+enhancer+trap+lines+for+analysis+of+stomatal+guard+cell+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression.</a> J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、プロトプラストの生成およびFACSを使用して後続の細胞選別のための葉にGFPを発現するシロイヌナズナ植物の使用を可能にする方法を説明してきました。この方法は、定量PCRやマイクロアレイのどちらかによって増幅、したがってその後の分析に使用するRNAの十分な量が得られます。ソートされた画分を、高度として定量PCR（ 図2）によって実証GFP含有細胞が濃縮されています。 葉片が阻害剤含有プロトプラスト溶液を真空に潜入されるまで生きてプロトプラストの高い収率を達成するには、手順の最初のステップの間に急速に働くことが重要です。また、1ミリメートルの葉片を生成するときに、これは過度の損傷、したがって低いプロトプラスト収量につながるとして、葉ではなく &#39;チョップ&#39;やマッシュにスライスまたはカットすることが非常に重要です。 ここで説明した方法と他publisheの決定的な違いdの方法はRNase阻害剤や転写阻害剤の使用です。ほとんどのメソッドは、プロトプラストをより簡単に生成することができ、そこからシロイヌナズナの根のために開発されています。しかし、肉を除いて、葉を扱うとき、それはプロトプラストの生成時間を増加させる必要がある。したがってプロトプラストの生成処理自体（データは示していない）の結果として、遺伝子発現の変化から守るために、これらの阻害剤を含めることが重要です。しかし、阻害剤の存在は、ストレスに対抗すると可塑性の喪失にこのリード線などのプロトプラストが受けやすくなる可能性のあるもの、オンまたはオフの遺伝子を切り替えることにより、どちらかの、転写応答をマウントすることができないことにつながる手順をprotoplasting。 我々はGFP発現シロイヌナズナライン数で正常ここで説明した方法を使用している。重要なのは、我々はどちらかに強くGFPを発現するGFPの行でこのメソッドを使用している核、またははるかに弱くnon-localized/diffuse細胞質方法では、ここで使用されてKC464とKC274線の場合と同様です。回線の両方の型は、メソッドと互換性があり、GFP発現プロトプラスト（ 図2および3）の高濃縮画分を得ることができます。フルオロフォアは、生きた細胞を選択する能力を維持するために死んだ/死細胞の自家蛍光とは著しく異なる蛍光を選択しなければなりませんが、方法は簡単、他のフルオロフォアに適合させることができる。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>セルラーゼR-10 </td><td>メルフォード</td><td> C8001 </td></tr><tr><td>セルラーゼRS </td><td>メルフォード</td><td> C8003 </td></tr><tr><td> Macerozyme R-10 </td><td>メルフォード</td><td> M8002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3912 </td></tr><tr><td> ProtectRNA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R7397 </td></tr><tr><td>アクチノマイシンD </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A1410 </td></tr><tr><td> 70μmのセルストレーナー</td><td>フィッシャー</td><td> FB35181 </td></tr><tr><td> 50μmのfilconカップ型フィルター</td><td> BD Biosciences社</td><td> 340630 </td></tr></tbody></table>

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

葉の原基の開始後、バイオマス蓄積は主に細胞増殖や葉1の拡大によって制御されます。しかし、 シロイヌナズナの葉は、多くの異なる細胞型といくつかの構造で構成された複雑な器官である。同時に、成長して葉が拡大停止と老化1を受けることが第一である葉柄から最も遠いセルと、開発のさまざまな段階で細胞が含まれています。リーフ内の異なる細胞が故に伸長または分化、分裂している、アクティブ、ストレスやデッド、および/または任意の一時点で、携帯型のサブ組での刺激に応答します。これはやりがいの葉のゲノム研究を行います。たとえば全体の葉から発現データを解析する際に、異なる細胞応答ゾーンまたは細胞型で動作遺伝子ネットワークからの信号が生成される不正確なプロファイルになり、混乱します。 この問題に対処するために、Sエベラル方法は細胞特異的遺伝子発現の研究​​を可能が記載されている。これらは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）2またはプロトプラストの生成とそれに続く蛍光活性化細胞選別（FACS）3,4、原子力降水5とポリソーム6の免疫沈降のための最近記載そのままシステムに使用されるGFP発現植物が含まれる。 FACSを成功裏に根端からセルの識別情報との距離が遺伝子3,7の多数の発現プロファイルに有意な効果を持っていたことを示すなど、多くの研究が、使用されてきました。 GFPの行のFACSもroot窒素応答と側根の発達8、塩ストレスルート10の9オーキシン分布の間に細胞特異的転写調節を実証し、 シロイヌナズナの茎頂分裂組織11の遺伝子発現マップを作成するために使用されている。しかしFACSが以前自家蛍光12,13に基づくシロイヌナズナ葉由来プロトプラストをソートするために使用されてきたが、葉にGFPを発現シロイヌナズナライン上のFACSのこれまでの利用は4非常に限られてきました。以下のプロトコルでは、プロトプラストの生成レジームの影響を最小限に抑えながら、FACSと互換性のあるシロイヌナズナの葉のプロトプラストを得るための方法について説明します。我々は、向軸表皮14にKC274線、血管組織14とダブルGFPは内核局在化シグナルにリンクされている構築物を発現TP382 シロイヌナズナライン入力で GFPを発現するが、KC464 シロイヌナズナラインを使用する方法を実証しているGFPを発現する孔辺細胞（データは示されていない、 図2）。我々は現在、老化のさまざまな段階で、両方の細胞型の開発とストレス時の具体的な表現だけでなく、不均一な細胞集団を研究するためにこのメソッドを使用している。

製造方法<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;特定の細胞集団の研究を可能にする、蛍光活性化細胞選別（FACS）と互換性のある葉プロトプラスト。このメソッドは、任意のと互換性があります<em&gt;シロイヌナズナ</em細胞のサブセットでGFPを発現&gt;行。

葉原基の分化後、バイオマスの蓄積は主に葉における細胞増殖と細胞拡大によって制御されます1。しかしながら、...

この手順の全体的な目的は、葉から細胞種特異的なプロトプラストの集団を単離することです。まず、葉の特定の細胞種でGFPを発現する植物を育成します。次に、葉を採取し、酵素消化を用いてプロトプラストを調製します。次に、プロトプラストをろ過し、蛍光活性化細胞分取（FACS）を用いて分取します。最終ステップとして、蛍光顕微鏡を用いて分取の正確性を確認します。最終的に、分取されたプロトプラストは、細胞型特異的な遺伝子発現の解析、プロテオーム解析、またはメタボリックプロファイリングに使用することが可能です。蛍光活性化細胞分級（FACS）は、これまで根に対してはうまく利用されてきましたが、ここでは葉細胞の単離に用います。本手法を用いる前のGFP標識は、クロロフィル蛍光による干渉があるため制限されてきました。細胞分級中に起こり得る広範な生理学的変化を最小限に抑えるには、迅速かつ慎重なサンプル調製が不可欠であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。一般的に、この手法に不慣れな方は、セルソーターの設定方法や、正確に分取できているかを確認する方法が分からないため、困難に直面することがあります。本手法は、植物システム生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。葉のような複雑な多細胞器官において遺伝子調節ネットワークを特定する際の問題は、細胞種によって発現する遺伝子群が異なることです。この遺伝情報は、葉全体の採取分析において失われます。ここではその手順を実演します。私の助手として、当研究室で本作業の技術支援を行うEllison AsとSanjeev Kumaが同行します。まず、プロトプラスト分画酵素および転写・RNA阻害剤を含む溶液Aを20 milliliters、直径9 centimeterの丸型ペトリ皿に満たします。次に、ここに示すサンプルなどのように、単一の葉以上のサンプルを含む場合に、目的の葉の材料を採取します。葉を最大15枚まで重ねて配置します。その後、カミソリを使用して、葉を1 mm幅の帯状に切断します。フラットピンセットを用いて、葉のストリップを速やかにペトリ皿に移します。ストリップをゆっくりと分離させ、その後、サンプルを2回、各回5分間真空浸潤させます。次に、ペトリ皿を室温で90 RPMに設定したオービタルシェーカーに置き、3〜4時間プロトプラスト化させます。インキュベーションの間、30分おきにピンセットで葉のストリップを互いに分離させてください。消化後、プロトプラスト溶液を70 micronのセルストレーナーを用いて50 milliliterチューブに穏やかにろ過します。これにより、葉のストリップが除去され、ストレーナーに保持されます。プロトプラストはろ過されてチューブに回収されます。次に、4 mLの溶液Aを用いて葉のストリップを穏やかにすすぎ、洗浄液を50 mLチューブで回収します。その後、プロトプラスト懸濁液を丸底チューブに移し、室温、300 ×gで5分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、上清を可能な限り丁寧に吸引し、その後、同様の遠心条件で5 mLの溶液Aを用いてプロトプラストを洗浄します。最後に、上層の浮遊物を除去した後、カット済みのP 1000チップを使用して、ソート直前に適切な量の溶液Aでプロトプラストを再懸濁します。カットしていないP 1000チップを使用して、プロトプラスト溶液中の凝集塊を分散させます。さらに、50 µmのナイロンフィルターを通してプロトプラストをソーティングチューブにろ過し、細胞をさらに分散させます。次に、細胞サンプリングノズルの詰まりを防ぐため、細胞懸濁液を適宜希釈します。最適なサンプリング条件を決定した後、488 nmのアルゴンレーザーを用い、580/30バンドパスフィルターの出力と530/40バンドパスフィルターの出力を比較して、GFP陽性のプロトプラストを特定します。GFP陽性のプロトプラストは、530 nmが高く、580 nmが低い集団として現れることに留意してください。低 530、低 580 の集団にある非 GFP プロトプラストに対し、死滅または死にかけているプロトプラストおよびデブリは高 580 の集団に現れます。蛍光顕微鏡によるソート済みプロトプラストの視覚化のため、ソート後のプロトプラストは直接 8 倍量以上の溶液 A にソートしてください。その後、遠心分離によりプロトプラストを濃縮します。プロトプラストを 8 倍量の溶液 A にソートし、回収して蛍光顕微鏡で観察することで、濃縮を確認できます。最初の画像は、孔辺細胞で GFP を発現する TP 382 細胞株の濃縮例を示しています。本手法を用いて得られた増幅前後の収量の例をこの表にまとめます。500 picogramsから50 nanogramsの間で得られた量は、ovation PICO WTAシステムによる増幅、およびそれに続く定量PCR、次世代シーケンシング、またはマイクロアレイによる分析に十分な量です。次の一連の画像は、上述の方法で単離および分取された、さまざまなプロトプラスト細胞株を示しています。これらの最初のプロトプラストは、KC 2 74の葉の横断切片から派生したものです。葉の観察により、GFPが維管束で発現していることが示されています。これらのプロトプラストはKC 4 64の葉から単離されており、KC 4 64の葉の横断面では、A dal表皮にGFPの発現が認められます。最終的に、これらのプロトプラストはTP 3 82の葉から誘導されたものであり、TP 3 82の葉において確認されました。ここでは孔辺細胞でGFPが発現しています。580±30 nmと530±40 nmのバンドパスフィルターからの出力を示す、典型的なFACS取得ドットプロットが表示されています。示されているソーティングゲートは、通常ソーティングに使用されるものです。阻害剤なしでプロトプラスト化したcoal fourの葉由来プロトプラストのこの最初のドットプロットは、530低値、580低値の単一の集団を示しています。一方、阻害剤存在下でプロトプラスト化した野生型coal fourの葉由来プロトプラストのこのドットプロットは、阻害剤によるストレスと脱色によって生じる580蛍光のシフトを示しています。これらのドットプロットは、それぞれKC seven four、KC 4 64、およびTP 3 82系統の葉由来プロトプラストのものです。これらのサンプルを阻害剤の存在下で分析したところ、GFPが高530・低580の集団に含まれていることが示されました。この代表的な定量的PCR実験では、まず各分画タイプからサンプルを回収しました。その後、Ovation PICO WTAシステムと定量的PCRを用いてサンプルの増幅を行いました。GFP特異的プライマーを用いて解析を行いました。表示されている値のうち、赤色は最高値、緑色は最低値を示しており、actin 2をリファレンス遺伝子として用いた平均値または単一値は黄色の水平バーで示されています。これらの結果は、分取した画分中のGFP細胞含量に関する光学的な評価を再検証したものです。530高 580低の集団は、測定可能なGFP発現レベルが最も高いことを示しました。一方で、530高 580高の集団は、GFP発現が約1000倍低く、530低 580低および530低 580高の集団は、コントロールの葉全体および未分別のプロトプラスト集団と同程度の低いGFP発現レベルを示しました。この手法を習得すれば、適切に実施することで、植物から分別の完了まで4〜5時間で終えることができます。この手順を行う際は、分別の精度を維持するために、常にセルソーターを監視し、必要に応じて再校正することが重要です。本手順を確認しました。異なる細胞型における遺伝子発現レベルを比較・対照するために、マイクロアレイ解析などの他の手法を用いることも可能です。本手法の開発により、現在は異なる発達段階における特定の葉細胞型での遺伝子発現を解析しており、これを農学プロジェクトで得られた葉全体のデータと比較する予定です。このビデオを視聴することで、蛍光活性化細胞分染（FACS）を用いて葉の単一細胞型を単離する方法について、十分に理解することができます。

cell-specific-analysis-arabidopsis-leaves-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶシロイヌナズナ葉の細胞特異的原生質体分離法。蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いてGFP発現細胞を高精度に分離し、遺伝子発現や代謝プロファイリングを可能にする植物システム生物学の重要技術です。

の細胞特異的な分析

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