植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

この方法は、細胞内のタンパク質をどのように処理できるかなど、植物分子生物学および細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、1つの発現ベクターで細胞融合タンパク質を共発現させる効率が高いことです。その手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるGuitao Zhongです。

まず、テキストプロトコールに記載されているように、DNA断片の分子クローニング用のプライマーを設計します。半独立性タンパク質発現カセットの構築に必要なDNA断片を、対応するプライマーおよび高忠実度ポリメラーゼを用いた標準的なPCR反応により増幅します。これらには、プロモーター、蛍光レポーター、標的遺伝子、およびターミネーターが含まれます。

1%アガロースゲルを使用したDNA電気泳動によるDNA分解とコンタミネーションを探して、ファーストラウンドPCR産物の品質を調べます。分光光度計でPCR産物を定量します。PCR産物の260ナノメートルと280ナノメートルでの読み取り値の比率は、1.6から1.8の間である必要があります。

同じタンパク質発現カセット用に設計されたDNAフラグメントを1本のPCRチューブで混合し、最終容量を5マイクロリットルにします。異なる発現カセットデータからのDNSの混合について。等しいと、リンクする必要のあるDNA分子の数が増えるため、DNAアセンブリの効率が低下します。

次に、15マイクロリットルの2xマスター混合物を5マイクロリットルのDNA混合物に加え、摂氏50度で60分間インキュベートします。半独立性タンパク質発現カセット全体を2回目のPCRで増幅します。最初のラウンド等温アセンブリ反応からの製品の0.5〜1マイクロリットルを最も外側のプライマーのテンプレートとして使用します。

50マイクロリットルの反応容量で1ユニットの高忠実度ポリメラーゼを30サイクル使用し、その後、68°Cで5分間延長します。次に、最終タンパク質発現バックボーンベクターPOC 18およびベクターCAMBIA 1300を、4ユニットの小さなものを最終的な10マイクロリットルの反応量に添加することにより、直鎖化する。これらのベクターは、タンパク質の一過性発現と遺伝子形質転換のために設計されています。

制限消化物を摂氏25度で1〜2時間インキュベートします。消化後、摂氏65度で20分間インキュベートすることにより、制限酵素を不活性化します。次に、タンパク質発現カセットと直鎖状最終ベクターの等モルDNA分子を混合して、5マイクロリットルの最終反応容量にします。

最後に、反応を15マイクロリットルの2倍マスターバッファーと混合し、摂氏50度で60分間インキュベートすることにより、DNA組換えの2回目のラウンドを実行します。衝撃用のタバコBY-2懸濁細胞を調製するには、真空圧を40ミリバールに設定して、30ミリリットルの3日間培養BY-2細胞を70ミリリットルのオートクレーブ滅菌濾紙にフィルターコレクトします。その間に、ペトリ皿にBY-2細胞液体培地を数滴加えます。

BY-2セルが付着した濾紙をペトリ皿に移します。シロイヌナズナの幼体植物を砲撃に備えるには、テキストプロトコルに詳述されているように、生後7日間のサンプル植物を準備します。次に、それらを新しい半強度のMSミディアムプレートの中央にある長方形に移して、砲撃の効率を高めます。

植物をプレートに移して配置するときは、植物が重ならないように注意してください。植物や組織の表面に半強度のMS液体培地を数滴加えて、水分を保持し、残りのステップで植物が乾燥するのを防ぎます。金粒子をプラスミドDNAでコーティングするには、まず金マイクロキャリア溶液を3分間完全にボルテックスします。

次に、新しい1.5ミリリットルのチューブに25マイクロリットルの金粒子を追加し、10秒間渦巻きます。10マイクロリットルあたり25.46ミリグラム/リットルのスペルミジンを加え、10秒間渦巻きます。次に、1マイクロリットルプラスミドDNAにつき1マイクログラムを5マイクロリットル加え、3分間ボルテックスします。

最後に、25マイクロリットルの塩化カルシウム溶液1リットルあたり277.5ミリグラムを加え、1分間ボルテックスします。ベンチトップ遠心分離機を使用して、金マイクロキャリアを最大速度で5秒間スピンダウンします。遠心分離後、ペレットを乱さないように慎重に上清からパイプで送り出します。

次に、ペレットを200マイクロリットルの無水エタノールで洗浄し、5〜10秒間ボルテックスしてペレットを再懸濁します。ゲインしたら、金マイクロキャリアを最大速度で5秒間スピンダウンし、エタノールを除去します。金粒子を18マイクロリットルの無水エタノールに再懸濁します。

次に、6マイクロリットルの粒子懸濁液を3つのマイクロキャリアの中央に分注し、自然乾燥させます。粒子衝撃を介してDNAを細胞や植物に転写するには、まず、テキストプロトコルに詳述されているように粒子送達システムを設定します。次に、アグロメディウムプレート上の細胞または植物を3つの異なる位置で3回砲撃します。

衝撃を受けた細胞や植物を植物成長チャンバー内の暗所に6〜72時間置いてから、蛍光シグナルを観察してください。植物成長チャンバーを24時間暗く、摂氏22度に設定します。幼若植物または浮遊細胞を従来のスライドガラスに移し、上部にカバースライドをそっと置き、標準的な共焦点レーザー走査型顕微鏡によるイメージングを行います。

テキストプロトコルに記載されている設定を使用して、GFPタグ付きタンパク質を485ナノメートルで励起し、525ナノメートルで蛍光を検出します。RFPタグ付きタンパク質の場合、585ナノメートルで励起し、608ナノメートルで検出します。最後に、テキストプロトコルに記載されているように、蛍光シグナルのコローカリゼーション比を計算します。

シロイヌナズナVSR-2とシロイヌナズナSCAMP4のタバコBY-2細胞における共発現は、粒子衝撃によって達成され、正しい局在を示しています。RFPシロイヌナズナVSR-2は、シロイヌナズナSCAMP4-GFPの原形質膜局在とは異なる点状パターンを示し、いくつかの細胞質の点状ドットを示します。また、シロイヌナズナSCAMP4-GFPとRFPシロイヌナズナVSR-2を共発現するシロイヌナズナトランスジェニック植物は、アグロバクテリアを介した形質転換によって作製されました。

根細胞と根毛細胞における2つのキメラタンパク質の共発現の細胞内局在が示されています。先行研究と一致して、トランスジェニックシロイヌナズナの治療は、RFPシロイヌナズナVSR-2標識プレバキュアコンパートメントを引き起こし、小さなリング状の構造を形成しました。一方、プレフォールジンA誘発シロイヌナズナSCAMP GFPによる治療は、トランスゴールドGネットワーク凝集を標識しました。

ネガティブコントロールとして、タバコBY-2細胞およびシロイヌナズナ根および根毛細胞において、画像収集の同じ設定を適用することにより、ほとんど自己蛍光シグナルが観察されない。この方法により、タンパク質の細胞内局在に関する洞察を得ることができます。また、タンパク質の方向性の研究にも適用できます。

その開発後、この技術は植物細胞生物学の分野の研究者への道を開きました。生きている植物細胞内のタンパク質の細胞内局在と空間的相互作用を便利にエクスポートするため。この手順に続いて、PET媒介形質転換や遺伝子交配などの他の方法を実行して、植物でいくつかの融合タンパク質を共発現する方法などの追加の質問に答えることができます。

砲撃での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常にアイプロテクターなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。