Name: 植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶ植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析。Arabidopsis thalianaの根細胞をFACSで単離し、scRNA-seqライブラリを構築する方法です。遺伝子発現の異質性を解明し、細胞内制御機構を詳細に理解できます。

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このプロトコルは、上海交通大学農生物学部のシングルセルマルチオミクス施設で設定され、中国国家自然科学財団(助成金番号32070608)、上海浦江プログラム(助成金番号20PJ1405800)、上海交通大学(助成金番号Agri-X20200202、2019TPB05)の支援を受けました。

以下のプロトコルは、次の根細胞タイプの蛍光および蛍光マーカーラインを持たないA. thaliana野生型(WT)種子用に最適化されています:木部極周環状細胞(J0121)、側根初期細胞、側根冠細胞(J3411)、内皮および皮質細胞(J0571)(図1A)。以前に発表された第14報告書に続いて、GATA23プロモーター駆動GFP構築物を野生型シロイヌナズナ植物に導入することによって生成された側根開始細胞マーカー株を除いて、すべてのマーカー株は市販の供給源(材料の表を参照)から入手した。
1.植物材料の調製
<ol><li>A. thaliana WT種子および蛍光マーカー系統種子を、室温で15分間回転インキュベーター内で20%漂白剤中でインキュベートすることにより滅菌する。</li>
	<li>種子を二重蒸留水(ddH2O)で3〜5回すすいでください。このステップは、滅菌済みのクリーンベンチで実行します。</li>
	<li>WTおよびレポーターラインシードを、0.8%寒天(w / v)15を含む半強度のムラシゲおよびスクーグ(MS)培地にプレートします。4°Cで2日間成層した後、植物を垂直に5日間(23°Cで16時間光)育てます。</li>
</ol>2.プロトプラスト
<ol><li>溶液Aおよび溶液Bと呼ばれるプロトプラスト溶液2,5を調製する(材料表を参照)。<ol><li>400 mM マンニトール、0.05% BSA、20 mM MES(pH 5.7)、10 mM CaCl2、および 20 mM KCl を含む溶液 A を調製 します (材料表を参照)。溶液Aを-20°Cで最大1ヶ月間保存します。</li>
		<li>溶液Aの新しいアリコートに1%(w/v)セルラーゼR10、1%(w/v)セルラーゼRS、1%(w/v)ヘミセルラーゼ、0.5%(w/v)ペクトリアーゼ、および1%(w/v)マセロチームR10を加えて、溶液Bを調製します。</li>
	</ol></li>
	<li>実験を開始する前に、溶液Aと溶液Bを氷上で静かに解凍します。</li>
	<li>きれいな刃やハサミで根を切り落とし、根を~0.5cmに切ります。根を1.5 mLの溶液Bに浸し、続いて室温で1.5〜2時間穏やかに回転(約18 rpm)します。</li>
	<li>ルートプロトプラストを40 μmのストレーナーメッシュでろ過します(材料表を参照)。</li>
	<li>ストレーナーメッシュを1〜2 mLの溶液Aですすぎます。</li>
	<li>ステップ2.4とステップ2.5の液体を混ぜ合わせ、300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清をピペットで廃棄し、細胞ペレットを500〜600 μLの溶液Aに再懸濁し、すぐに氷上に置きます。</li>
	<li>再懸濁した細胞溶液を新しい5 mL試験管に移し、細胞を選別します。</li>
</ol>3. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)
<ol><li>スイッチを入れて、ソーターで機器のセットアップ手順を完了します( 材料表を参照)。蛍光チャンネルを選択し、WTプラント(蛍光なし)をコントロールとして使用して自家蛍光のベースラインを決定し、蛍光強度とFSC/SSCシングレットに基づいてソーティングゲートを調整します(図2)。</li>
	<li>500 μLの溶液A(ステップ2.1.1)を1.5 mLの収集チューブに加えて、細胞の損傷を防ぎます。チューブあたり2,000〜3,000個の細胞を収集します。</li>
	<li>選別後、直ちにサンプルを氷上に置き、細胞を入れた回収チューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、ピペットで上清を除去した。</li>
	<li>選別した細胞を2 μL採取し、蛍光顕微鏡を使用して蛍光を確認します( 材料表を参照)。</li>
	<li>ソートしたセルを-80°Cで保存するか、すぐにライブラリの構築に使用します(ステップ4)。</li>
	<li>シングルセルインデックスソーティングの場合は、96ウェルプレートをアダプターに入れます。液滴がプレートの中央の穴に落ちるようにプレートの位置を調整します。ソート時に単一セルソートモードを選択し、ソートされたセルの目標数を1として入力し、ソートを開始します。</li>
</ol>4. スマートシーク2ライブラリの準備
<ol><li>超低入力の結果、汚染のない環境でシングルセル型RNA-seqライブラリ構築を行うことができます。実験を開始する前に、表面除染剤8 ( 材料表を参照)と75%エタノールでベンチを清掃してください。</li>
	<li>0.33 μLの10%Triton X-100、0.55 μLのRNase阻害剤、および0.22 μLの0.1 M DTTを組み合わせて、溶解バッファー(混合物A)(表1)を調製します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>選別したサンプルに混合物Aを1 μL加え、滅菌乳棒で粉砕します。好ましいサンプル容量は≤0.5μLです。RNaseフリーの水を使用して、容量を14 μLに構成します。 各単一細胞サンプルを0.2 mLの薄肉PCRチューブに移します。</li>
	<li>0.44 μLのオリゴdT 30 VN逆転写(RT)反応プライマー(100 μM)および4.4 μLのdNTP(10mM)を含む混合物Bを調製します(表2)( 材料の表を参照)。</li>
	<li>各チューブ内の14 μLのサンプルに4.4 μLの混合物Bを加え、ピペットで穏やかにサンプルを混合し、サンプルを72°Cで3分間インキュベートします。インキュベーション後、直ちにサンプルを氷上に置いて、オリゴ-dTをポリAテールにハイブリダイズさせる。</li>
	<li>逆転写反応混合物(混合物C)(表3)を準備する( 材料表参照)。サンプルを含む各チューブに21.6 μLの混合物Cを追加します。一般的なPCR機器でRTプログラムをオンにします(表4)。</li>
	<li>氷上でプリアンプ反応を行う。44 μLの2x PCRポリメラーゼミックスと0.88 μLのIS PCRプライマー(10 μM)を組み合わせて混合物Dを調製します(表5)( 材料の表を参照)。40.8 μLの混合物Dを40 μLのRT反応生成物に加え、プリアンププログラムを実行します(表6)。</li>
	<li>Ampure XPビーズを使用してプリアンプ反応生成物を精製します( 材料の表を参照)。ステップ4.7の各サンプルに48 μLのビーズ(0.6:1の比率)を加え、ピペッティングでサンプルを穏やかに混合します。</li>
	<li>サンプルを室温で10分間インキュベートします。サンプルを含む1.5 mLチューブを磁気分離スタンドに5分間置きます。ビーズを乱すことなく、サンプルから上清を慎重に廃棄します。</li>
	<li>ビーズを200 μLの80%エタノールに再懸濁して洗浄し、エタノール含有上清を廃棄する前に、サンプルをさらに3分間磁気分離スタンド( 材料の表を参照)に置きます。</li>
	<li>サンプルを10分間風乾し、空気乾燥中の汚染や相互汚染を防ぐためにチューブを覆います。</li>
	<li>ビーズを20 μLのddH2Oに再懸濁し、サンプルを室温で5分間インキュベートした後、磁気分離スタンドに5分間置きます。</li>
	<li>各チューブから18 μLの上清をピペットで取り出し、サンプルを新しい1.5 mL遠沈管に移します。1 μLのサンプルを使用して、DNA定量キットを使用してcDNAの品質を評価し、フラグメントアナライザー( 材料の表を参照)を使用して各プレライブラリのサイズ分布を決定し、残りのサンプルを-20°Cで保存します。</li>
	<li>シーケンシングライブラリ調製キットを使用して、ステップ4.13のプレライブラリ製品からIlluminaシーケンシング16用のcDNAライブラリ8を構築します(材料表を参照)。</li>
	<li>Ampure XPビーズを使用してライブラリを精製し(ステップ4.14から)、精製されたライブラリを定量し、ステップ4.13に従って各ライブラリのサイズ分布を決定します。 注:各ライブラリのナノモルを均等にプールし、イルミナインデックスの同じ組み合わせを持たないようにします。それ以外の場合は、ライブラリを目的のシーケンシング出力に基づく比率でプールし、イルミナシーケンサーの同じレーンで一緒にシーケンスすることができます。一般に、各ライブラリを4〜6 GBの深さまでシーケンシングすると、1,000万>のマップリードが得られ、 シロイヌナズナ ゲノムの20倍から30倍のカバレッジが得られます。より低いシーケンシング深度も許容されますが、発現差解析の有意性に影響を与える可能性があります。</li>
</ol>5. RNA配列データ解析
<ol><li>Trim-Galore17を使用して生のリードをトリミングし、続いてhisat2 18(daehwankimlab.github.io/hisat2)を使用して参照ゲノムにマッピングし、Picard19(broadinstitute.github.io/picard)を使用してPCR複製フラグメントを削除します。</li>
	<li>各試料について少なくとも3つの生物学的反復を用いてDESeq220 を用いて差次発現遺伝子(DEG)の生計数処理およびその後の分析を行う。Pheatmapパッケージを使用して遺伝子発現のクラスタリングを実行し、発現ヒートマップで視覚化します。 注:遺伝子とTE(転移要素)のRPKM(100万マップリードあたりのキロ塩基あたりのリード)値は、Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie)で計算され、ゲノムブラウザで視覚化されました。</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).</li>
<li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li>
<li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li>
<li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li>
<li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%26T-seq%3A+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li>
<li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+aux%2FIAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li>
<li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li>
<li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li>
<li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510(2017).</li>
<li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT%2C+StringTie+and+Ballgown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li>
<li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAsik%3A+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Open+Source+Software%22%5BJournal%5D)">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583(2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li>
<li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li>
<li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139(2016).</li>
<li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li>
<li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667(2020).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

Smart-seq2ベースのプロトコルは、数百のセルから信頼性の高いシーケンシングライブラリを生成できます8。出発物質の品質は、トランスクリプトーム解析の精度に不可欠です。FACSは目的の細胞を調製するための強力なツールですが、この手順、特にプロトプラストステップは、植物用途に最適化する必要があります。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)または手動解剖細胞も入力として使用することができるため、ここで提供されるプロトコルは、既知のマーカー遺伝子の有無にかかわらず、さまざまな植物種および細胞タイプで使用できる可能性があります。
植物材料の調製 植物発生生物学において、FACSは通常、蛍光マーカーを発現する濃縮細胞集団を単離するために使用されます。このようなマーカーを発現する植物はプロトプラストされ、プロトプラストは最終的に細胞型特異的マーカーの発現に基づいて純粋な亜集...

細胞はすべての生物の基本単位であり、構造的および生理学的機能を果たします。多細胞生物の細胞は見かけのシンクロニシティを示しますが、異なる種類の細胞や個々の細胞は、発生中のトランスクリプトームと環境応答に違いを示します。ハイスループットシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、細胞の不均一性を理解するための前例のないパワーを提供します。scRNA-seqを植物科学に応用することは、植物細胞アトラスの構築に成功し1、植物組織2の希少な細胞分類群の同定に使用され、植物組織における細胞タイプの組成に関する洞察を提供し、細胞同一性と植物の発生および分化に使用される重要な機能を特定するために使用されてきました。さらに、植物組織1,2,3における時空間発生軌跡を推測して新しいマーカー遺伝子を発見し4、scRNA-seqを用いて重要な転写因子5の機能を研究することで、異なる植物における同じ細胞種の進化的保存を明らかにすることができます3。.非生物的ストレスは、植物の成長と発達に対する最も重要な環境影響の一つです。シングルセルトランスクリプトームシーケンシングを通じて、さまざまな処理条件下での植物組織の細胞タイプの組成の変化を調べることにより、非生物的ストレス応答メカニズムを解明することもできます6。
scRNAシーケンシングを使用して細胞タイプ間の転写不均一性を解決できる可能性は、細胞分離方法とシーケンシングプラットフォームによって異なります。蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、光散乱と細胞の蛍光特性に基づいてscRNA-seqの細胞の亜集団を単離するために広く使用されている技術です。トランスジェニック技術による蛍光マーカー株の開発により、FACS7による細胞単離の効率が大幅に向上しました。Smart-seq28を用いてscRNA-seqを実施すると、細胞の不均一性を解剖する能力がさらに高まります。Smart-seq2法は遺伝子検出感度が高く、転写物入力量が少ない場合でも遺伝子を検出できます9。バルクセルタイプの収集に加えて、最新のセルソーターはシングルセルインデックスソーティングフォーマットを提供し、Smart-seq210またはCEL-seq211などの他のマルチプレックスRNA-seqメソッドを使用してシングルセル分解能でトランスクリプトーム解析を可能にします。シングルセルまたはセルタイプのソーティングは、並行マルチオミクス研究など、他の多くのダウンストリームアプリケーションに使用できる可能性があります12,13。ここでは、FACSによってシロイヌナズナマーカー細胞株の根から木部極周回細胞、側根冠細胞、側根初期細胞、皮質細胞、内胚葉細胞などの植物細胞タイプを単離するための堅牢で汎用性の高いプロトコルを紹介します。このプロトコルには、ダウンストリームトランスクリプトーム解析用のSmart-seq2ライブラリの構築もさらに含まれます。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上mストレーナー</td><td>ソルファ&nbsp;</td><td>622110</td><td></td></tr>寒<tr><td>天</td><td>Yeeasen</td><td>70101ES76</td><td></td></tr><tr><td>Agilentフラグメントアナライザー</td><td>Aglient</td><td>Aglient 5200</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 高感度DNAキット</td><td>Aglient</td><td>DNF-474-0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP ビーズ</td><td>BECKMAN</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Betaine</td><td>yuanye</td><td>S18046-100g</td><td></td></tr><tr><td>漂白</td><td>剤 Mr Muscle</td><td>FnBn83BK</td><td>20% (v/v) 漂白剤</td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>yuanye</td><td>S24109-500g</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ R10</td><td>ヤクルト (日本)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ RS</td><td>ヤクルト (日本)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ (1.5 mL)</td><td>エッペンドルフ</td><td>30121589</td><td></td></tr><tr><td>DNase、RNase、DNAおよびRNAアウェイサーフェス除染剤</td><td>Beyotime</td><td>R0127</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (0.1 M)</td><td> invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>100092680</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD FACS Melody</td><td>BD-65745</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Sony</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ&nbsp;(1000 &マイクロ;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ&nbsp;(200 & マイクロ;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF140-200-Q</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ (10 & micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF104-10-Q</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ (100 &micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>4次元回転ミキサー</td><td>Kylin -Bell</td><td>BE-1100</td><td></td></tr><tr><td>ヘミセルラーゼ</td><td>sigma</td><td>9025-56-3</td><td></td></tr><tr><td>IS PCR プライマー</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'KAPA</td></tr> <tr><td>HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td><td>ロシュ&nbsp;</td><td></td><td></td>7958935001</tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R10</td><td>Yakult (Japan)</td><td>9032-75-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic separation stand</td><td>invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>aladdin</td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>aladdin</td><td>145224948</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>元ye</td><td>R21455-500ml</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>遠心分離機 5425</td><td></td></tr><tr><td>マイクロミニ遠心分離機</td><td>Titan</td><td>Timi-10k</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td><td>illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>oligo-dT30VN プライマー</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3'PCR</td></tr> <tr><td>instrument</td><td>サーマルサイクラー</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>ペクトリアーゼ</td><td>ヤクルト (日本)</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>植物マーカーライン</td><td>ノッティンガムシロイヌナズナストックセンター (NASC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td><td>invitrogen</td><td>Q33231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td>invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Solution A</td><td></td><td></td><td>400 mM マンニトール、0.05 % BSA、20 mM MES (pH5.7)、10 mM CaCl2、20 mM KCl</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>1 % (w/v)セルラーゼ R10、1 % (w/v) セルラーゼ RS、1 %&nbsp;(w/v)ヘミセルラーゼ、0.5 %&nbsp;(w/v)ペクトリアーゼと1 %&nbsp;(w/v)マセロザイムR10は、溶液A滅菌</td></tr><tr><td>乳棒</td><td>BIOTREAT</td><td>453463</td><td></td></tr><tr><td>ストレーナー(40&micro;m )</td><td>ソルファ&nbsp;</td><td>251100</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 逆転写酵素 (200 U/&micro;L)</td><td>invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV バッファー (5x)</td><td>invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>試験管 (5 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>キャップ付き薄肉 PCR チューブ (0.5 mL)</td><td>AXYGEN</td><td>PCR-05-C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600198-0500</td><td></td></tr><tr><td>TSO プライマー</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'</td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>タイタン</td><td>VM-T2</td><td></td></tr></tbody></table>

植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

多細胞生物では、発生プログラミングと環境応答は、異なる細胞タイプまたは細胞内でさえ非常に異なる可能性があり、これは細胞の不均一性として知られています。近年、次世代シーケンシング(NGS)技術と組み合わせたシングルセルおよびセルタイプの分離は、シングルセル分解能で生物学的プロセスを研究するための重要なツールになっています。しかしながら、植物細胞壁が存在するため、植物細胞を単離することは比較的困難であり、それは植物における単一細胞アプローチの適用を制限する。このプロトコルは、植物細胞による蛍光活性化セルソーティング(FACS)ベースのシングルセルおよびセルタイプの分離のための堅牢な手順を説明しており、ダウンストリームのマルチオミクス解析やその他の研究に適しています。 シロイヌナ ズナの根蛍光マーカー株を用いて、木部極周回細胞、側根初期細胞、側根冠細胞、皮質細胞、内胚葉細胞などの特定の細胞種がどのように分離されるかを示します。さらに、Smart-seq2を用いた効果的なダウンストリームトランスクリプトーム解析法も提供します。細胞単離法とトランスクリプトーム解析技術は、他の細胞種や植物種にも適応でき、植物科学に幅広い応用の可能性を秘めています。

プロトプラスト単離 このプロトコルは、蛍光 A.タリアナ 根マーカー株のプロトプラストソーティングに有効です。これらのマーカー株は、蛍光タンパク質と標的細胞型で特異的に発現する遺伝子との融合、またはエンハンサートラップ株の使用によって開発されました(図1)。多数の組織や臓器が、モデル植物や作物で特定の蛍光マーカーを発現する細胞型に解剖されています。
FACSポピュレーション、ソートされたセル、およびライブラリQC 野生植物を対照とし、前方散乱(FSC)や側方散乱(SSC)などのゲートを設定することで、目的の細胞の主要な集団と自家蛍光のベースラインを決定し、蛍光特異的なマーク細胞の選別に成功しました(図2)。最終的なシーケンシングライブラリの品質(ステップ4.15から)は、フラグメントサイズ分布分析によって決定されました。約2,000個の木部極周回細胞、側根原基細胞、内...

ハイスループットscRNA-seqメソッドの実現可能性と有効性は、植物研究におけるシングルセル時代の到来を告げるものです。ここでは、シ ロイヌナズ ナの根の特定の細胞タイプを単離し、その後のトランスクリプトームライブラリの構築と解析を行うための堅牢で完全な手順を紹介します。

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

単一細胞または細胞タイプのトランスクリプトーム解析は、不均一性によってマスクされる遺伝子発現の微妙な違いを検出することができ、これは精巧な細胞内制御メカニズムを明らかにするための強力なツールです。蛍光活性化セルソーティングとそれに続くRN-seq解析は、高い転写物検出感度と他のマルチオミクスアプローチとの互換性を備えたシングルセルまたはバルクセルタイプモードで実行できます。このプロトコルを初めて使用する場合は、プロトプラストのソーティングとRNA-seqライブラリの準備のいくつかのステップに注意を払う必要があります。Jun Zhangとともに、私たちの研究室のポスドクであるRongrong Xie博士が手順のデモンストレーションを支援します。まず、シロイヌナズナ野生型と蛍光マーカーラインの種子を20%漂白剤に入れ、回転インキュベーターを使用して室温で15分間インキュベートし、種子を殺菌します。滅菌ベンチで作業しながら、種子を二重蒸留水で3〜5回すすいでください。野生型とレポーターラインの種子を、体積あたり0.8%の重寒天培地で半強度のMS培地にプレートします。摂氏4度で2日間植物を層別化する。次に、16時間の光と18時間の暗のサイクルの下で、摂氏23度で5日間垂直に育てます。実験の前に、溶液Aおよび溶液Bと呼ばれるプロトプラスト溶液を氷上で穏やかに解凍します。きれいな刃またははさみを使って植物から根を切り取り、根を約0.5センチメートルに切り刻みます。刻んだ根を1.5ミリリットルの溶液Bに浸し、続いて室温で1.5〜2時間穏やかに回転させる。得られた根のプロトプラストを40ミクロンのストレーナーメッシュでろ過し、メッシュを1〜2ミリリットルの溶液ですすぎます A.合わせたろ液を300 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を捨て、細胞ペレットを500〜600マイクロリットルの溶液Aに再懸濁し、直ちに氷上に置きます。細胞選別のために、再懸濁した細胞溶液を新しい5ミリリットルの試験管に移します。シース液タンクを満たし、廃棄物タンクを確認します。次に、蛍光活性化セルソーティングまたはFACSマシンの電源を入れます。ソーターで機器のセットアップと自動キャリブレーションの手順を実行します。蛍光チャンネルを選択し、蛍光のない野生型植物をベースラインコントロールとして使用します。蛍光強度と前方散乱および側方散乱シングレットに基づいてソーティングゲートを調整します。500マイクロリットルの溶液Aを1.5ミリリットルの収集チューブに加えた後、選別を開始し、チューブあたり2, 000〜3, 000セルを収集します。選別後、すぐにサンプルを氷の上に置きます。細胞を含む回収チューブを300G、摂氏4度で5分間遠心分離し、ピペットで上清を除去します。2マイクロリットルの選別された細胞を取り、蛍光顕微鏡を使用して蛍光を確認します。ソートされたセルをすぐに使用しない場合は、摂氏マイナス80度で保管します。シングルセルインデックスソーティングの場合は、メンブレン付きの96ウェルプレートをアダプターに入れます。液滴がプレートの中央の穴に落ちるようにプレートの位置を調整します。96 ウェル・プレートからメンブレンを取り外し、96 ウェル・プレートをアダプターに入れます。並べ替え時に単一セルの並べ替えモードを選択します。ソートされたセルの目標数を1つとして入力し、ソートを開始します。実験を開始する前に、表面の除染剤と75%エタノールでベンチを清掃してください。すべての機器は、シーケンシングライブラリの準備にのみ使用してください。選別したサンプルに1マイクロリットルの新たに調製した混合物Aを加えた後、滅菌乳棒で粉砕する。RNAseフリー水を使用して、容量を14マイクロリットルに構成します。次に、各サンプルを0.2ミリリットルの薄肉PCRチューブに移します。次に、混合物Bを準備し、サンプルを含む各PCRチューブに混合物Bの4.4マイクロリットルを追加し、穏やかなピペッティングで混合します。サンプルを摂氏72度で3分間インキュベートします。インキュベーション後、直ちにサンプルを氷上に置いて、オリゴdTをポリAテールにハイブリダイズさせる。逆転写反応混合物または混合物Cを21.6マイクロリットルで調製し、サンプルを含む各チューブに。逆転写プログラムに従って、一般的なPCR機器でサンプルを逆転写反応にかけます。新たに調製したプレアンプ反応混合物または混合物Dを逆転写反応産物に40.8マイクロリットル加え、プレアンププログラムを実行します。増幅サイクルは、反応が指数関数的段階に入ったばかりのときの定量的PCRによって決定できます。プレアンプ反応産物を精製するには、プリアンプ産物をPCRチューブから1.5ミリリットルチューブに移します。48マイクロリットルのAMPure XPビーズを各サンプルに加え、インキュベーション前にピペッティングで穏やかに混合します。サンプルとビーズを入れた1.5ミリリットルのチューブを磁気分離スタンドに5分間置きます。ビーズを乱すことなく、サンプルから上清を慎重に廃棄します。それらを200マイクロリットルの80%エタノールに再懸濁した後、さらに3分間磁気分離スタンドに置きます。エタノール含有上清を捨てた後、サンプルをチューブ中で10分間風乾する。ビーズを20マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水に再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。次に、それらを磁気分離スタンドに5分間置きます。ピペットを使用して、各チューブから18マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルの遠沈管に移します。最後に、本文に記載されている手順に従ってプレライブラリの特性評価を行い、ライブラリの構築、精製、定量を行います。蛍光性シロイヌナズナマーカー株は、蛍光タンパク質と標的細胞型に特異的に発現する遺伝子を融合させること、またはエンハンサートラップ株を用いて開発されました。蛍光特異的にマーキングされたプロトプラストは、蛍光強度と前方散乱および側方散乱一重項に基づいて正常にソートされました。選別された細胞を明視野および蛍光イメージングを用いて可視化した。約2,000個の木部極周回細胞、側根始原細胞、内皮または皮質細胞、および側根冠細胞のRNAシーケンシングライブラリの代表的な結果が示されている。プライマーまたはアダプターの二量体ピークを含む小さなサイズのライブラリでも、サイズ選択後に配列決定することができます。異常なサイズ分布を持つライブラリーは、ライブラリーの準備に失敗したことを示しています。遺伝子発現パターンを解析した。4つの根細胞タイプのいずれかで濃縮された遺伝子をクラスター化し、異なる細胞タイプ間の遺伝子発現の特異性を示すヒートマップに示しました。正しいゲーティングとソーティング、RNA分解の防止による標的細胞の高品質と純度は、ライブラリ構築を成功させるための鍵です。シングルセルモードのRNA-seqについては、ユニークな分子識別子と統合されたいくつかの方法が最近報告されており、パフォーマンスが大幅に向上しています。

isolation-and-transcriptome-analysis-of-plant-cell-types

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

植物材料から、特定の種​​類の細胞を単離する方法が示されている。この手法は、特定の細胞型、細胞の解離と蛍光活性化細胞選別に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマーカーラインを採用しています。さらに、成長のセットアップがの治療を容易にするここで確立されている...

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

この記事では、ラット初代ニューロン培養とaRNAの増幅を使用して、その後のトランスクリプトーム解析から単一細胞の収穫のための簡単​​な方法を説明します。このアプローチは、任意の細胞型への一般化です。...

単一細胞のトランスクリプトーム解析

ここでは、転写プロファイリングのための特定の植物細胞タイプのレーザー支援マイクロダイセクションのためのプロトコルを提示します。このプロトコルはさまざまな種や細胞タイプに適していますが、焦点は、アブラナ科Boechera属の有性生殖およびアポミティック生殖に重要な雌性生殖細胞の非常にアクセスしにくい細胞にあります。...

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。...

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

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我々 は生きているセルで複雑な規制とシグナル伝達メカニズムを研究するダイズプロトプ...

簡便な分離大豆プロトプ ラストと一過的遺伝子発現解析への応用

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細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

ここに示されているのが、植物組織のレーザー捕捉マイクロ解剖(LCM)のプロトコルです。LCMは、汚染のない方法で組織の領域を単離するための顕微鏡的な技術です。手順は、組織固定、パラフィン埋め込み、切片、LCMおよびRNA抽出を含む。RNAは、下流組織特異的な、一時的に分解されたトランスクリプトムの分析に使用される。...

植物における空間的および時間的組織特異的な遺伝子発現解析のためのレーザー捕捉マイクロ解離RNAシーケンシング

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シロイヌナズナロゼットを用いた葉表面とアポプラスドRNAの単離と解析の段階的ガイド

嵌合と四分子の分離は、遺伝子分析のために必要です。...

交配との四分子の分離クラミドモナス遺伝子解析用

学ぶ植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析。Arabidopsis thalianaの根細胞をFACSで単離し、scRNA-seqライブラリを構築する方法です。遺伝子発現の異質性を解明し、細胞内制御機構を詳細に理解できます。

植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析

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