ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

この手順の目的は、細菌毒素に対する免疫細胞の応答を視覚化することです。まず、毒素はBL21金細胞で発現し、BL21金細胞から精製されます。毒素の活性と濃度が確認されると、毒素は免疫細胞に送達されます。

マイクロインジェクターを用いて、高速生細胞顕微鏡法を行います。得られた画像の解析により、毒素に対する免疫細胞の応答のリアルタイムの動態が明らかになりました。この方法は、インフラマソームの活性化のメカニズムなど、免疫学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

この方法は、毒素を介した免疫細胞応答についての洞察を得ることができますが、走化性トラクターを含む他の刺激にも適用できます。この方法のアイデアは、細菌と培養免疫細胞との相互作用を研究し、細菌と免疫細胞との間の非常に多様な相互作用を観察したときに最初に思いつきました。PAG three SLOを含むBL 21金細胞の培養により、連鎖球菌リジンOまたはSLOの精製を開始します。

彼のプラスミドはOD約0.6に成長しました。タンパク質発現を誘導するには、5ミリリットルの20%のOSを培養物に加え、室温で2〜25RPMで3時間振とうします。次に、バクテリアを500ミリリットルの遠心分離ボトルに移します。

次に、スピンデカントに続いて、12, 000倍Gで4°Cの12分間培養物を回転させます。仰臥位は、ペレットを摂氏マイナス80度で一晩または必要に応じてそれ以上保存します。発現したSLOを精製するには、Triton X 100リゾチームとフェニルメチルスルフリルフッ化物を添加した10ミリリットルの洗浄バッファーを凍結ペレットピペットに約15分間上下に添加します。

Resusには、サンプルを氷上に保持してペレットを一時停止します。再懸濁したペレットを50ミリリットルのオークリッジ丸底ポリプロピレンチューブに移します。プローブを使用してライセートを40%出力で超音波処理し、30秒間隔で30秒間隔で5回、氷上で30秒間隔

次に、超音波処理溶解物をGの39,000倍で4°Cの20分間回転させます。スピン後、洗浄したニッケルNTAアロス1ミリリットルに細菌のすり酸を加えます。ニッケルNTAアロスとライセートを4°Cで2.5時間一緒にインキュベートし、インキュベーション後、穏やかに振とうします。

ビーズをGの400倍で4°Cで5分間回転させてペレット状にします。その後の洗浄と溶出はすべてこれらの遠心分離設定で行われ、特に記載は少ないことに注意してください。遠心分離後。

30マイクロリットルの仰臥位と10マイクロリットルの4倍のSDSサンプルバッファーをマイクロ遠心チューブに組み合わせ、純度分析のために氷上に保存します。次に、残りの仰臥位剤を廃棄し、シラミ洗浄バッファーでビーズを4回洗浄します。そして、この時点から先は、各洗浄の間に塩緩衝液を遠心分離することに興味を持たせ、常に氷上にサンプルを保つようにしてください。

SLOは非常に酸化還元感受性タンパク質であり、摂氏37度まで温まると、たとえ短時間であっても急速に活性を失います。SLOタンパク質を溶出するには、1ミリリットルの溶出バッファーと5マイクロリットルの1モルDTTをビーズに加え、氷上で10分間インキュベートします。次に、遠心分離機にかけ、elucian番号でラベル付けされたフュージチューブに仰过液を回収します。

このプロセスを3回繰り返して、SLOタンパク質からエンドトキシンを枯渇させ、200マイクロリットルの洗浄ポリ混合共役アグロビーズ、懸濁したres塩緩衝液をサンプルに加え、摂氏4度で30分間振とうします。次に、Gの10,000倍で摂氏4度で1分間回転します。スピン後、上清を新しい標識マイクロ遠心チューブに集めます。

各溶出液の30マイクロリットルを10マイクロリットル、4倍のSDSサンプルバッファーと組み合わせます。SDS ページ分析の場合は、SLO ソリューションを氷上に保存します。タンパク質濃度と溶血活性が十分であれば測定し、SLOWEを5〜10マイクロリットルのクォートで引っ張った後、ドライアイスで凍結して摂氏マイナス80度で保存します。

次に、特定の溶解を決定します。リース。試験する細胞を2回浮遊させます。ミリリットルあたり6個のセルを、ミリリットルあたり20マイクログラムのバッファーRBの中央に配置します。

ヨウ化プロピジウム。ここでは、T 27 A細胞がテストされます。96ウェルVボトムプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞を別々のマイクロ遠心チューブで追加します。

SLOをバッファーrbの最終濃度の2倍に連続希釈します。次に、100マイクロリットルの毒素または100マイクロリットルの緩衝RBを細胞に加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。典型的な最終濃度は、ミリリットルあたり2000単位からミリリットルあたり31.25単位の範囲です。

フローサイトメーターで細胞を泳動し、fi、セトリン、またはpeのフィルターでデータを収集します。1 log シフトは一過性透過性セルを表し、3 log シフトは死細胞を示します。実験プレートの1日前に、コラーゲンコーティングガラス上に5つのマクロファージを2倍の中心に置き、ここに示す式を使用して、実験からコントロール内の死細胞の割合を差し引くことにより、細胞の特異的溶解を計算します。

底35ミリ皿。毒素送達に使用される顕微鏡には、倒立ステージ、加熱ステージ、適切な励起発光フィルターキューブ、および可能な場合はバータンドレンズを装備する必要があります。この手順で最も難しい部分は、針を無傷で細胞に下ろすことです。

成功を確実にするために、通常は針を焦点面に通すときに針を視覚化するためのアライメントに使用されるベルトランレンズを使用します。顕微鏡はマイクロインジェクターに接続し、データを収集して保存するのに十分なメモリを備えたコンピューターで制御し、顕微鏡とマイクロインジェクターの電源を入れ、ステージが加熱されるのを待つ間、加熱されたステージ時間を摂氏37度まで温める必要があります。細胞を37°Cの色素で30分間標識します。

アッセイに応じて、標識は5マイクロリットルで行われ、1ミリリットルでAM4または2:00AM、HBSSまたは1ミリリットルのフル培地でAM2マイクロリットルのカルシウムAMが4つまたは2つ使用されます。細胞培地を取り出し、細胞をPBSで一度洗浄します。PBSを吸引し、2ミリモルの塩化カルシウムを補充した1ミリリットルのRPMIと交換します。

皿を顕微鏡に取り付け、明視野で細胞に焦点を合わせ、細胞の少し上に焦点を合わせるように調整します。次に、1マイクロリットルのSLO毒素4マイクロリットル、1ミリグラム/ミリリットル、DEXTRA 5 55、および6マイクロリットルの水を組み合わせます。次に、20, 000倍のGを摂氏4度の10分間遠心分離します。

デキストランは、フェムトチップがG詰まりしていないことを確認するために使用されます。マイクロローダーを使用して、2マイクロリットルの希釈毒素をフェムトチップに背面からロードします。フェムトチップをマイクロインジェクターにロードします。

次に、インジェクターの角度を調整して、チップが細胞の中心に寄り、すべての方向に動くスペースがあるようにし、マイクロインジェクターの先端がどれだけ低くなることができるかを制限するZ制限の以前の設定をクリアします。マイクロインジェクターを120PSIの背圧で0.5秒間注入するように設定します。次に、チップが媒体に入るまでチップを下げます。

ベルトランレンズを使用。先端を中央に配置し、先端が細胞に近づくにつれて先端をたどります。針の焦点が合わなくなったら、通常の光学系に戻します。

針の影は現場で明らかになるはずです。細胞の上の焦点を合わせ、焦点が合うまで針を下げます。次に、細胞に焦点を合わせ、針を細胞に慎重に隣接させます。

注射のZ制限を設定した後、イメージングを開始し、毒素を注入します。次に、針を上げて細胞の新しい領域に移動します。追加の毒素を注入し、注射後もイメージングを続けます。

このビデオで説明されている方法を使用して、針からの望ましくない毒素の漏れを防ぐために、針をホームポジションに移動します、1ミリリットルあたり10〜7〜10。SLOは通常、1ミリリットルあたり4ミリグラムのタンパク質濃度で得られます。このSDSページゲルは、精製後の毒素誘導セートの前後の細菌サンプルを示しており、3つのエルシアンカマシブルー染色のそれぞれにより、誘導されたSLOが成功したことが明らかになりました。

SLOは、T 27 AまたはD 2つの細胞の溶解に必要な毒素の量を決定するための69キロダルトンのバンドです。細胞にヨウ化プロピジウムの存在下で摂氏37度で5分間、さまざまな濃度のSLOを惹起し、フローサイトメトリーで調べました。ここに示すように、特異的な溶解は、示されているように決定しました。

ミリリットルあたり250ユニット。SLOは、T 27 AとDの両方の2つの細胞を50%溶解します。毒素の亜リチウム10%溶解用量は、ミリリットルあたり62.5単位になります。

これらの値は、毒素曝露後の細胞死を評価するためのベンチマーク毒素活性にとって重要です。ヒト真皮線維芽細胞は、Life Technologiesの生死キットを使用して、カルシウムおよびアテリウムホモダイマーとインキュベートされました。この画像 O.In、細菌毒素であるアントロリジンに局所的にさらされた後、カルシウムは緑色で示され、臭化アテリウムはマイクロバイオームに近い赤色の領域で示され、カルシウムの損失とホモダイマーの取り込みに代表される細胞死を示しますが、先端から離れた領域では損傷を示しません。

毒素の微小送達により、カルシウムフラックスなどのリアルタイムの事象を調べることもできます。午前4時2分にロードされたこれらのヒトDCは、一定の流量でSLOに曝露され、同時にライブイメージングが緑から青にシフトしました。疑似カラーは、細胞質カルシウムレベルの増加を示します。

SLOは、局所的な送達により、皿の領域を通じて伝播する細胞質カルシウムの急速な増加を誘発します。ただし、マイクロインジェクターの先端に近い細胞のみが反応器の毒素に遭遇します。これは、毒素に対する1つの細胞反応と、zdi次元のイベントを解決するための毒素送達の空間的に制限された領域の両方を示しています。

マイクロデリバリーは、高速3D共焦点顕微鏡と組み合わされました。この一連の画像は、毒素注入後の樹状細胞を示しています。それらは、抗CD11 Cを緑色で示したPCに結合して、原形質膜を標識するために事前にインキュベートしました。

ここで見られるように、微小胞は毒素の送達後に放出されます。細胞修復プロセスの一環として、毒素分子はブレブに集中し、ブレブは毒素を排除するために排出されます。マスターすれば、顕微鏡検査は45分で完了します。

この手順を試みるときは、細胞と混合する前に毒素を冷たく保ち、溶血活性をテストすることを忘れないでください。よし。このビデオを見れば、生細胞顕微鏡を使用して細菌毒素に対する免疫細胞の反応のリアルタイム動態を測定する方法について十分に理解できるはずです。