Name: ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: 学ぶ細菌毒素ストレプトリジンOの精製とライブセル蛍光顕微鏡を用いた免疫細胞応答の可視化法。マイロインジェクターによる局所投与でインフラマソーム活性化メカニズムをリアルタイム解析し、毒素生物学の新知見を得る。

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著者は、技術支援のSLOプラスミドとジョナサンフランクスの寛大な贈り物のためにanthrolysin O、マイケルCaparonの寛大な贈り物をリチャードレストに感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成T32CA82084（PAK）とR01AI072083（RDS）によって賄われていた。

1。ストレプトリジンO（SLO）の精製<ol><li> 0.5LのLBブロスにプラスミドpBADgIII SLOhis-9を含むBL21 GOLDの細胞を20mlの一晩培養物を接種し、500μlの50 mg / mlのアンピシリンを追加します。 37℃で225rpmで振とう培養し、OD 600 = 0.6になるまでには、通常1.5時間を〜。 10,000 5分xgで1 mlの細菌（T 0と見なされます）遠心し、140μlの1×SDSサンプルバッファー/ 1 ODでペレットを溶解し、タンパク質の純度分析用せん断DNAに超音波洗浄します。 </li><li>文化〜5mlの20％のアラビノースを添加して細菌を誘導し、3時間室温で225rpmで振とうする。細菌の1ミリリットルを収集し、純度分析用のT 3の時点について、上記の1×SDSサンプルバッファーで遠心し、溶解する。 </li><li> 500mlの遠心ボトルに残っている細菌を収集し、4℃（8500回転ソーバルGS-3ローター）で12分間、12,000×gで遠心する。必要であれば℃で一晩以上-80℃で上清、店舗ペレットをデカントします。 </li><li> frを再懸濁400μlの25パーセントのトリトンX-100、100μlの100 mg / mlのリゾチーム、50で補足10ミリリットル/洗浄溶解緩衝液（50mMのNaH 2 PO 4、300mMのNaCl、10mMイミダゾール、pH8.0）中で氷上ozenペレットμlの200 mMのフッ化フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）。 50ミリリットルオークリッジ管に再懸濁ペレットを転送します。 </li><li> 30秒間隔で、氷上で30秒間5回ライセートを超音波洗浄します。スピンは4℃（18,000 rpmのソーバルSS-34ローター）で20分間39000×gでオークリッジ管で溶解液を超音波処理した。 </li><li>ライセートが回転しているときに、4℃で5分間1200 rpmで洗う/溶解バッファーとスピン10mlで1ミリリットルNi-NTAアガロースを洗浄℃に（それ以降のすべての洗浄/溶出は、これらの条件下で遠心分離を使用します）。洗浄を吸引します。 </li><li>ステップ1.5からNi-NTAアガロースに細菌の上清を追加し、4℃で2.5時間穏やかに振とう℃、上清を回収するためにスピン。 10μ4X SDSサンプルバッファーで上清30μlを組み合わせると純度分析のために保存。洗浄/溶解緩衝液中で、オンビーズを4回洗うトリス/塩緩衝液（50mM Tris、300mMのNaCl、pH8.0）にCE。 </li><li> 、ビーズに1 mlの溶出バッファー（トリス/塩緩衝液中の250mMイミダゾール）および5μlの1Mのジチオスレイトール（DTT）を添加すること、氷上で10分間インキュベートし、紡績、上清を収集することにより、3回溶出する。 SLOは非常にレドックス感受性タンパク質であり、常に氷上に維持しなければなりません。でも、時間の短い期間に、37℃に加温した場合、一度減少し、タンパク質は急速にその活性を失うことになる。 </li><li>溶出緩衝液で500μlのポリミキシン共役アガロース、4℃で1分を500μlのCを再懸濁し、10,000 xgでスピンを洗う。エンドトキシンを枯渇させるために、それぞれの溶出に200μlのビーズを追加して、30分間、4℃を振る。 1 4時分℃、上清を保存し、10,000 xgでスピン。 SDS-PAGE解析のために、10μlの4X SDSサンプルバッファーで各溶出液30μlを兼ね備えています。 </li><li> SDS-PAGEによる溶出の純度をテストします。沸騰サンプルは5分間95℃でゲル解析するために保存し、10％ゲルで10μlをロードします。 GEを染色蛋白質を可視化するクマシー付きL（ 図2A）。 SLOは69 kDaである。 （典型的な収率は、最初の2つの溶出のために4 mg / mlのですが、使用する細菌株およびプラスミドによって異なる場合があります）タンパク質濃度を決定するために、ブラッドフォードアッセイを行う。 </li><li>それぞれの溶出の溶血活性をテストします（下記参照）。純度、濃度、溶血活性が良好であるプールの溶出。シングルユースのアリコート（通常5〜10μL）にアリコートSLOは、-80℃でドライアイスと℃で保存時にフリーズ</li></ol> 2。溶血アッセイ<ol><li> RBCアッセイ緩衝液（0.3％ウシ血清アルブミン（BSA）、2mMのCaCl 2、10mMのHepes、pH7.4）で5分間1200 rpmでスピンでヒツジ赤血球（RBC）を洗浄し、2.5％の赤血球における懸濁する10ミリリットルのRBCアッセイバッファー。 </li><li> /ウェル氷上で96ウェルV底プレートに10μlのRBCのアッセイバッファーを追加します。直列二連で各溶出を薄める。典型的な希釈範囲は1:512,000に1:1000である。 10でない毒素を持つ3つのウェルと3つのウェルを含むそれぞれ、最小と最大の井戸としてTriton X-100を2パーセントずつ。 </li><li> 37℃で30分間インキュベートし、プレートをカバーしています。 5分間1,200 rpmで遠心分離します。平底96ウェルプレートに上清70μlを。 405を読んでください。 1単位は、RBCの50％溶解するために必要な毒素の希釈である。毒素活性を1ユニット*希釈factor/0.01 mlである。 </li></ol> 3。細胞溶解アッセイ<ol><li>細胞を回収し、カウント、スピン。 2×10 6バッファR / B（2mMのCaCl 2を含むRPMI、0.5％BSA）および20μg/ mlのヨウ化プロピジウムで/ mlで再懸濁する。 96ウェルV底プレートに100μlの細胞を追加します。 </li><li>シリアルバッファR / Bで最終濃度が2倍にSLOを希釈し、細胞に100μlの毒素または100μlバッファR / Bを追加します。 5分間37℃でインキュベートするU / mlの2000から31.25 U / mlの最終濃度に典型的な範囲です。 </li><li>フローサイトメーター上でセルを実行し、フィコエリトリン（PE）のためのフィルタを使用してデータを収集します。 1ログシフトは一過透過処理セルを表しますLS 3ログシフトは死んだ細胞4を示している。次のように、実験（％PIの高い EXP）からの制御で死んだ細胞の割合（％PIの高い CTL）を差し引くことにより、細胞の特異的溶解を計算する：特異的溶解=（％PIの高い EXP - ％PIの高い CTL） /（100 - ％PIの高い CTL）* 100 </li></ol> 4。培養皿で細胞への毒素のマイクロピペットデリバリー<ol><li>コラーゲンコートガラスボトム35mmディッシュの実験は、プレート2×10 5のマクロファージへの1日前。 </li><li>顕微鏡やマイクロインジェクターをオンにします。加熱ステージ時間は37℃に温め許可顕微鏡の選択は、通常、ローカルで使用可能であるかに依存します。顕微鏡は、倒立ステージ37に選ばれた染料と、物理的に微量注入器を接続するためのスペースに適し℃、励起/蛍光フィルターキューブを皿を加熱することができる段階を必要とします。バートランドレンズマイクロインジェクションのために役立ちますが、必須ではありません。顕微鏡を駆動するコンピュータは、データを収集し、保存するための十分なメモリが必要です。 </li><li> 37℃染料で30分間標識細胞℃、アッセイに応じて、標識は、1ミリリットルのフルメディアにAM 1 mlのPBSまたは2μlのカルセインで午前5μlのFura2で行うことができる。 Fura2は、励起/発光は510分の340 nmと510分の380 nmのために収集され、380分の340の信号の比は、カルシウムフラックスを決定します。エチジウムホモは620分の525 nmで、APCは660分の650 nmである一方カルセインは、励起/発光は515分の495 nmである。他のラベルも同様に選択することができる。 </li><li> 2mMのCaCl 2を補充した1ミリリットルRPMIにPBSおよび場所で細胞を洗浄。顕微鏡にマウントします。 </li><li> 4℃、20,000×gで10分で毒素およびデキストラン水中で、遠心分離を薄める典型的には、1μlのSLOと4μlの10 mg / mlのデキストラン-555は6μlの水で希釈する。デキストランまたは別の蛍光液相分子は、フェムト先端が詰まっていないことを確認するために使用されており、麟蹄CTSは、必要に応じて。 </li><li> microloaderを使用して希釈された毒素の0.07μlの背面からフェムト先端をロードします。 </li><li>マイクロインジェクターにフェムト先端をロードします。先端はすべての方向に移動する部屋を有する細胞の中心上に座りますようにインジェクタの角度を調整します。 z軸の制限をクリアします。注入の設定は20psiの背圧は120 psiで0.5秒間注入する必要があります。それは、媒体に入るまで先端を下げる。 </li><li>バートランドレンズ、中央先端を使用して、それを細胞に近い下げられるように先端に従ってください。一度フォーカスを失い、通常の光学系に切り替えます。針の影は、フィールドには明らかであろう。セルの上でピントを合わせ、それが焦点になるまで、ニードルを下げてください。細胞上にバックフォーカスと慎重にセルに隣接する針を持参。注射用のz-limitを設定します。所望の位置に先端を移動し、撮影を開始し、所望の時点で毒素を解放するために注入する。針を上げ、細胞の新しい領域に移動して注入します。望ましくないことを防止するためにホームポジションに針を動かす針から毒素漏れ。 </li></ol>

<ol><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li>
<li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li>
<li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li>
<li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li>
<li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li>
<li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion%3A+Implications+for+inflammatory+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li>
<li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li>
<li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li>
<li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li>
<li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li>
<li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li>
<li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anthrolysin+O%2C+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

技術は細菌毒素に対する免疫細胞の反応の検査を可能にする、ここで説明。最も重要なステップは、毒素の取り扱いと投薬です。毒素活性はさらにそのもろさのために、同じ製剤の異なるアリコートの間、非常に可変にすることができます。これは、いずれかの基準セルラインや赤血球に対する毒素の各アリコートをテストする、または毒素のグラデーションを使用する必要が生じて。毒素勾配は、マイクロピペットなどで配信、リアルタイムで観察することが毒素による活動の完全なスペクトルを許可しますが、生化学的な解析には向いていません。 毒素のマイクロピペットの配信が困難な場合があります。標準のマイクロインジェクションとは異なり、細胞の浸透は、このアッセイでは必要ありません。実際には、注意が、これは似たような膜修復応答12を引き出すだろうとして、針自体で細胞を傷つけないように注意しなければなりません。免疫細胞では、特に、カルシウムフラックスはによって生成された針の接触は文化11内の他のセルにカーボンナノチューブを介して伝播する。注入していない細胞はまた、針の寿命を延長します。同様に、...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> Ni-NTAアガロース</td><td>キアゲン</td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td>ポリミキシン-アガロース</td><td>シグマ</td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba脱塩スピンCOL </td><td>フィッシャー</td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td>ヒツジ赤血球</td><td>フィッシャー</td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> refは9を参照してください</td></tr><tr><td> Cy5の単反応性染料</td><td> GEヘルスケア</td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td>カルセインAM / EThidiumホモダイマー</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td>抗CD11c-APC </td><td> BD Biosciences社</td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンコートガラスボトムディッシュ</td><td>マテック</td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td>フェムト先端II </td><td>フィッシャー</td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td>フィッシャー</td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td>デキストランアレクサ555 </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> Injectman NI 2 </td><td>エッペンドルフ</td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td>エッペンドルフ</td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>特定の試薬 ​​および設備を導入の表1。リストとソースENTが必要。会社とカタログ番号と一緒に、このプロトコルで使用される特定の機器や試薬は、記載されています。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> バッファ </td><td> 構図 </td><td> 使用されるステップ </td></tr><tr><td>溶解/洗浄</td><td>の50mMのNaH 2 PO 4 300mMのNaCl 10mMイミダゾール、pH8.0の</td><td> 1.4 </td></tr><tr><td>トリス/塩</td><td> 50mMのトリス、pH8.0 300mMのNaCl </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td>溶出緩衝液</td><td> 50mMのトリス、pH8.0 300mMのNaCl 250mMイミダゾール</td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> RBCアッセイバッファー</td><td> 0.3パーセントのBSA 2mMのCaCl 2 10mMのHEPES、pH7.4の</td><td> 2.1 </td></tr><tr><td>バッファR / B </td><td> RPMI培地細胞培養培地 2mMのCaCl 2 0.5％BSA </td><tD&gt; 3.1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>このプロトコルで使用されるバッファの表2。一覧。使用されるバッファは、その組成とは、プロトコルで使用されるときの最初のステップが記載されています。 </td></tr></tbody></table>

ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

細菌毒素は、細胞内容物と外部環境からの物質の流入の漏洩を可能に孔を形成し、膜中のコレステロールと結合する。セルは、アクティブ膜修復プロセスを必要とするこの侮辱から回復、または他の毒素曝露や細胞タイプ1の量に応じて、死ぬことができます。さらに、これらの毒素は、炎症性サイトカインの配列2を産生するマクロファージなどの免疫細胞の活性化を介して感染したホスト内の強い炎症反応を誘導する。多くのグラム陽性菌は、主に特徴づけられていないメカニズムを介してそれらの病原性に寄与することが示されているコレステロール結合毒素を産生する。 これらの毒素に曝露した細胞の形質膜における形態学的変化は本質的な細胞防御を示唆し、細胞外空間に流すことができ、コレステロールに富んだ表面突起、に彼らの隔離を含む機構3,4。このプロセスは、代謝活性の不在下で、すべてのセルで発生し、化学的固定4の後にEMを使用して可視化することができる。そのような毒素曝露に応答して炎症を媒介マクロファージなどの免疫細胞は、誘導される膜小胞はIL-1ファミリーのサイトカインを含むことが示唆されており、毒素を流し、これらの炎症性サイトカイン5,6,7を広めるための両方の責任があるかもしれません。両方とも8カスパーゼ1依存プロセスであるとして、IL-1β放出および細胞死の特定の種類の間にリンクと呼ばれるpyroptosisが、示唆されている。膜小胞の毒素結合、脱粒、サイトカイン放出、および潜在的に細胞死を含むこのマクロファージ応答の複雑さを整理するために、我々には、毒素 - 細胞間の相互作用のリアルタイム可視化を可能にラベリング手法や蛍光顕微鏡法を開発した機能不全と死の測定（ 図1）。使用ライブセルイメージングの他の技術の制限のために必要です。フローサイトメトリーは、個々の細胞の高分解能、リアルタイム可視化を提供していないながら、生化学的アプローチは、個々の細胞で発生する効果を解決することはできません。ここで説明する方法は、細胞内の複雑な表現型の変化を伴うその他の刺激によって誘導される応答の動態解析に適用することができます。

典型的には10 7〜10 8 U / mlのSLOは4 mg / mlのタンパク質濃度を求めることができる。細胞溶解に必要な毒素の量は、細胞の種類によって異なりますが、通常125から500 U / mlのSLO（ 図2B）です。他人（特にT細胞株）は、より敏感であるけれどもマクロファージ様細胞型（4000 U / ml）を、より耐性があることができます。これらの感応度は市販のSLOに対応しています。毒素活性は、各凍結融解とほぼ2倍に減少し、毒素の各バッチまたは融解による溶血アッセイは毒素活性を確認するために必要とされるようにします。毒素は、タンパク質を扱う際には注意が必要ですので、コレステロール含有膜の非存在下でも熱や酸化10に非常に敏感です。 毒素のマイクロデリバリーは、同じ皿の中で毒素を処理した細胞と未処理細胞の比較が可能になります。拡散勾配が確立されますので、それも、毒素活性に内部統制を提供していますマイクロピペットの先端から設置しました。近いマイクロピペットへの領域は、細胞死が表示され、さらにアウ...

組換え体からコレステロール結合毒素ストレプトリジンOの精製方法<em&gt; E大腸菌の</em真核細胞を生きるためにバインド毒素の&gt;と可視化が記載されている。毒素の局所送達は、毒素の生物学の新たな側面を明らかに標的細胞における迅速かつ複雑な変化を誘導する。

細菌毒素は膜中のコレステロールに結合し、孔（ポア）を形成することで、細胞内容物の漏出および外部からの物質の流入を可能にする。

この手順の目的は、細菌毒素に対する免疫細胞の応答を可視化することです。まず、BL 21 gold cellsを用いて毒素を発現させ、精製します。毒素の活性と濃度を確認した後、免疫細胞に毒素を添加します。マイクロインジェクターと高速ライブセル顕微鏡を用いて解析を行います。得られた画像の解析により、毒素に対する免疫細胞応答のリアルタイムキネティクスが明らかになります。この手法は、インフラマソーム活性化のメカニズムなど、免疫学分野における重要な疑問の解決に寄与します。この手法は毒素による免疫細胞応答の知見を得るために有用ですが、化学走性因子を含む他の刺激にも適用可能です。本手法の着想は、細菌と培養免疫細胞の相互作用を研究していた際、細菌と免疫細胞の間で相互作用に非常に大きなばらつきがあることを観察したことにあります。まず、pAG3-SLOを含むBL21 Gold細胞を培養し、ストレプトリシンO（SLO）の精製を開始します。HisプラスミドをODが約0.6になるまで培養します。タンパク質発現を誘導するため、培養液に20% OSesを5 mL加え、室温で225 RPMで3時間振とうします。次に、細菌を500 mL遠心ボトルに移します。次に、培養物を 4 °C で 12,000 ×g、12 分間遠心分離し、遠心後、上清を除去します。ペレットを -80 °C で一晩、または必要に応じてそれ以上の期間保存します。発現した SLO を精製するには、Triton X 100、リゾチーム、およびフェニルメチルスルホニルフッ化物（PMSF）を添加した ly wash buffer 10 mL を凍結ペレットに加え、ピペッティングを約 15 分間繰り返します。再懸濁させるため、サンプルを氷上に置いたままペレットを懸濁させます。再懸濁したペレットを50 milliliterのオークリッジ製丸底ポリプロピレンチューブに移します。プローブ型ソニケーターを用い、出力40%で30秒間の処理を30秒間隔で5回行い、各処理の間は氷上で30秒間冷却してライセートをソニケーションします。次に、超音波処理したライセートを4°Cで20分間、39,000 ×gで遠心分離します。遠心分離後、細菌の上清を1 mLの洗浄済みニッケルNTAアガロースに加えます。ニッケルNTAアガロースとライセートを、4°Cで緩やかに振盪しながら2.5時間インキュベートします。4°Cで400 ×gにて5分間遠心分離し、ビーズをペレット化します。特に断りのない限り、以降のすべての洗浄および溶出操作は、この遠心分離条件で実施することに注意してください。遠心分離の後、30 µLの上清と10 µLの4倍濃度SDSサンプルバッファーをマイクロ遠心チューブ内で合わせ、純度分析のために氷上に保存します。その後、残りの上清を除去し、ビーズを氷冷した洗浄バッファーで4回洗浄します。各洗浄の間に、塩類含有バッファーで1回遠心分離を行います。ここからは、サンプルを常に氷上で保持してください。SLOは非常に酸化還元感受性の高いタンパク質であり、短時間であっても37 °Cに温められると速やかに活性を失います。SLOタンパク質を溶出させるには、溶出バッファー1 mLと1 M DTT 5 µLをビーズに加え、氷上で10分間インキュベートします。その後、遠心分離を行い、溶出番号を記載した遠心チューブに上清を回収します。この工程を3回繰り返し、次にSLOタンパク質からエンドトキシンを除去するため、res saltバッファーに懸濁させた洗浄済みのpoly mixing結合agro beads 200 µLをサンプルに添加し、4°Cで30分間振盪します。その後、4°Cで10,000 ×gにて1分間遠心分離します。遠心後、上清をラベル付きの新しいマイクロ遠心チューブに回収します。各溶出液 30 µL に、4倍濃度のSDSサンプルバッファー 10 µL を混合します。SDS-PAGE分析用として、SLO溶液を氷上で保存します。タンパク質濃度と溶血活性を測定し、十分な結果が得られた場合は、SLOEを 5〜10 µL ずつ分注し、ドライアイスで急速凍結した後、-80 °C で保存します。次に、特異的溶血率を決定します。Reese法を用います。テストする細胞を2倍に懸濁します。20 µg/mLのbuffer RBを用いて、1 mLあたり6×10⁶個の細胞を調製します。プロピジウム йоウ化物。ここでは T 27 A 細胞を用いて試験を行います。個別のマイクロ遠心チューブに入った細胞を、96ウェルV底プレートの各ウェルに 100 µL ずつ分注します。バッファーrbを用いて、SLOを最終濃度の2倍になるまで連続希釈します。次に、毒素100 µLまたはバッファーRB 100 µLを細胞に加え、37 °Cで5分間インキュベートします。一般的な最終濃度は、2000 units/mLから31.25 units/mLの範囲です。フローサイトメーターで細胞を解析し、Fi、Cethrin、またはPEのフィルターを用いてデータを収集します。1 logのシフトは一時的に透過性が高まった細胞を示し、3 logのシフトは死細胞であることを示します。コントロール群の死細胞の割合を実験群から差し引くことで、以下の式を用いて細胞の特異的溶解率を算出します。実験の1日前に、2×10⁵個のマクロファージをコラーゲンコートしたガラス上に播種します。底面35 millimeterディッシュを使用します。毒素導入に使用する顕微鏡には、倒立ステージ、加熱ステージ、適切な励起・蛍光フィルターキューブ、および可能であればベルタンレンズを備えている必要があります。本手順において最も困難な点は、ニードルを破損させることなく細胞まで降ろすことです。確実に成功させるため、通常はアライメントに使用されるベルトラントレンズを用いて、焦点平面に針を導入する際にその視覚的な確認を行います。顕微鏡はマイクロインジェクターに接続し、データの収集および保存に十分なメモリを備えたコンピューターで制御してください。顕微鏡とマイクロインジェクターの電源を入れ、ステージが加熱されるまで待ち、加熱ステージが37 °Cに到達するようにします。37 °Cで30分間、色素を用いて細胞を標識します。アッセイに応じて、ラベリングは5 µL、4 µL、または1 mLのHBSSに含まれる2 µLのカルシウム、あるいは1 mLの完全培地に含まれる2 µLのカルシウムを用いて行われます。ここでは、4 µLまたは2 µLを使用します。細胞培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。PBSを吸引し、2 mMの塩化カルシウムを添加した1 mLのRPMIに置換します。ディッシュを顕微鏡にセットし、明視野で細胞にピントを合わせ、その後、細胞のわずか上にピントが合うように調整します。次に、1 µLのSLO toxin、4 µLのDEXTRA 5 55（10 mg/mL）、および6 µLの水を混合します。その後、4 °Cで10分間、20,000 ×gで遠心分離します。デキストランは、フェムトチップに詰まりがないことを確認するために使用されます。マイクロローダーを用いて、希釈した毒素 2 µL をフェムトチップの後方からロードします。その後、フェムトチップをマイクロインジェクターに装着します。次に、インジェクターの角度を調整し、チップが細胞の中央に位置し、かつ全方向に動かせる余裕を持たせます。マイクロインジェクターのチップが到達できる下限を制限する、前回のZ制限の設定をクリアします。マイクロインジェクターを、120 PSIで0.5秒間注入し、バックプレッシャーを20 PSIに設定します。その後、チップを培地に浸かるまで下げます。ベルトランレンズを使用します。チップを中央に合わせ、細胞に近づけるようにチップを下げながら追従させます。ニードルにピントが合わなくなったら、通常の光学系に戻してください。視野内に針の影が見えるはずです。細胞よりも上の位置に焦点を合わせ、針にピントが合うまで針を下げます。その後、細胞に焦点を合わせ、慎重に針を細胞の隣まで移動させます。注入のためのZリミットを設定した後、イメージングを開始し、毒素を注入します。次に、針を上げて細胞の新しい領域へ移動します。さらに毒素を注入し、注入後のイメージングを継続します。このビデオで説明する方法に従い、ニードルをホームポジションに移動させ、意図しない毒素の漏出を防ぎます。10⁷〜10⁸ units/mL。SLOは通常、4 mg/mLのタンパク質濃度で得られます。このSDS-PAGEゲルは、毒素誘導前後の細菌サンプルと、精製後の3つの溶出分画を示しており、クマシーブルー染色により、誘導されたSLOが正常に精製されたことがわかります。SLOは69 kilodaltonsのバンドであり、T 27 AまたはD two細胞の溶解に必要な毒素量を決定するために使用されます。細胞にさまざまな濃度のSLOを、propidium iodide存在下で37 °Cで5分間処理し、フローサイトメトリーで解析しました。特異的溶解は、ここに示すように決定されました。1 mLあたり250ユニット。SLOはT 27 A細胞とD2細胞の両方に対して50%の溶血を引き起こします。毒素の亜溶血量である10%溶血量は、1 mLあたり62.5ユニットとなります。これらの値は、毒素への曝露後に細胞死を評価するための、ベンチマークとなる毒素活性にとって重要です。ヒト真皮線維芽細胞を、Life Technologies社のLive-Deadキットを用いて、カルシウムおよびatheriumホモダイマーと共にインキュベートしました。細菌毒素anthro lysin Oへの局所的な曝露後、この画像では、カルシウムが緑色で、マイクロバイオームに近い領域のatherium bromideが赤色で示されています。カルシウムの消失とatheホモダイマーの取り込みを特徴とする細胞死が示されており、一方で先端から遠い領域では損傷が見られません。毒素を微量送達することで、カルシウムフラックスなどのリアルタイムイベントの解析が可能になります。4:02 AMを負荷したこれらのヒトdcsを、一定の流速でSLOに曝露させ、同時にライブイメージングを行いました。緑色から青色への変化は、細胞質カルシウム濃度の増加を擬似カラーで示しています。SLOは細胞質カルシウムの急速な上昇を誘導し、局所的な投与によってディッシュの当該領域に伝播します。しかし、マイクロインジェクターのチップに近い細胞のみが毒素に接触し、反応します。これにより、毒素に対する単一細胞の反応と、z軸方向のイベントを解像するための毒素投与の空間的に制限された領域の両方が実証されます。マイクロデリバリーを高速3D共焦点顕微鏡法と組み合わせました。この一連の画像は、毒素注入後の樹状細胞を示しています。細胞膜を標識するため、あらかじめ緑色で示されるPC結合抗CD11cでプレインキュベーションされています。ここで見られるように、毒素の導入後にマイクロベシクルが放出されます。細胞修復プロセスの一環として、毒素分子がブレブに濃縮され、毒素を除去するために脱落します。習得すれば、顕微鏡観察は45分で完了できます。この手順を実施する際は、細胞と混合するまで毒素を低温に保つこと、および溶血活性を確認することを忘れないでください。これで完了です。このビデオを視聴したことで、ライブセルイメージングを用いて細菌毒素に対する免疫細胞応答のリアルタイムキネティクスを測定する方法について、十分に理解できたはずです。

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