蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

蛍光性抗生物質の調製は分光光度測定および顕微鏡法のような便利な分析技術によって細菌の中でこれらの治療試薬の局在の評価を可能にする。この技術の主な利点は、抗生物質の局在化を決定できる容易さである。この局在化は、流出を含む多くの現象に関連しています。

クリックA反応手順を実行するには、丸底フラスコに目的のアジド系抗生物質を置き、フラスコにアジドの1ミリモルあたり25ミリリットルのtert-ブタノールと25ミリリットルの水を加える。溶液に調製したフルオロフォアアルキンを加え、反応を摂氏50度に加熱します。次に、フラスコに硫酸銅の0.6相当とアスコルビン酸の2.4当量を加えます。

反応が完了したことを示すLCMSによる分析まで1時間か、分析するまで反応を攪拌する。その後、抗生物質足場に適した反応を冷却し、精製する。ここで、シプロフロキサシン、リネゾリド、トリメトプリムに基づくアジド中間体を介して対応する抗生物質から合成された構造の例を用いた蛍光抗生物質の調製のためのキークリック化学反応が示されている。

これらの液体クロマトグラフィー質量分析では、シプロフロキサシンアジドとNBDアルキンクリック反応から、アジドを3.2分で溶出し、生成物を3.8分で溶出させた。クリック反応の進行は、アジドピークの消失に続く。これらのスペクトルでは、精製の影響を誤ったピークが消失して可視化することができる。

合成された抗生物質の抗菌活性を評価するために、LB寒天プレート上の抗生物質足場に適した細菌株のグリセロール株のストリークグリセロール株を、摂氏37度で一晩培養する。翌朝、各プレートから単一のコロニーを選び、摂氏37度で培養1回あたり5ミリリットルのCAMHBでコロニーを培養します。翌日、新鮮なCAMHBで約40倍の培養液を希釈し、0.4〜0.8の間の600ナノメートルの光学密度で細菌を中ログ相に成長させます。

次に、滅菌水中の20%ジメチルスルホキシド中の1ミリリットル当たり1.28ミリグラムで各蛍光抗生物質のストック溶液を調製し、96ウェルプレートの最初の列の各ウェルに10マイクロリットルの抗生物質を加える。最初のカラムの各ウェルに90マイクロリットルのCAMHBを加え、50マイクロリットルを他のすべてのウェルに加えます。その後、プレートを横切ってシリアル2倍希釈を行います。

十分に混合した後、中対数相培養をミリリットル当たり約10〜6番目のコロニー形成単位に希釈し、各培養物の50マイクロリットルを希釈ウェルに加え、ミリリットル当たり50倍のコロニー形成単位に最終濃度を得る。すべての細菌がめっきされたら、蓋をプレートに置き、37°Cで18〜24時間培養します。翌日、プレートを目視で検査します。

最小阻害濃度は、目に見える成長のない最も低い濃度ウェルになります。プローブ蓄積分析のために、細菌株のグリセロール株のストリークは、摂氏37度で一晩インキュベーションのためにLB寒天プレートに。翌朝、摂氏37度のリソジニースープで一晩培養するためにプレートから単一のコロニーを選びます。

翌朝、一晩培養した後、新鮮な培地で約50倍に希釈する。培養が中対数相に達すると、遠心分離により細菌をペレット化し、培地をデカントする。PBSの1ミリリットルで細菌を再懸濁し、再び細菌を遠心分離します。

上清をデカントし、PBS中で洗浄したペレットを600ナノメートルの2の光学密度に再懸濁する。PBSに10ミリモルCCCPの10.1マイクロリットルを1ミリリットルの細菌に加え、37°Cで10分間培養します。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細菌を採取し、PBS中の10〜100マイクロモル蛍光性抗生物質溶液中の1ミリリットルのペレットを再懸濁する。

摂氏37度で30分間のインキュベーションを行った後、1回の冷たいPBSを1ミリリットルで4回遠心分離して細胞を洗浄します。洗浄後、180マイクロリットルのリシスバッファーと70マイクロリットルのリソザイムで細菌をライスします。摂氏37度で30分後、マイナス78度でマイナス78度で3回凍結解凍し、それぞれ15分間摂氏34度を凍結します。

凍結解凍の最後のラウンドの後、20分間サンプルを超音波処理し、続いて摂氏65度で30分のインキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって抽出されたサンプルを収集し、10キロダルトンフィルター膜を通してチューブの内容物をひずみます。洗浄ごとに100マイクロリットルの水でフィルターを4回洗浄し、アリコートごとに黒いフラットボトム96ウェルプレートの個々の井戸に洗浄します。

次に、蛍光色素に適した励起波長と発光波長を有するプレートリーダー上の蛍光強度を測定します。これらの典型的な結果は、蛍光分光法による蛍光分光法による細胞内蓄積の評価から、細菌の細胞内蛍光がCCCPによる前処理後に有意に高いことを示し、effluxが細菌内の蓄積を減少させることを示している。グラム陽性およびグラム陰性細菌のこれらの代表的な共焦点顕微鏡画像において、細菌内の抗生物質の局在化は、CCCP治療後に可視化することができる。

この現象は、CCCPが追加されていない場合には観察されません。蛍光抗生物質を使用する場合、収集しようとしている情報に注意し、このデータを取得する際にどのプロトコルが最も有用であるかを考慮してください。その合成に続いて、蛍光抗生物質は、薬物標的相互作用および抵抗性修飾を含む多くの細菌プロセスを研究するために使用することができる。