Name: 蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶ 蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌内抗生物質局在の可視化手法。クリック化学による合成、蛍光分光法と共焦点顕微鏡による蓄積評価、排出機構の解析について解説します。

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MRLSは、オーストラリア大学院賞(APA)と分子生命科学研究振興研究所賞によって支援されています。ワニダ・フェツァンは、UQ国際奨学金(UQI)とIMB大学院賞(IMBPA)の支援を受けました。MACはNHMRCの原則研究員(APP1059354)であり、また、炎症性疾患の臨床アンメットニーズに対処するための薬を開発しているインフラゾメ株式会社のCEOとしての残りの時間で、クイーンズランド大学で分数教授研究員の任命を保持しています。MATBは、ウェルカムトラスト戦略助成金WT1104797 / Z / 14 / ZおよびNHMRC開発助成金APP1113719によって部分的にサポートされています。顕微鏡検査は、オーストラリア癌研究財団(ACRF)/分子生命科学研究所で行われた、ACRFの支援を受けて設立されました。

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著者は宣言するものは何もありません。

成功した蛍光抗生物質プローブの作成は、親薬のSARの慎重な計画と検討から始める必要があります。SARが知られていないか、または完全に探索されていない場合、生物学的活性を廃止することなく選択的に修飾され得る部位を見つけるためにいくつかの選択肢をテストする必要があるかもしれません。サイト/sが特定されると、リンカー部分の設置は、しばしば、作用部位と不活性な蛍光動植物との間に立間間隔を提供するために不可欠である。リンカーを抗生物質に付着させるために使用される反応が、生体安定官能基を残し、例えばインビボでエステラーゼによる切断を受けやすいエステルを避けることを注意しなければならない。抗生物質の薬物力学および薬物動態プロファイルに応じて、単純なアルキルリンカーを使用してもよいし、あるいはポリエチレングリコール(PEG)リンカーのようなより少ない親油性の選択肢を考慮すべきである。リンカーを取り付けた状態で、抗菌活性を評価して、関連する細菌に対するMICsが親化合物と類似していることを確認する必要があります。
この研究では、いくつかの理由から、フッ素色を抗生物質にリゲートするために、Huigsenアジジアルキン[3+2]双極性シクロ付加(クリックケミストリー、図1参照)を使用することを推奨します。クリック反応は、抗生物質に対する反応性基の保護が必要でないことを意味する、非常に選択的であり、さらに、反応は安定した、生体適合性のトリアゾール部分を残す。アジド成分は、アルキンの導入よりも様々な構造タイプで一般的に容易に達成されるように、我々の手順で抗生物質部分に導入される。2つのアルキン誘導体化蛍光体の合成は、必要に応じて他の人を探索することができるが、ここで説明されている。NBDとDMACAは、その小さなサイズのために選択され、細胞の浸透および標的相互作用を妨げる可能性を最小限に抑えた。このクリック反応自体は銅触媒を用いて行い、ここでCu2+(CuSO4、アスコルビン酸還元剤を有する)またはCu+(CuI)のいずれかを出発試薬として用いてもよい。精製 (図 2)の後、MIC はアジドと同様にテストする必要があります。蛍光性フォアの選択や付着部位を慎重に考慮しても、抗生物質の活性が悪くなる可能性があります。ただし、これは非アクティブなプローブが使用されないことを意味するものではありません。TMPプローブで示されるように、抗菌活性の悪い化合物は、依然として親薬と同じ標的に結合し得る。これにより、作用のモードに関する研究と、流出などの抵抗につながる現象の検討が可能になります。
プロトコルセクションで概説されているように、単純な分光光測定アッセイ(図3)またはフローサイトメトリー(図4)のいずれかを用いて蛍光抗生物質による細菌標識を分析することができる。どちらの方法も細胞蓄積を定量化することができ、細胞をリセートして蛍光局在化を調べることにより、細胞内蓄積を評価することができる。このプロトコルでは、細胞のリソザイムの使用は、これが迅速で普遍的な技術であるように記述される。グリシン-HCl7による一晩処理などの他のリシス条件も、正常に使用されている。この技術を用いて、抗生剤の細胞蓄積に対する流出の影響を研究することが可能であり、これは抵抗性の主要なメカニズムである。もし細菌に流出が実際に存在するならば、細胞内蓄積の欠如は観察されるが、これはCCCPのような流出抑制剤を使用して救うことができる。
顕微鏡検査は、異なる細菌におけるプローブ局在化、作用様式に関する情報、および潜在的に抵抗性を視覚的に検査するために行われることもあります(代表的な例については図5を参照)。細菌内の局在を見るためには、SIM(構造照明顕微鏡)、SR-SIM(超解像度SIM)、エアリスカン、またはSTED(刺激された排出枯渇)などの機能を備えた高解像度の共焦点顕微鏡が必要です。さらに、高性能のカバースリップを使用し、適切なソフトウェア(例えば、フィジー、Zen、イマリス)でイメージング後の分析を行う必要があります。プローブの局在化は、Hoechst-33342(青、核酸)、Syto-9(緑色、核酸)、FM4-64FX(赤、膜)などの特定のアーキテクチャを染色する染料と比較されます。色素の選択は、蛍光抗生物質に一致するように行われるべきであり、使用される各色は、最小のスペクトルの重なりを有する。可能な限り最高の画像を得るためには、最適化が必要な場合があります。例えば、細菌がスライド上で混雑しすぎている場合は、懸濁ペレットの一部のみを取り、より多くの取り付け培地で希釈します。対照的に、細菌がスライド上であまりにもまばらである場合は、単により多くの細菌から始めます。このプロトコルでは、生細胞と互換性のある熱可逆性ゲル(例えば、Cygel)を使用して、細菌(可動菌を含む)を固定化するため、生細胞イメージングに推奨されるが、他の取付け培地またはアガロースも使用されている。
全体的に、生物学的に活性な蛍光系抗生物質誘導体の調製において直面する可能性のある課題にもかかわらず、その使用のシンプルさと汎用性は、これらのプローブをAMRの研究のための魅力的なツールにします。蛍光抗生物質を使用する将来の研究は、抗生物質耐性のメカニズムに関する洞察を提供し、現在の抗生物質がどのように動作するかを理解し、より良い薬物の開発を支援する可能性を秘めています。

抗菌性(AMR)は、世界中の人間の健康に大きな脅威を与える危機の高まりです。ほとんどの抗生物質に対する耐性が報告されており、すべての臨床的に入手可能な薬物に耐性のある細菌によって引き起こされる感染症が出現している。AMRの台頭に対抗するためには、この多面的な現象と、抗生物質と細菌の間の根本的なメカニズムと相互作用についての理解を深める必要があります。歴史的に十分に理解されていなかった一つの側面は、蓄積と流出の現象と共に、細菌への抗生物質の浸透である。この知識は、新薬を設計し、抵抗性のメカニズムを理解する上で重要です。したがって、これはAMR研究において重要な役割を果たします。
抗生物質濃度を測定するために取ることができる2つの主要なアプローチがあります:薬物を直接測定するか、定量化を容易にするために設計された部分でタグ付けする。抗生物質をタグ付けすると検出が向上しますが、抗菌活性や透過性などの薬物の生物学的活性を乱す可能性があります。これは、タグなしメソッドの問題ではありません。ただし、検出は困難な場合があります。ここ数年、技術の進歩は、細菌1、2、3、4、5、6、7の抗生物質濃度を直接測定するために質量分析(MS)を利用した研究ブームにつながっています。これらの研究は、グラム陰性細菌が最も広く研究されている様々な細菌における細胞内蓄積を研究することが可能であることを示している。分子透過性の定量は、その後活性にリンクされ、薬剤開発2、3、4を知らせるために使用されているが、蓄積および標的活性5を直接連結する際には注意が必要である。MS開発前に、濃度を直接測定できる抗生物質は、テトラサイクリンおよびキノロン8、9、10、11のような固有蛍光を有するものであった。明らかに範囲は限定的であるが、蓄積および流出を調べ、定量し、蛍光系定量の有用性を示す。
タグ付き抗生物質は、分布、作用モード、耐性を研究するために何十年も使用されており、放射性および蛍光タグが一般的です。ラジオタグ付きプローブは、親化合物とほぼ同じであるという利点を有し、したがって生物学的活性が有意に異なる可能性は低い。3H、14C、および15Nなどの同位体は、抗生物質中のこれらの元素の顕著さのために頻繁に使用されており、1、10、12、13の様々な抗生物質足場が調べられている。 無線プローブの検出は簡単ですが、このアプローチの使用が制限されている多くの物流上の懸念(例えば、安全性、同位体の半減期)があります。もう一つの戦略は、蛍光タグ付き抗生物質です。これらのプローブは、MSよりも単純な技術を使用し、放射線8の物流上の問題なしに、親薬剤の分布および作用様式および抵抗性を調べるために使用することができる。このアプローチの主な欠点は、抗生物質は一般的に比較的小さな分子であり、したがって蛍光部分の導入は有意な化学的変化をもたらす。この変化は、物理化学的性質および抗菌活性に影響を与える可能性があります。従って、親抗生物質を代表する結果を生成するためにこれらの因子を評価するために注意を払わなければならない。
本研究では、蛍光抗生物質を合成、評価、使用する方法について説明しました。以前の研究を通じて、蛍光抗生物質の数が準備され、様々な目的のために使用されています(ストーンら8を参照してください)。生物活性に影響を与える可能性を最小限に抑えるために、ニトロベンゾキサジアゾール(NBD、グリーン)および7-(ジメチルアミノ)-2-oxo-2H-クロム4-yl(DMACA、青)という非常に小さなフルオロフォアが使用されています。また、マイクロブロス希釈抑制濃度(MIC)アッセイを用いた抗菌活性の評価が記載されており、その結果、活性に対する修飾の効果が測定可能となる。これらの蛍光タグ付きプローブは、分光光アッセイ、フローサイトメトリー、顕微鏡検査に使用できます。可能な適用の範囲は蛍光の抗生物質の利点があるところにある。細胞蓄積は、MSだけでは不可能なものを定量化、分類、可視化することができる。蛍光抗生物質の使用によって得られた知識が、耐性の理解とAMRとの闘いに役立つことを期待しています。

<table><tbody><tr><td>3-(ジメチルアミノ)フェノール</td><td>アルファ-エーザー</td><td>B23067</td><td></td></tr><tr><td>4-クロロ-7-ニトロ-ベンゾフラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163260-5G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 遠心フィルターユニット Ultracel- 10 メンブレン</td><td>Merck</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)</td><td>Waters</td><td>186008205</td><td></td></tr><tr><td>Atlantis T3 カラム (100 A, 5 uM, 2.1 &倍;50 mm)</td><td>Waters</td><td>186003734</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance 600 MHz分光計</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buchi Reveleris C18 12g カートリッジ</td><td>Buchi</td><td>BUC145152103</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22140-5KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Cygel</td><td>ABCAM</td><td>Ab109204</td><td></td></tr><tr><td>ElyraPS,1 SIM/STORM 共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FM4-64FX, fixable analog of FM&trade; 4-64 membrane stain</td><td>Life Technologies Australia Pt</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Gallios flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gamma 2-16 LSCplus lyophilise</td><td>CHRIST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson HPLC 2020</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンクスのバランスの取れた塩溶液、変性、重炭酸ナトリウム、フェノールレッド、塩化カルシウム、硫酸マグネシウムなし、液体、滅菌ろ過、細胞培養に適しています</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Zentrifugen Rotofix 32</td><td>Hettich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高性能 #1.5 カバー スリップ (18 x 18 mm)</td><td>Schott/Zeiss</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物 - Fluo</td><td>Life Technologies Australia Pt</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Leica STED 3X 超解像顕微鏡 白色光レーザー励起</td><td>鶏</td>卵白からのライカリ<td></td><td></td></tr><tr><td>ゾチーム 凍結乾燥粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Mueller Hinton II ブロス カチオン調整</td><td>ベクトン・ディッキンソン</td><td>212322</td><td></td></tr><tr><td>プロパルギラミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P50900-5G</td><td></td></tr><tr><td>Reveleris GRACE MPLC</td><td>島津製作</td><td></td><td></td></tr>所 <tr><td>LCMS-2020</td><td>島津</td><td></td><td></td></tr><tr><td>製作所 Sigma 1-15 微量遠心機</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリカゲル 60 (0.040-0.063 mm) カラムクロマトグラフィー用 (230-400 mesh ASTM)</td><td>メルク</td><td></td><td></td>1093859025</tr><tr><td>SYTO 9 緑色蛍光核酸ステイン</td><td>ライフ テクノロジーズ オーストラリア Pt</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 PRO</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

蛍光性抗生物質は、他の方法よりも大きな利点があるため、抗菌性の研究に容易に使用される多目的研究ツールです。これらのプローブを調製するために、抗生物質のアジド誘導体が合成され、次いで、クリック化学によるアジド-アルキネジポーラシクロ付加を用いてアルキン-フルオロフォアと結合される。精製後、蛍光抗生物質の抗生物質活性は、最小阻害濃度評価によって試験される。細菌の蓄積を研究するために、分光光度法またはフローサイトメトリーのいずれかを使用して、放射性抗生物質誘導体に依存する方法よりもはるかに簡単な分析を可能にする。さらに、共焦点顕微鏡を使用して細菌内の局在を調べ、耐性種で起こる作用様式および変化に関する貴重な情報を提供することができる。抗菌性の研究における蛍光抗生物質プローブの使用は、将来の拡大に大きな可能性を秘める強力な方法です。

図1蛍光系抗生物質の調製のための主要なクリック化学反応(A)と、シプロフロキサシン(cipro)、トリメトプリム(TMP)、およびリネゾリドに基づく当社の公開蛍光抗生物質の構造の例(B)を用いて説明します。これらのプローブは、アジド中間体を介して対応する抗生物質から全て合成した。その後、NBDおよびDMACA蛍光色素に結合され、それぞれがアルキンで機能化された。
図2は、シプロフロキサシン-N3およびNBD-アルキンクリック反応からのLCMSトレースの例を示し、アジドが3.2分で溶出し、1.8分で生成された。1と2を比較すると、クリック反応の進行がアジドピーク(UVまたはMS検出器)の消失にどのように続くかを示しています。スペクトル3は、MSおよびUVトレースから誤ったピークが消え、精製の影響を示す。純度と反応の進歩は、製品のピークと任意の不純物ピークの積分によって定量化することができます。
図3は、流出の有無に関する蛍光分光法による細胞内蓄積の評価から典型的な結果を示す。本実験では、大腸菌を、プロトン動機力(PMF)を崩壊させたCCCPの添加の有無にかかわらずTMP-NBDで処理した。CCCPで前処理した場合、細菌の細胞内蛍光は有意に高く、これらの細菌の蓄積を減少させたことを示す。この実験を、tolCに欠損した細菌を用いて繰り返し、このアッセイの容量を表示し、個々の流出ポンプ成分の影響を調べた。この場合、野生型細菌に比べて細胞内蛍光の増加があったものの、CCCP蓄積は依然として増加している。これらの知見は、tolCがInTMP流出に関与するが、唯一のPMFドライブポンプではないことを示している。
図4は、図2と同じ実験の結果を示しているが、分光法の代わりにフローサイトメトリーによって測定された蓄積を用いる。同じデータ傾向が観察され、どちらの技術も細胞内蓄積を媒介する流出現象の研究に使用される可能性があることを実証した。
図5は、それぞれ、グラム陽性(S.アウレウス)およびグラム陰性菌(大腸菌)をTMP-NBD(1)およびcipro-NBD(2+ 3)蛍光プローブで標識した代表的な共焦点顕微鏡画像を示す。いずれの場合も、同局在化を比較するために、赤色の膜色素FM4-64FXを添加した。TMP-NBDの場合、青色核酸色素のホーチスト-33342も使用した。これらの画像を重ね合わせて、細菌中の抗生物質の局在化を可視化した。パネル2と3を比較すると、流出の影響を調べた方法を示し、2で使用された流出抑制剤CCCPを用いて、細胞内蓄積をもたらす。パネル3では、CCCP は追加されません。したがって、流出は活性であり、プローブ蓄積は見られなかった。
図6は、DMACA標識オキサゾリジオンプローブLz-NBDで標識されたグラム陽性(S.アウレウス)細菌の代表的な共焦点顕微鏡画像を示す。赤色の膜色素FM4-64FXを共局在化を比較するために添加し、緑色核酸色素ヘエヒト-33342も使用した。これらの画像を重ね合わせて、細菌中の抗生物質の局在を可視化し、膜および核酸とは異なる内部局在を示した。
表1は、3つの一連の蛍光抗生物質、シプロフロキサシン、トリメトプリム(TMP)、およびリネゾリド(Lz)のMIC値を示し、それぞれの親抗生物質、NBDおよびDMACA誘導体について提示されたデータを示す。各抗生物質の代表的な種は、グラム陽性およびグラム陰性の両方を含む選択された。シプロフロキサシンシリーズの場合、両方の蛍光プローブは、親薬と比較して抗生物質活性を失ったが、すべての種に対していくつかの活性を保持した。同様に、リネゾリドプローブは何らかの活性を失ったが、中等度から弱い抗生物質のままであった。TMPプローブは、野生型細菌に対するほぼすべての活性を失ったが、流出欠乏性大腸菌に対して活性であったが、抗菌活性の喪失は蓄積の欠如によるものであることを示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig01.jpg"> 図1:抗生物質由来プローブの合成と構造(A) アジド系抗生物質およびアルキン-フルオロフォアからの蛍光系抗生物質プローブの合成に関する一般的な反応体。(B) シプロフロキサシン、トリメトプリム、およびリネゾリドに基づく当社の公開プローブの構造。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig02.jpg"> 図2: LCMSによる抗生物質由来プローブ純度測定(1)不完全、(2)完全、および(3)反応終了時に出発物質の消失を示す(2)完全、および(3)HPLC精製されたシプロフロキサシン-N+NBDアルキンクリック反応、および精製時のその他のピークから分析的なLCMSトレース。A = UV-Vis トレース (250 nm での吸光度) B = MS トレース (正および負のモード)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig03.jpg"> 図3:抗生物質由来プローブ蓄積のプレートリーダー測定野生型(1,ATCC 25922)およびΔtolC(2,ATCC 25922)をインキュベートしたTMP-NBD(50μM)の細胞蓄積の蛍光分光測定(A)および(B)をCCCP(100μM)を添加せずにインキュベートする。統計的有意性(**p ≤ 0.01;***p ≤ 0.001)は、CCCPの不在または存在と野生型とΔtolC大腸菌の間で示される。報告されるデータは、3回の実験での平均±SDである。この図は、我々の以前の出版物15から適応され、細胞内蓄積に対する流出の役割を解明するための分光法の使用を示している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig04.jpg"> 図4:抗生物質由来プローブ蓄積のフローサイトメトリー測定野生型(1,ATCC25922)およびΔtolC(2,ATCC25922)をCCCP(100μM)の添加に伴わずにインキュベートした大腸菌においてTMP-NBDを用いた細胞蓄積のフローサイトメトリー測定。蛍光の中央値は10,000個の細菌事象から示され、統計的有意性(***,p≤ 0.001;****, p ≤ 0.0001)は、CCCPの不在と存在と野生型とΔtolC大腸菌の間で示される。報告されるデータは、3回の実験での平均±SDである。この図は、我々の以前の出版物15から適応され、細胞内蓄積に対する流出の役割を解明するためのフローサイトメトリーの使用を示している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig05.jpg"> 図5:NBDプローブ局在化の共焦点顕微鏡可視化1)ヘーヒト-33342(青、核酸)、TMP-NBD(緑)、FM4-64FX(赤、膜)、および重ね合わせたS.アウレウスを生きたS.アウレウスの共焦点顕微鏡画像;2)CCCP(エフラックス阻害剤)で処理された生きた大腸菌は、cipro-NBD(グリーン)、FM4-64FX(赤、膜)、およびオーバーレイで標識した。3)生きた大腸菌は、cipro-NBD(緑)、FM4-64FX(赤、膜)、および重ね合わせた。この図は、我々の以前の出版物15、16から適応され、流出の影響を含むプローブの局在を調べるために顕微鏡を使用することを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig06.jpg"> 図6:DMACA-プローブ局在化の共焦点顕微鏡可視化オキサゾリジノネプローブLz-DMACA(青)、シトックスグリーン(緑色、核酸)、FM4-64FX(赤、膜)で標識された生きたS.アウレウスの共焦点顕微鏡画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3"></td>
			<td colspan="9">マイク (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">種</td>
			<td>ひずみ</td>
			<td>シプロ</td>
			<td>シプロ-NBD</td>
			<td>シプロ-ドマカ</td>
			<td>Tmp</td>
			<td>TMP-NBD</td>
			<td>TMP-DMACA</td>
			<td>リネゾリド (Lz)</td>
			<td>Lz-NBD</td>
			<td>Lz-DMACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">黄色 ブドウ 球菌</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>0.125 - 0.5</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>&gt;64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 43300</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>&gt;64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">肺炎球菌</td>
			<td>ATCC 700677</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">エンテロコッカス・フェシウム</td>
			<td>ATCC 35667</td>
			<td>1 - 8</td>
			<td>32</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 51559</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">肺炎クレブシエラ</td>
			<td>ATCC 13883</td>
			<td>0.015 - 0.06</td>
			<td>8 - 16</td>
			<td>8 - 32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">緑膿菌</td>
			<td>ATCC 27853</td>
			<td>0.25 - 1</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">大腸菌</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>≤0.004</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>0.5</td>
			<td>&gt;64</td>
			<td>&gt;64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>変異型ΔtolC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.ブロスマイクロ希釈MICアッセイによって測定される適切な臨床的に関連する細菌株に対するシプロフロキサシン、トリメトプリム、およびリネゾリドに基づく蛍光抗生物質プローブの抗生物質活性。ほとんどの場合、プローブは親薬と比較していくつかの活性を失ったが、いくつかの測定可能な抗生物質の効力を保持した(さらなる研究に有用であるのに十分)。

蛍光タグ付き抗生物質は抗菌性の複数の側面を研究するために使用することができる強力なツールです。この記事では、蛍光タグ付き抗生物質の調製と細菌における抗生物質耐性を研究するアプリケーションについて説明します。プローブは、分光光度測定、フローサイトメトリー、顕微鏡法によって細菌耐性(例えば、流出)のメカニズムを研究するために使用することができる。

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

蛍光性抗生物質の調製は分光光度測定および顕微鏡法のような便利な分析技術によって細菌の中でこれらの治療試薬の局在の評価を可能にする。この技術の主な利点は、抗生物質の局在化を決定できる容易さである。この局在化は、流出を含む多くの現象に関連しています。クリックA反応手順を実行するには、丸底フラスコに目的のアジド系抗生物質を置き、フラスコにアジドの1ミリモルあたり25ミリリットルのtert-ブタノールと25ミリリットルの水を加える。溶液に調製したフルオロフォアアルキンを加え、反応を摂氏50度に加熱します。次に、フラスコに硫酸銅の0.6相当とアスコルビン酸の2.4当量を加えます。反応が完了したことを示すLCMSによる分析まで1時間か、分析するまで反応を攪拌する。その後、抗生物質足場に適した反応を冷却し、精製する。ここで、シプロフロキサシン、リネゾリド、トリメトプリムに基づくアジド中間体を介して対応する抗生物質から合成された構造の例を用いた蛍光抗生物質の調製のためのキークリック化学反応が示されている。これらの液体クロマトグラフィー質量分析では、シプロフロキサシンアジドとNBDアルキンクリック反応から、アジドを3.2分で溶出し、生成物を3.8分で溶出させた。クリック反応の進行は、アジドピークの消失に続く。これらのスペクトルでは、精製の影響を誤ったピークが消失して可視化することができる。合成された抗生物質の抗菌活性を評価するために、LB寒天プレート上の抗生物質足場に適した細菌株のグリセロール株のストリークグリセロール株を、摂氏37度で一晩培養する。翌朝、各プレートから単一のコロニーを選び、摂氏37度で培養1回あたり5ミリリットルのCAMHBでコロニーを培養します。翌日、新鮮なCAMHBで約40倍の培養液を希釈し、0.4〜0.8の間の600ナノメートルの光学密度で細菌を中ログ相に成長させます。次に、滅菌水中の20%ジメチルスルホキシド中の1ミリリットル当たり1.28ミリグラムで各蛍光抗生物質のストック溶液を調製し、96ウェルプレートの最初の列の各ウェルに10マイクロリットルの抗生物質を加える。最初のカラムの各ウェルに90マイクロリットルのCAMHBを加え、50マイクロリットルを他のすべてのウェルに加えます。その後、プレートを横切ってシリアル2倍希釈を行います。十分に混合した後、中対数相培養をミリリットル当たり約10〜6番目のコロニー形成単位に希釈し、各培養物の50マイクロリットルを希釈ウェルに加え、ミリリットル当たり50倍のコロニー形成単位に最終濃度を得る。すべての細菌がめっきされたら、蓋をプレートに置き、37°Cで18〜24時間培養します。翌日、プレートを目視で検査します。最小阻害濃度は、目に見える成長のない最も低い濃度ウェルになります。プローブ蓄積分析のために、細菌株のグリセロール株のストリークは、摂氏37度で一晩インキュベーションのためにLB寒天プレートに。翌朝、摂氏37度のリソジニースープで一晩培養するためにプレートから単一のコロニーを選びます。翌朝、一晩培養した後、新鮮な培地で約50倍に希釈する。培養が中対数相に達すると、遠心分離により細菌をペレット化し、培地をデカントする。PBSの1ミリリットルで細菌を再懸濁し、再び細菌を遠心分離します。上清をデカントし、PBS中で洗浄したペレットを600ナノメートルの2の光学密度に再懸濁する。PBSに10ミリモルCCCPの10.1マイクロリットルを1ミリリットルの細菌に加え、37°Cで10分間培養します。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細菌を採取し、PBS中の10〜100マイクロモル蛍光性抗生物質溶液中の1ミリリットルのペレットを再懸濁する。摂氏37度で30分間のインキュベーションを行った後、1回の冷たいPBSを1ミリリットルで4回遠心分離して細胞を洗浄します。洗浄後、180マイクロリットルのリシスバッファーと70マイクロリットルのリソザイムで細菌をライスします。摂氏37度で30分後、マイナス78度でマイナス78度で3回凍結解凍し、それぞれ15分間摂氏34度を凍結します。凍結解凍の最後のラウンドの後、20分間サンプルを超音波処理し、続いて摂氏65度で30分のインキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって抽出されたサンプルを収集し、10キロダルトンフィルター膜を通してチューブの内容物をひずみます。洗浄ごとに100マイクロリットルの水でフィルターを4回洗浄し、アリコートごとに黒いフラットボトム96ウェルプレートの個々の井戸に洗浄します。次に、蛍光色素に適した励起波長と発光波長を有するプレートリーダー上の蛍光強度を測定します。これらの典型的な結果は、蛍光分光法による蛍光分光法による細胞内蓄積の評価から、細菌の細胞内蛍光がCCCPによる前処理後に有意に高いことを示し、effluxが細菌内の蓄積を減少させることを示している。グラム陽性およびグラム陰性細菌のこれらの代表的な共焦点顕微鏡画像において、細菌内の抗生物質の局在化は、CCCP治療後に可視化することができる。この現象は、CCCPが追加されていない場合には観察されません。蛍光抗生物質を使用する場合、収集しようとしている情報に注意し、このデータを取得する際にどのプロトコルが最も有用であるかを考慮してください。その合成に続いて、蛍光抗生物質は、薬物標的相互作用および抵抗性修飾を含む多くの細菌プロセスを研究するために使用することができる。

visualization-bacterial-resistance-using-fluorescent-antibiotic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

間の共生を研究するために、...

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

出典: Oms、T.、 et al。大 腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析 J. Vis.

細菌における抗生物質の持続性を研究するためのマイクロ流体タイムラプス顕微鏡

出典: Bratton, B. P., 他、『 細菌細胞の三次元イメージングによる正確な細胞表象とタンパク質局在化のための研究』。 J. Vis. Exp.

蛍光イメージングによる細菌タンパク質分布の三次元可視化

このビデオは、細菌細胞内の蛍光抗生物質プローブの蓄積を測定するアッセイを示しています。排出ポンプ阻害剤への曝露は、細菌細胞の膜貫通プロトン勾配を乱し、その上に蛍光色素結合抗生物質が添加されます。プロトン勾配の乱れによる排出ポンプの阻害は、細菌内部に抗生物質の蓄積を引き起こします。細菌細胞を溶解し、蛍光強度を測定して抗生物質の蓄積を確認します。...

蛍光抗菌薬プローブの細菌細胞内蓄積量を測定するアッセイ

細菌は、その生涯の間に有害または有益な突然変異のいずれかを蓄積することができます。細胞の集団では、有益な突然変異を蓄積した個体は、急速に仲間を上回る可能性があります。ここでは、蛍光標識された個体を用いて、時間の経過とともに細菌細胞集団における種内競争を可視化する簡単な手順を提示する。...

蛍光標識株の共同栽培による細菌細胞集団における種内競争のモニタリング

進化のシナリオで品揃え（空間的分離）の役割は、空間分布の調整を可能にする制御された実験室での単純な微生物系を用いて調べることができます。創始細胞密度を変更することにより、様々な品揃えのレベルは、 枯草菌のコロニーバイオフィルム内の蛍光標識された菌株を使用して可視化することができます。...

微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

細菌の本質的なプロセスの機能を理解することは困難です。ターゲット固有の染料を蛍光顕微鏡は、微生物細胞の成長そして細胞周期の進行に重要な洞察を提供できます。ここでは、アグロバクテリウムは不可欠なプロセスの特性評価のための生きているセルイメージ投射のための方法を強調するモデル菌として使用されます。...

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。...

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

私たちの実験的アプローチは、細菌集団における時間の経過とともにプラスミドの豊富さと抗生物質耐性に従う戦略を提供します。...

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

この生菌細胞イメージングプロトコルは、時間の経過とともに単一細胞レベルで複数の細菌種間の相互作用を可視化することを可能にする。タイムラプスイメージングは、個々の細胞の運動性および生存率を含む多種細菌群集における種間相互作用を尋問するために、単一培養または共培養における各細菌種の観察を可能にする。...

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

抗生物質の持続性は、敏感な同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を表します。.本プロトコルは、 大腸菌...

大腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析

学ぶ 蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌内抗生物質局在の可視化手法。クリック化学による合成、蛍光分光法と共焦点顕微鏡による蓄積評価、排出機構の解析について解説します。

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

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