生細胞蛍光顕微鏡を用いた細菌の形態変化のイメージング

まず、ガラス底皿のアガローススラブの下に細菌培養液を固定します。

細菌の細胞膜は蛍光色素で標識されています。

また、細菌は特定のmRNAを標的とするアンチセンスRNAを発現させるように設計されており、必須の細胞分裂タンパク質の産生を抑制します。

逆型蛍光顕微鏡の対物レンズに浸漬油を一滴加えます。

アンテナを金属製のハウジングに入れ、顕微鏡ステージに固定します。

対物レンズを持ち上げて油が皿に触れるまで持ってから、セルに焦点を合わせます。

画像処理ソフトを使ってZスタックを設定し、複数の深さで画像を撮影しましょう。

蛍光のタイムラプス画像の取得を開始してください。

細胞は反センスRNA発現に反応すると分裂できず、腫れた形を形成します。

膜の組織が乱れ、不均一で焦点的な蛍光が現れ、細胞分裂の欠陥を示します。

試料を画像化するには、粗調整フォーカスノブを使って対物レンズが完全に下がっているか確認し、顕微鏡ソフトウェア内で顕微鏡を初期化します。1.517屈折率の油を100X油浸漬物に滴し、サンプルを入れたガラス底皿を金属製のハウジングの箱に移します。

皿を優しくステージクランプに滑り込ませ、粗い調整ノブで対物鏡を持ち上げ、油が皿のガラス底に触れるまで調整します。接眼レンズと微調整ノブを使ってサンプルをピント合わせし、カメラモードに切り替えます。Resolve 3Dウィンドウのイメージングソフトで「Design/Run Experiment」アイコンを選択します。

「Design/Run Experiment(設計/実行実験)」という新しいダイアログボックスが表示されます。ダイアログボックスのデザインタブとセクションングタブを開き、Zスタック数とサンプル厚さを設定します。サンプル内のセルの厚さを測定するには、Resolve 3Dダイアログボックスの上下矢印を使ってZ面を段階的に調整し、画像取得の上限と下限をセルのピントが合わない部分にします。

Resolve 3Dダイアログボックスで選択したチャンネルの光強度の透過率と露出時間を調整した後、「ポイントリスト」をクリックしてポイントリストを開きます。デザインタブとタイムラプスタブでタイムラプスのチェックボックスを選択し、タイムラプスのパラメータを入力します。「Visit Point list」オプションを選択し、テキストボックスに画像化するポイントを入力し、コンマやハイフンで区切って完全なシーケンスを行ってください。

その後、「実行」タブでファイル名とファイル位置を編集し、「実験開始」ダイアログボックスで「再生」を選択して実験を開始します。