1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット

本手順の全体的な目的は、単一分子イメージングに使用するために、輝度と安定性を最適化し、サイズと非特異的結合を最小限に抑えた蛍光量子ドットを作製することです。これはまず、小さなセレン化カドミウム量子ドットコアを作製することで達成されます。次に、これらのコアに水銀を合金化させ、蛍光を赤色スペクトルへシフトさせ、輝度を高めます。

次に、蛍光発光を安定させるために、ナノ結晶上に薄い合金シェルを成長させます。最終ステップとして、多座ポリマーを用いてこれらの粒子を有機溶媒から水性バッファーへ転移させます。このポリマーは、生物学的に不活性なポリエチレングリコールで修飾することが可能です。最終的に、蛍光分光法、ゲルクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動を用いて、これらの粒子が強い蛍光、コンパクトな流体力学的サイズ、および中性の静電電荷を有しており、生物学における単一分子蛍光イメージングに適した特性を備えていることを示します。

これらの量子ドットの既存の市販材料に対する主な利点は、ナノ粒子の流体力学的サイズが大幅に減少していることです。量子ドットが小さくなると、蛍光強度の低下、蛍光安定性の低下、および青色スペクトルのみで蛍光を発するという悪影響がありますが、水銀カチオン交換プロセスを用いることで、これらの影響を相殺しました。これらのナノ結晶は、混雑した生物学的環境における単一バイオ分子のダイナミックイメージングを可能にすることで、生物物理学および細胞シグナル伝達における重要な疑問への回答に寄与します。

まず、50 mLの三口フラスコにセレンを加え、高真空下でフラスコ内を排気し、シュレンクラインを用いて脱気条件下でアルゴンで充填して、TOP中に0.4 Mのセレン溶液を調製します。10 mLのTOPを加え、攪拌しながら100 °Cまで加熱し、1時間保持して、澄明で無色の溶液を得ます。

溶液を室温まで冷却し、フラスコを置いておきます。また、書面によるプロトコルに記載された分量を用いて、250 milliliterの三口フラスコに酸化カドミウム、TDPA、およびODEの溶液を調製します。このビデオに合わせて、攪拌しながらシュレンクラインを用いて溶液を脱気します。

温度を100 °Cまで上げ、さらに15分間排気します。アルゴンガス下で低沸点不純物を除去するため、混合物を300 °Cで1時間加熱し、酸化カドミウムを完全に溶解させます。溶液は赤色から透明で無色に変化します。溶液を室温まで冷却してください。

次に、カドミウム溶液にHDAを加え、70 °Cまで加熱して排気します。圧力が一定になったら、温度を上げて溶液を30分間還流させます。シュレンクラインのバルブを不活性ガスに切り替え、熱電対を溶液に直接挿入します。

脱気条件下で、カドミウム溶液にDPPを加え、温度を310 °Cまで上昇させます。次に、16ゲージの針を装着した使い捨てプラスチック製シリンジを用いて、0.4 MのTOPセレン溶液を7.5 mL分採取します。温度が310 °Cで安定したら、温度コントローラーを0 °Cに設定し、TOPセレン溶液をカドミウム溶液に迅速に直接注入します。

溶液は無色から黄色、オレンジ色へと変化し、温度は急激に低下した後、再び約280 °Cまで上昇します。この手順で最も困難なステップは、シリンジの全量をできるだけ速くカドミウム溶液に注入することです。これにより、粒子が均一に核生成されます。

1分間反応させた後、フラスコを加熱マントルから取り出し、温度が200 °C以下になるまでエアフローで速やかに冷却します。温度が約40 °Cに達したら、30 mLのヘキサンで希釈します。すると、残っているカドミウム前駆体の大部分が溶液から析出します。この沈殿物を遠心分離によって除去してください。

6本の50 milliliterポリプロピレン製コニカル遠心チューブに、得られた粗nano Krystal溶液を12 millilitersずつ分注して希釈します。同様の条件で遠心分離を行った後、40 millilitersのアセトンを用いて、上清を慎重にデカントして廃棄します。次に、nano krysttalペレットをヘキサンに溶解させます。

同量のメタノールで溶液を抽出し、上層を回収します。この抽出操作をさらに2回繰り返し、計3回の抽出を行います。メタノールの量は、純粋なセレン化カドミウム量子ドットの濃縮ヘキサン溶液（約200 µM）を得るために、約15 mLに調整してもかまいません。

この反応の一般的な収量は、直径2〜3 nmの3 µMのセレン化カドミウム結晶です。記述された手順に従い、紫外可視吸収スペクトルを測定して、ナノ結晶の直径と濃度を決定します。吸収および蛍光放出をレッドシフトさせるために、ナノ結晶を水銀で部分的に置換することがあります。これを行うには、撹拌子を入れた20 mLのガラスバイアルにヘキサンとクロロホルムを混合し、そこにセレン化カドミウム量子ドット溶液、OLA、およびオクタン酸水銀を加えます。記述された手順に従ってナノ結晶を精製し濃度を決定した後、シェルの成長させるため、ナノ結晶を室温で少なくとも24時間エージングさせます。

50 mLの三口フラスコに0.1 Mのシェル前駆体溶液を調製し、真空下でカドミウム前駆体、亜鉛前駆体、および硫黄前駆体の溶液を1時間リフラックスさせ、透明な溶液を得ます。その後、三口フラスコにアルゴンを充填します。TOPO-ODEおよび調製したセレン化水銀カドミウム量子ドットを添加します。シュレンクラインを用いて、室温でヘキサンを真空排気します。

温度を100 °Cまで上げ、15分間還流させます。ラインバルブをアルゴンガスに切り替え、熱電対をnano Krystal溶液に挿入します。温度を120 °Cまで上げた後、0.5モノレイヤー（または140 µL）の硫黄前駆体溶液を加え、15分間反応させます。

温度を140 °Cまで上げます。カドミウム前駆体溶液を0.5モノレイヤー分、すなわち140 µL加え、15分間反応させます。その後、反応溶液に無水OLAを500 µL加えます。

160 °Cで、0.5 単分子層または 220 µLの硫黄前駆体溶液を加え、続いて170 °Cで同量の亜鉛前駆体溶液を、各添加の間に15 分の間隔を空けて加えます。次に180 °Cで、0.25 単分子層または 150 µLの硫黄前駆体溶液と亜鉛前駆体溶液を15 分間隔で加えます。溶液を室温まで冷却し、これらの粒子の新しい消衰係数を決定します。

UV-visスペクトルを用いて、ナノ結晶の数が変化していないと想定し、反応溶液を粗混合物としてフリーザーに保存します。この段階で、電子顕微鏡、UV-vis吸収分光法、および蛍光分光法を用いてナノ結晶を特性評価することが可能です。精製したコアシェル量子ドットを50 mLの三口フラスコに加え、高真空下でヘキサンを除去します。

ドライフィルムを得るために、フラスコをアルゴンで満たします。ナノ粒子フィルムに無水プリンを加え、1〜2時間かけてスラリーを80 °Cまで加熱します。これにより、ナノ粒子が完全に溶解します。

1 FIO グリセロールを1 mL溶液に加え、80 °Cで2時間撹拌します。溶液を室温まで冷却した後、チオグリセロールを脱プロトン化するためにトリエチルアミンを0.5 mL加え、30分間撹拌します。この溶媒混合物に対する極性ナノ結晶の溶解度が低いため、トリエチルアミンの添加後に溶液が白濁することがあります。

量子ドット溶液を、20 mLのヘキサンと20 mLのアセトンの混合液を含む50 mLコニカル遠心チューブに移し、よく混合します。遠心分離によって沈殿したナノ結晶を単離し、続いてアセトンでペレットを洗浄します。量子ドットのペレットを5 mLのDMSOに溶解させ、バスソニケーションを行った後、遠心分離を行います。これにより凝集物を除去し、その後、UV-Vis吸収スペクトルからナノ粒子の濃度を決定します。

純粋な量子ドット溶液は、空気中の環境条件下で表面が徐々に酸化するため、3時間以内に使用してください。量子ドット溶液をDMSOで10 µM以下に希釈し、50 mLフラスコに移します。攪拌しながら、調製済みの5 mg/mL DMSO希釈ポリアクリル酸溶液を量子ドット溶液に滴下し、室温で5分間脱気します。

量子ドットポリマー溶液をアルゴンでパージし、80 °Cで90分間加熱します。溶液を室温まで冷却した後、pH 8の50 mMホウ酸ナトリウムを同量ずつ滴下し、10分間撹拌します。記載された手順に従って量子ドットを精製し、UV-vis吸収スペクトルから濃度を決定します。撹拌子入りの4 mLガラスバイアル中で、1 molの量子ドットをホウ酸緩衝液中で、750 Daltonのモノアミノポリエチレングリコールを40,000倍モル過剰に加えて混合します。

ナノ結晶に特定の化学的機能性を付与する方法については、記述された手順書を参照してください。 freshly prepared 活性剤溶液を、量子ドット溶液に対して 25,000 倍のモル過剰量で迅速に添加し、室温で 30 分間撹拌します。この工程をさらに 4 回繰り返し、ナノ結晶の表面を PEG で飽和させます。

最後に、1 MのTris緩衝液を200 µL加えて反応を停止させ、透析遠心フィルターまたは超遠心分離を用いてナノ結晶を精製します。得られたナノ結晶の単分散性、流体力学的サイズ、および表面電荷は、液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および蛍光顕微鏡を用いて分析できます。ここでは、セレン化カドミウムナノ結晶、カチオン交換後の水銀・カドミウム・セレン化物ナノ結晶、およびシェル成長後のコア水銀・カドミウム・セレン化物／シェルカドミウム・硫化亜鉛ナノ結晶の代表的な吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示します。コアセレン化カドミウムナノ結晶の蛍光量子収率は約15%ですが、水銀交換後は、表面原子の乱れによって導入された電荷担体トラップが原因と考えられ、この効率は1%未満まで低下します。

硫化カドミウム亜鉛の薄いシェルを成長させることで、この効率は70%以上に向上し、水に転移した後もほぼ維持されます。対照的に、水銀を導入していないカドミウムセレンコア・硫化カドミウム亜鉛シェルナノ結晶は、厚いシェルを成長させない限り、水中で量子収率の大部分を喪失します。硫化カドミウム亜鉛でキャッピングすると、電子電荷担体がシェル材料に漏出するため、スペクトルがレッドシフトすることに注意が必要です。

このシフトは、カドミウムコアでは約20から30ナノメートルであり、コア中の水銀含有量が増えるにつれて増大します。したがって、コアナノ結晶に水銀を組み込むことで、輝度を損なうことなくナノ結晶の小サイズを維持することが可能です。この小サイズは、平均粒子径が3.2 ± 0.6ナノメートルであるコア水銀・カドミウム・セレン／シェルカドミウム・亜鉛硫化物ナノ結晶の透過電子顕微鏡写真および粒子径分布によって示されています。

水への2段階相転移を用いることは、クラスターや凝集物を取り除くためのさらなるサイズ排除によるサイズ分画を必要としない、均一なナノ結晶集団を得るために極めて重要です。ここに示したサイズ排除クロマトグラムは、サイズがコンアルブミンと同程度であることを裏付けています。75 kilodaltonsで、750 DaltonのアミノPEGで修飾した後、サイズはわずか12 nanometersまで増加し、これはIgG抗体と同程度です。

PEG修飾によって表面電荷が中和されることは、ここに示すアガロースゲル電気泳動実験で確認されており、ウェルは矢印で示され、右側に電極の極性が表示されています。これにより、接合前はナノ結晶が電荷を持つ粒子として移動し、PEG化されたナノ結晶は静電的に中性であることがわかります。ここでは、ガラスカバースリップ上に堆積させ、545 nanometerの可視光で励起したこれらのナノ結晶のエピ蛍光顕微鏡写真を示しています。これらのナノ結晶は、電子倍増CCDカメラを用いて、30 frames per secondで単一分子レベルで容易に観察することが可能です。

このプロットは、連続励起下において、各フレームで観察される蛍光粒子の数が時間とともに変動することを示しています。これは、ブリンキングと光劣化の両方が組み合わさった結果です。最初の7分間はブリンキングが支配的であり、その後、酸化的な光劣化が徐々に顕在化します。

このビデオを視聴することで、量子ドットの化学的合成方法、水性バッファーへの転移方法、およびバイオイメージングへの応用に向けた修飾方法について十分に理解することができるはずです。カドミウムや水銀を含む試薬を取り扱う際は極めて危険であるため、個人の被曝を防ぐために十分な予防策を講じることを忘れないでください。