1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット

この手順の全体的な目標は、1分子イメージングで使用するための最適化された輝度と安定性、最小サイズ、非特異的結合を備えた蛍光量子ドットを調製することです。これは、最初に小さなセレン化カドミウム量子ドットコアを準備することによって達成されます。2番目のステップは、これらのコアを水銀と合金化して、蛍光を赤色スペクトルにシフトし、輝度を高めることです。

次に、ナノ結晶上に薄い合金シェルを成長させ、蛍光発光を安定させます。最後のステップは、生物学的に不活性なポリエチレングリコールで修飾できる多歯状ポリマーを使用して、これらの粒子を有機溶媒から水性緩衝液に移すことです。最終的に、蛍光分光法、ゲルクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動を使用して、これらの粒子が明るい蛍光、コンパクトな流体力学的サイズ、および中性の静電荷特性を持ち、生物学における単一分子蛍光イメージングに適していることを示します。

これらの量子ドットが既存の市販材料と比較した場合の主な利点は、これらのナノ粒子が流体力学的サイズが大幅に減少していることです。小さな量子ドットは、蛍光強度の低下、蛍光安定性の低下、および青色スペクトルのみの蛍光によって悪影響を受けますが、水銀陽イオン交換プロセスを使用してこれらの影響を相殺しました。これらのナノ結晶は、混雑した生物学的環境で単一の生体分子の動的イメージングを可能にすることにより、生物物理学と細胞シグナル伝達における重要な質問に答えるのに役立ちます。

まず、50ミリリットルにセレンを加えて、上部にセレンの0.4モル溶液を準備します。3つのネックフラスコ、高真空下でフラスコを排気し、空気のない条件下でschシャンクラインを使用してアルゴンを充填します。10ミリリットルのトップを追加し、1時間攪拌しながら摂氏100度に加熱すると、無色の透明な溶液が得られます。

溶液を室温まで冷却し、フラスコを脇に置きます。また、書面によるプロトコルに記載されている量を使用して、250ミリリットルの3ネックフラスコに酸化カドミウムTDPAおよびODEの溶液を調製します。このビデオに添付して、攪拌しながらシャンクラインを使用して溶液を排気します。

温度を摂氏100度に上げ、さらに15分間避難させます。アルゴンヌガス下で低沸点不純物を除去するには、混合物を摂氏300度に1時間加熱して、酸化カドミウムを完全に溶解します。溶液は赤みがかった色から透明で無色に変化し、溶液を室温まで冷却します。

次に、カドミウム溶液にHDAを加え、摂氏70度に加熱して排気します。一定の圧力に達したら、温度を上げ、溶液を30分間還流します。シュリンクラインバルブを不活性ガスに切り替え、熱電対を直接溶液に挿入します。

空気のない条件下で、カドミウム溶液にDPPを加え、温度を摂氏310度に上げます。次に、16ゲージの針に取り付けられた使い捨てのプラスチック注射器を使用して、7.5ミリリットルの0.4モルの上部セレン溶液を取り除きます。温度が摂氏310度に平衡化したら、温度コントローラーを摂氏0度に設定し、上部のセレン溶液をカドミウム溶液に直接すばやく注入します。

溶液は無色から黄色、オレンジ色に変化し、温度は急速に低下し、再び摂氏約280度まで上昇します。この手順で最も難しいステップは、シリンジの全容積をできるだけ早くカドミウム溶液に注入することです。これにより、粒子が均一に核形成されます。

1分間の反応の後、フラスコを加熱マントルから取り外し、温度が摂氏200度未満になるまで空気の流れですばやく冷却します。温度が摂氏約40度に達すると、30ミリリットルのヘキサンで希釈すると、残りのカドミウム前駆体の大部分が溶液から沈殿します。この沈殿物を遠心分離により除去します。

6本の50ミリリットルポリプロピレン円錐形遠心分離チューブのそれぞれで、得られた粗ナノクリスタル溶液を12ミリリットル希釈します。同じパラメータで遠心分離した後、40ミリリットルのアセトンで、上清を慎重にデカントして廃棄します。次に、ナノクリスタルペレットをヘキサンに溶解します。

トップフェーズを保持したまま等量のメタノールで溶液を抽出します。この抽出をさらに 2 回繰り返して、3 回目の抽出を行います。メタノールの体積を約15ミリリットルに調整して、約200マイクロモルの純粋なセレン化カドミウム量子ドットの濃縮ヘキサン溶液を得ることができる。

この反応の典型的な収率は、2つの3ナノメートルの直径を持つ3マイクロモルのセレン化カドミウム結晶であり、書かれた手順に記載されているように紫外可視吸収スペクトルを測定することによりナノクリスタルの直径と濃度を決定し、ナノ結晶は部分的に水銀と交換されて赤方偏移し、吸収と蛍光発光することができます。これを行うには、攪拌子混合ヘキサンとクロロホルムを入れた20ミリリットルのガラスバイアルでこれを行うには、セレン化カドミウム量子ドット溶液OLAとオクタン酸水銀を加えます。ナノ結晶を精製し、書面に記載されているようにその濃度を決定した後、ナノ結晶を室温で少なくとも24時間老化させてシェル成長させます。

50ミリリットル、カドミウム前駆体、亜鉛前駆体、および硫黄前駆体の真空熱溶液下で0.1モルシェル前駆体溶液を3つのネックフラスコで調製し、1時間還流して透明な溶液を生成し、次にアルゴンで3つのネックフラスコに充填します。トポODEと調製した水銀カドミウムセレン化物量子ドットを追加します。ヘキシンを室温でフランクラインを使用して排気します。

温度を摂氏100度に上げ、15分間逆流させます。ラインバルブをアルゴンヌガスに変更し、熱電対をナノクリスタル溶液に挿入します。温度を摂氏120度に上げた後、0.5単層または140マイクロリットルの硫黄前駆体溶液を加え、反応を15分間進行させます。

温度を摂氏140度に上げます。0.5単層または140マイクロリットルのカドミウム前駆体溶液を加え、反応を15分間進行させます。次に、500マイクロリットルの無水OLAを反応溶液に加えます。

摂氏160度を加え、単層0.5個、または硫黄前駆体溶液220マイクロリットルを加え、続いて摂氏170度で等量の亜鉛前駆体溶液を15分間隔で加えます。次に、摂氏180度で、0.25単層、または150マイクロリットルの硫黄前駆体溶液と亜鉛前駆体溶液を15分間隔で追加します。涼しい。室温への解決策とこれらの粒子の新しい吸光係数。

紫外可視スペクトルを用いて、ナノ結晶の数が変わらないと仮定し、反応溶液を粗混合物として冷凍庫に保管します。この段階では、ナノ結晶は、電子顕微鏡、紫外可視吸収分光法および蛍光分光法を用いて特徴付けることができる。精製したコアシェル量子ドットを50ミリリットルの3ネックフラスコに加え、高真空下でヘキシンを除去します。

乾燥フィルムを生成するには、フラスコにアルゴンヌを入れます。ナノ粒子フィルムに無水プリンを添加し、スラリーを1〜2時間かけて80°Cに加熱します。ナノ粒子は完全に溶解します。

ミリリットルの1つのFIOグリセロールを溶液に加え、摂氏80度で2時間攪拌します。溶液を室温に冷却した後、0.5ミリリットルのトリエチルアミンを加えてチオグリセロールを脱プロトン化し、30分間攪拌します。この溶液は、この溶媒混合物中の極性ナノ結晶の溶解性が低いため、トリエチルアミンの添加後に曇ることがあります。

量子ドット溶液を、20ミリリットルのヘキサンと20ミリリットルのアセトンの混合物が入った50ミリリットルの円錐形遠心分離管に移し、よく混合します。沈殿したナノ結晶を遠心分離により単離し、続いてペレットをアセトンで洗浄し、量子ドットペレットを5ミリリットルのDMSOに溶解し、浴超音波処理を行い、続いて遠心分離を行う。可能な凝集体を除去するには、UV V吸収スペクトルからナノ粒子濃度を決定します。

純粋な量子ドットの溶液は、空気中の周囲条件下で表面がゆっくりと酸化する可能性があるため、3時間以内に使用する必要があります。量子ドット溶液をDMSOで10マイクロモル以下に希釈し、50ミリリットルのフラスコに移します。DMSO中の拡張ポリアクリル酸の調製1ミリグラム/ミリリットル溶液を量子ドット溶液に滴下し、攪拌しながら溶液を室温で5分間脱気します。

量子ドットポリマー溶液をアルゴンヌでパージし、80°Cに90分間加熱します。溶液を室温に冷却した後、等量の50ミリモルナトリウム塩味pH8滴加え、10分間攪拌します。書かれた手順に記載されているように量子ドットを精製し、攪拌棒付きの4ミリリットルガラスバイアル内のUV/vis吸収スペクトルから濃度を決定し、ホウ酸緩衝液中の1モル量子ドットを750ダルトンモノアミノポリエチレングリコールの40,000倍モル超過で

手順は、ナノ結晶に特定の化学的機能を追加する方法に関する手順書に記載されています。活性化剤溶液の新たに調製された溶液のモル過剰を25, 000倍以上量子ドット溶液に素早く加え、室温で30分間攪拌します。この手順をさらに4回繰り返して、ナノクリスタル表面をPEGで飽和させます。

最後に、200マイクロリットルの1モルトリスバッファーを添加して反応を急冷し、ナノ結晶を精製する前に透析遠心フィルターまたは超遠心分離を使用して、得られたナノクリスタルは、液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、蛍光顕微鏡を使用してモノ分散性の流体力学的サイズと表面電荷を分析できます。ここに示されているのは、カドミウムセレン化物ナノ結晶、水銀、カドミウム、セレン化物、カチオン交換後のナノ結晶、およびシェル成長後のコア水銀カドミウムセレン化物、シェルカドミウム、硫化亜鉛ナノ結晶の代表的な吸収スペクトルと蛍光スペクトルです。コアセレン化カドミウムナノ結晶は、蛍光の量子収率が約15%ですが、この効率は水銀交換後に1%未満に低下しますが、これはおそらく表面原子の破壊によって導入された電荷キャリアトラップによるものです。

硫化カドミウム亜鉛の薄い殻の成長は、この効率を70%以上に向上させます。これは、水への移動後も主に維持されます。対照的に、水銀を組み込んでいないコアセレン化カドミウム、シェルカドミウム、硫化亜鉛ナノ結晶は、厚いシェルを成長させない限り、水中での量子収率のかなりの部分を失います。硫化カドミウム亜鉛でキャッピングすると、電子電荷キャリアがシェル材料に漏れるため、スペクトルが赤にシフトすることに注意することが重要です。

このシフトは、コアのカドミウムコアで約20〜30ナノメートルであり、コア内の水銀含有量が増加するにつれて増加します。このように、コアナノ結晶に水銀を組み込むことで、明るさを犠牲にすることなくナノクリスタルの小型化を維持することができます。この透過型電子顕微鏡写真と、コア水銀、カドミウム、セレン化物、シェルカドミウム、硫化亜鉛ナノ結晶の粒度分布は、平均直径3.2±0.6ナノメートルを示しています。

水への2段階の相移動の使用は、ナノ結晶の均質な集団を得るために重要であり、ナノ結晶の均一な集団を得るため、クラスターや凝集体を除去してサイズ排除を解消する必要がありません。ここに描かれているクロマトグラムは、サイズがコンアルブミンのサイズと類似していることを裏付けています。75キロダルトンで750ダルトンのアミノPEGで修飾すると、サイズはわずか12ナノメートルに拡大し、IgG抗体と同様になります。

PEG修飾は、ここに描かれたarosゲル電気泳動実験で確認されたように、表面電荷を中和し、ウェルには矢印が付いており、右側に電極の極性が示されており、結合前にナノ結晶がオン粒子として移動し、PEG化ナノ結晶が静電的に中性であることを示しています。ここに示されているのは、ガラスカバースリップ上に堆積し、545ナノメートルの可視光で励起されたこれらのナノ結晶の落射蛍光顕微鏡写真です。これらのナノ結晶は、電子増倍CCDカメラを用いて、毎秒30フレームで1分子レベルで容易に観察することができます。

このプロットは、各フレームで観察される蛍光粒子の数が、連続的な励起によって時間とともに変動することを示しています。これは、点滅と写真の劣化の組み合わせによるものです。最初の7分間はまばたきが支配的でしたが、その後、酸化的な写真の劣化がゆっくりと明らかになります。

このビデオを見れば、量子ドットを化学合成する方法、量子ドットを水性バッファーに移す方法、バイオイメージングアプリケーション用に量子ドットを修飾する方法を十分に理解できるはずです。カジウムや水銀を含む試薬の取り扱いは非常に危険であり、個人の曝露を防ぐために特別な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。