Name: 1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: 学ぶ 単一分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドットの調製法。カドミウムセレン化物コアに水銀を合金化し、薄い合金シェルを成長させ、多座ポリマーで水相に移行させることで、高輝度・高安定性・小サイズ・低非特異的結合を実現する。

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著者らは、電子顕微鏡イメージングのためのエモリー大学の統合顕微鏡コアで博士香港李に感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金（PN2EY018244、R01 CA108468、U54CA119338、そして1K99CA154006-01）が主催した。

以下の合成手順は、標準的な空気のない技術や真空/不活性ガスマニホールドの使用を含む、詳細な方法論は、10と11の参考文献に記載されています。すべての潜在的に有毒で引火性の物質のMSDSは、使用する前に相談する必要があり、すべての可燃性および/または空気に不安定な化合物は、グローブボックスやグローブバッグ内セプタム密封バイアルに分注しなければならない。 1。水銀カドミウムセレン化水銀（Hg X CD 1-X SE）量子ドットのコアの合成<ol><li>トリオクチルホスフィン（TOP）にセレンの0.4M溶液を調製します。 50ミリリットルの3つ口フラスコにセレン（0.316グラム、4ミリモル）を加え、その後、避難及びアルゴンシュレンラインを使用して記入してください。空気のない状態（乾燥窒素またはアルゴン雰囲気）、10mlのTOPを追加して、100℃に加熱下で、無色透明の溶液を得た1時間攪拌した。室温への解決策を冷却し、脇フラスコを設定します。 </li><li> 250mlの3つ口フラスコに、酸化カドミウムを追加（CdOの0.0770グラム、0.6ミリモル）、テトラデシルホスホン酸（TDPA、0.3674グラム、1.32 mmol）、およびオクタデセン（ODE、27.6ミリリットル）、攪拌しながらシュレンクラインを使用してソリューションを避難させる。 100℃まで温度を高め、低沸点不純物を除去するために、さらに15分間避難してください。 </li><li>アルゴンまたは窒素ガス下で、完全にCDOを溶解させるために1時間300℃に混合物を加熱する。解決策は、無色透明に赤みを帯びた色に変わります。室温への解決策を冷やす。 </li><li> 、カドミウム溶液にヘキサを（HDA、7.0グラム）を加え70℃に加熱して、避難してください。一定の圧力が達成されれば、100から110℃、30分間加熱還流液に温度を上昇させる。不活性ガスにシュレンラインバルブを切り替えて、ソリューションに直接熱電対を挿入します。 </li><li>空気を含まない条件下で、溶液中にジフェニルを（DPP、100μl）を追加し、310℃まで温度を上げる0.4MのTOP-Seの溶液を7.5ミリリットルを削除（3ミリモルセレン）16ゲージの針に取り付けられた使い捨てプラスチックシリンジインチ</li><li>温度は310℃で平衡化したら、0に温度調節器をセット℃、迅速カドミウム溶液に直接TOP-Seの溶液を注入する。溶液は黄色〜オレンジ色に無色から変更され、温度はすぐにドロップすると、〜280℃に再び増加します温度が200℃未満になるまで反応の1分後、加熱マントルからフラスコを取り外し、空気の流れを迅速クール</li><li>温度が約40に達したとき℃、30ミリリットルをヘキサンで希釈し、残りのカドミウム前駆体のほとんどは、溶液から沈殿する。遠心分離（5,000×g、10分間）することにより、この沈殿物を除去。 </li><li> 6 50mlポリプロピレンコニカル遠心チューブの各々において、40mlのアセトン、遠心（10分間5000×g）であり、慎重にデカントで原油ナノ結晶溶液12mlを希釈し、上清を捨てる。 </li><li> nanocrを溶かすヘキサン中ystalペレット（25ミリリットル全容積）。上相を保持し、メタノールの等量でこのソリューションを3回抽出する。 3回目の抽出については、メタノールの体積は約200μMで純粋CdSe量子ドットの濃ヘキサン溶液を得るために〜15mlに調整することができる。この反応の典型的な収率は2.3ナノメートル（50〜60％の反応収率）の直径を有するCdSeナノ結晶の3モルである。 </li><li> UV-Vis吸収スペクトルを測定し、マルヴェイニーや同僚12のサイズにフィットするチャートとBawendiや同僚13の絶滅の相関関係を調べることによってナノ結晶径と濃度を決定する。詳細については、付録Aを参照してください。 </li><li>マーキュリーの陽イオン交換：ナノ結晶が部分的に吸収し、蛍光発光を赤にシフトする水銀と交換することができる。 3ミリリットルヘキサン、2 mlのクロロホルム、1ミリリットル200μMのCD：撹拌棒を備えた20 mlのガラスバイアル（この反応は、必要に応じてスケーリングされる）順序で一緒に次のように混ぜるSE QD溶液（200 nmol）を、15μlのオレイルアミン（OLA）、クロロホルム中のHg（OT）2の0.1M溶液500μl。マーキュリーoctanethioate（HgOT 2）（付録参照）をメタノールに酢酸水銀とオクタンチオールを反応させることにより調製することができる。陽イオン交換反応が進行するにつれて、赤方偏移の程度は、紫外可視吸光光度法で監視することができる。所望の吸収バンドが達成された後、350 nmのナノ結晶溶液の吸収を測定し、ナノ結晶の濃度は（この例では30.7μM）で変更されていないことを前提として、新たな吸光係数を決定する。未反応の水銀を除去することにより、反応をクエンチ：5ミリリットルデカン、10mlのヘキサン、7 mlのメタノールを追加して、ナノ結晶を含む上相を維持し、解決策を抽出します。ヘキサンとメタノールでさらに2回抽出し、上相が約7ミリリットルになるようにメタノールの音量を調整します。相が分離することが遅い場合は、溶液（5000×gで遠心分離し、することができる10分）。沈殿を誘導するために40mlのアセトンに続いてナノ結晶に100μlのTOP、OLAを100μl、100μlのオレイン酸を追加します。遠心分離によりナノ結晶を収集し、3 mlのヘキサン中に分散。不溶成分を除去し、350 nmでの新しい吸光係数を用いて、再びナノ結晶の濃度を決定するために、再び遠心分離します。次のステップに進む前に、室温で少なくとも24時間エージングするナノ結晶溶液を許可します。 </li></ol> 2。カドミウム硫化亜鉛の成長（CD YのZn 1-Y S）シェル<ol><li> 50ミリリットルの3つ口フラスコに0.1 M殻前駆体溶液を準備します。カドミウム前駆体：酢酸カドミウム水和物（230.5 mg、1 mmol）を、10mlのオレイルアミン（OLA）。亜鉛前駆体：酢酸亜鉛（183.5 mg、1 mmol）をおよびOLA 10ミリリットル。硫黄前駆：硫黄（32.1 mg、1 mmol）を10ミリリットルとODE。真空下で、明確な解決策を得るために1時間還流し、それぞれの溶液を加熱した後、アルゴンで充電してください。硫黄溶液月室温に冷却することが、カドミウムおよび亜鉛前駆体は、約50℃に維持されているシェル前駆体の量の計算は、基準14に記載されています。 </li><li>水銀X CD 1-X SE量子ドット（120ナノモル、2.3 nmの直径）は、ODE（2 ml）に溶解し、トリオクチルホスフィンオキシド（TOPO、250mg）を3口フラスコに入れる。シュレンク·ラインを使用して室温でヘキサンをオフに避難してください。 100℃、15分間還流する温度を上げます。アルゴンや窒素ガスにシュレンラインバルブを変更して、ナノ結晶溶液の熱電対を挿入します。 </li><li> 120に温度を上げ℃、硫黄前駆体溶液の0.5単層（140μl）を追加し、反応は15分​​間続行できるようになります。小アリコート（&lt;50μl）を蛍光および/またはUV-Vis吸収分光光度計を用いて反応の進行状況を監視するために、ガラスシリンジを用いて除去することができる。 140に温度を上げ℃、カドミウム前駆体溶液の0.5単層を追加します（140μL）を加え、反応を15分間進行させる。反応液に500μlの無水OLAを追加します。 </li><li> 160℃の各添加の間、15分で170℃の亜鉛前駆体溶液の等量続い硫黄前駆体溶液の0.5単層（220μl）を°Cを追加。その後、180°Cの硫黄前駆体溶液（150μL）および15分インターバルで亜鉛前駆体溶液の0.25単層を追加します。 </li><li>室温への解決策を冷却して再ナノ結晶の数は（3.8 ml反応液中の120 nmol）が変更されなかったと仮定し、UV-Visスペクトルを使用して、これらの粒子のための新たな吸光係数を計算します。冷凍庫で粗混合物として反応液を保管してください。セクション1.8と1.9で説明したのと同じ方法を使用して、必要に応じてナノ結晶が融解し、精製することができる。 </li><li>ナノ結晶は、電子顕微鏡、UV-Vis吸収分光、蛍光分光法を用いて特徴付けることができる。量子収率はかもしれないリファレンス15のメソッドを使用して、既知の標準と比較して絶対的に積分球を用いて、または比較的計算。 </li></ol> 3。相間移動<ol><li> 50ミリリットルの3つ口フラスコに、コア/シェル水銀X CD 1-X SE / CD YのZn 1-Y S量子ドット（5ミリリットル、20μM）を追加し、精製したドライフィルムを得るために、高真空下でヘキサンを除去する。 ℃のスラリーを80ナノ粒子膜と熱に無水ピリジン（3ミリリットル）を追加し、アルゴンでフラスコを埋める1〜2時間のコースでナノ粒子が完全に溶解します。 </li><li>液に1 - チオグリセロール（1ミリリットル）を加え、80℃で攪拌℃で2時間インキュベートする。その後、室温まで冷却し、解決策をチオグリセロールを脱プロトン化し、トリエチルアミン（0.5 ml）を加える。 30分間かき混ぜる。解決策は、この混合溶媒中の極性ナノ結晶の溶解性が悪いが原因でトリエチルアミンを添加した後に曇ることがあります。 </li><li> 50mlコニカル遠心管の続きにQDのソリューションを転送20mlのヘキサンと20 mlのアセトンの混合物をaining、よく混ぜる。遠心分離（5,000×g、10分間）を介してナノ結晶沈殿を分離して、アセトンでペレットを洗浄。 </li><li>浴超音波処理とDMSO中QDペレットを（5ml）に溶解した後、可能な凝集物を除去するために遠心分離（7,000×g、10分間）。 UV-Vis吸収スペクトルから、ナノ粒子の濃度を測定します。表面チオールがゆっくりと空気中の周囲条件下で酸化させることができるように純粋な量子ドットのこのソリューションは、3時間以内に使用してください。 </li><li> DMSOで10μm以下にQDの溶液を希釈し、50 mlのフラスコに移す。 DMSO中のチオールポリアクリル酸（付録に記載されている合成）の5 mg / mlの溶液を調製します。 5分間室温で溶液を攪拌して脱気しながらQD溶液に滴下してポリマー溶液（nmolの量子ドットあたり0.15ミリグラムポリマー）を追加します。 </li><li>アルゴン80〜熱°Cで90分間持つQD /ポリマー溶液をパージします。その後、室温まで冷却ソリューションをdは滴下50mMホウ酸ナトリウム、pH8の等量のを追加します。 10分間かき混ぜる。 </li><li> 50mMホウ酸ナトリウム、pH8中透析（20kDaのカットオフ）を介して量子ドットを浄化した後、遠心フィルター（10kDaのカットオフ）を使用して粒子を濃縮。 UV-Vis吸収スペクトルから濃度を決定する。 </li></ol> 4。 PEGのコーティング<ol><li>攪拌棒を備えた4 mlのガラスバイアル中で、750ダモノアミノ - ポリエチレングリコール（30 mgを、40マイクロモル）の40,000 Xモル過剰のホウ酸緩衝液中の1 nmolの量子ドットを混在させる。特定の化学物質の機能がナノ結晶（ 例えばヒドラジドまたはマレイミド）に追加する場合には、これはヘテロ二アミノ-PEGとアミノ-PEG（30％のモル分率は、典型的にはうまく機能）の一部を置き換えることにより導入することができる。ホウ酸緩衝液と1μMのナノ結晶溶液を希釈します。必要に応じて、この反応は、スケーリングすることができる。 </li><li> DMSO中DMTMMた（20mg、72マイクロモル）（144μl）を新鮮な溶液を調製します。このソリューションは簡単に加熱することができるU暖かい水道水の流れをNDERまたは完全DMTMMを溶解させるために風呂に沈めソニケーター。迅速QDソリューションにこの0.5MのDMTMMソリューションの25000 Xモル過剰（50μl）を加え、30分間室温でかき混ぜる。 </li><li> PEGを用いてナノ結晶表面を飽和させるために4.2 4回以上繰り返します。最後に、反応をクエンチし、200μlの1Mトリス緩衝液を追加して、透析、遠心フィルタ、または遠心分離を使用してナノ結晶を精製する。 </li><li>ナノ結晶は、単分散、流体力学的サイズ、液体クロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、蛍光顕微鏡を用いて表面電荷のために分析することができる。自動液体クロマトグラフィーシステム（GE AKTAprime Plus）を使用して流体力学的サイズとサイズ分布を決定するには、260または280 nmでスーパーロース6カラム、PBS緩衝液で0.5 ml / minの流速、および吸収検出を使用しています。分子量標準のものとナノ粒子の溶出時間を比較します。アガロースゲルelectropho用抵抗は、50mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）または50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）、0.5％アガロースゲルを準備し、ウェルに10％グリセロールおよび負荷で1μMの試料を混合し、30分間、100Vで実行。紫外線ハンドワンドまたはUVトランスイルミネーターを用いたゲルと蛍光励起用のイメージナノ結晶を。蛍光顕微鏡を用いた単一分子レベルで画像ナノ結晶に、カバーガラス上に溶液2.5μlをドロップし、10mMリン酸緩衝液で0.2 nMの粒子を希釈し、慎重に広めるために液体ビーズの上に別カバースリップを置くカバーガラスの間にフィルム。画像400から580 nmおよび電子増倍CCDカメラの間の波長での励起による落射蛍光または全反射モードのいずれかで高開口数対物（理想的には少なくとも1.40）を用いて、表面に結合した粒子を。正確な撮像パラメータは、顕微鏡のセットアップの間で異なります。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

従来のCdSe量子ドットに比べて、三元合金のHg X CD 1-X SEナノ結晶は、独立して大きさと蛍光波長に同調させることができる。サイズは、第1 CdSeナノ結晶コアの合成時に選択され、蛍光波長は、実質的にナノサイズ9を変えない二水銀カチオン交換工程で選択されます。精製された水銀X CD 1-X Seのナノ結晶がキャッピング前に、少なくとも24時間室温でインキュベートすることができますすることが重要です。これが弱く吸着水銀陽イオンの一部が結晶格子中に拡散することができます。このプロセスが発生させることなく、近赤外における第2の蛍光バンドがしばしば解離水銀イオンからHGSナノ結晶の均一核生成に起因して観測されています。 この仕事に示す例では、なることができる、2.3 nm付近サイズでCdSeのコアを用意コア格子に組み込ま水銀の量を変えることにより、キャッピング後に550から800 nmの間の蛍光にチューニング。 2.5単層シェルでは、これらの量子ドットの最終的な直径は、本質的に我々は単一分子イメージングのために十分...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>セレン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 229865 </td><td></td></tr><tr><td>トリ-n-オクチル</td><td>ストレム</td><td> 15から6655 </td><td>空気中で不安定で、97％の純度</td></tr><tr><td>酸化カドミウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 202894 </td><td>非常に有毒：使用注意</td></tr><tr><td>テトラデシルホスホン酸</td><td> PCIの合成</td><td> 4671-75-4 </td><td></td></tr><tr><td>オクタデセン</td><td> Alfa Aesar社</td><td> L11004 </td><td>工業銘柄</td></tr><tr><td>ヘキサ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H7408 </td><td></td></tr><tr><td>ジフェニル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 252964 </td&gt; <td>自然発火性の</td></tr><tr><td>酢酸水銀</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 456012 </td><td>非常に有毒：使用注意</td></tr><tr><td> 1 - オクタンチオール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 471836 </td><td>悪臭</td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> W281506 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸亜鉛</td><td> Alfa Aesar社</td><td> 35792 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸塩水和物カドミウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 229490 </td><td>非常に有毒：使用注意</td></tr><tr><td>オレイルアミン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> AC12954 </td><td>空気中で不安定である</td></tr><tr><td>硫黄</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 344621 </td><td></td></tr><tr><td>トリオクチルホスフィンオキシド</td><td>ストレム</td><td> 15から6661 </td><td> 99パーセント</td></tr><tr><td>ピリジン</td><td> VWR </td><td> EM-PX2012から6 </td><td>無水</td></tr><tr><td>チオ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M1753 </td><td>悪臭</td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 471283 </td><td>無水</td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>スペクトラムラボ</td><td> 131342 </td><td> 20kDaのカットオフ</td></tr><tr><td>遠心ろ過機</td><td>ミリポア</td><td> UFC801024 </td><td> 10kDaのカットオフ</td></tr><tr><td>モノアミノ-PEG </td><td>ラップPolymere </td><td> 12 750から2 </td><td> 750ダ</td></tr><tr><td> DMTMM、4 - （4,6 - ジメトキシ-1,3,5 - トリアジン-2 - イル）-4 - メチルモルホリニウムクロリド水和物</td><td> Alfa Aesar社</td><td> H26333 </td><td></td></tr><tr><td> AKTAprimeプラスクロマトグラフィーシステム</td><td> GEヘルスケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スーパーロース6 10/300 GLカラムクロマトグラフィー</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td>アガロース、OmniPur </td><td> VWR </td><td> EM-2120 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>付録 水銀octanethiolateの合成 ：ゆっくり1 -オクタンチオール（3当量）を、室温でメタノール中の水酸化カリウム（3当量）の撹拌溶液に酢酸水銀（1当量）のメタノール溶液を加える。濾過により水銀（II）octanethiolate沈殿を分離し、真空下で乾燥した後、メタノールで2回洗浄し、一度エーテルで、と。 多座ポリマーの合成 ：30分間アルゴンを150ミリリットルの三口フラスコと泡で25mlのジメチルホルムアミド（DMF）中のポリアクリル酸（1g、1773 Da）を溶かす。 10mlのDMF中のシステアミン（374ミリグラム、4.87 mmol）の無水溶液を加える。激しく撹拌しながら室温では、ゆっくりと無水ジイソプロピルを追加（トリエチルアミン（170μL、1.22 mmol）を加え、反応を60℃で72時間進行させる℃に続いて30分、オーバーDIC、736ミリグラム、5.83 mmol）を反応を停止させ、室温で2時間撹拌し（501ミリグラム、6.41 mmol）のメルカプトエタノールを追加します。ロータリーエバポレーターを介してDMFを除去し、氷冷アセトンの2:1混合物を添加してポリマーを単離：続いて遠心分離し、クロロホルム。ジエチルエーテル、リピートで再度沈殿〜5ミリリットル無水DMF、フィルター、中のポリマーを溶かす。アルゴン下で真空や店舗で製品を乾燥させてください。 CdSeコア径の決定 ：UV-Vis吸収スペクトルから最長波長のピーク（ 例えば 図2a中のCdSeのためのおよそ498 nm）である第一励起子ピーク（λ、nm単位）の波長を決定し、使用マルヴェイニーや同僚12の曲線をサイジング： <img src="/files/ftp_upload/4236/4236eq1.jpg" alt= &quot;式1&quot; /&gt; CdSeナノ結晶の濃度の測定 ：CdSeナノ結晶の光学的に透明な液のバックグラウンド減算UV-Visスペクトルから、350nmの波長での吸光度を決定します。連続希釈液は、光の吸収はBeerの法則の線形範囲内にあるかどうかを判断するために使用できます。ナノ結晶の濃度は（QD、M中）から次の式にナノ結晶粒径（D、nm単位）、光吸収値（3SA）、およびキュベット·パスの長さ（cm単位リットル ）を接続することによって決定することができるBawendiや同僚13の経験的相関： <img src="/files/ftp_upload/4236/4236eq2.jpg" alt="式（2）" /></td></tr></tbody></table>

1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

1分子イメージングは、生体分子機能のメカニズムを理解するための細胞生物学1-4根底にある分子の挙動の空間的および時間的異質性を可視化するための重要なツールです。画像興味のある個々の分子には、それは一般的に蛍光タグ（染料、タンパク質、ビーズ、または量子ドット）にコンジュゲートと落射蛍光または全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡で観察しています。色素や蛍光タンパク質は何十年​​も蛍光イメージングの主力となっているが、それらの蛍光は、信号が完全に失われる前に、観測の数秒しかもたらして、個々の分子を観察するために必要な高い光子フラックス下では不安定である。ラテックスビーズと色素標識ビーズが改善された信号安定性を提供しますが、有害な研究対象の分子の拡散挙動を変更することができます大幅に大きい流体力学的サイズを犠牲にして。 ntent &quot;は&gt;量子ドット（QD）は、これら二つの問題が政権の間のバランスを提供します。これらのナノ粒子は半導体材料で構成され、光分解5〜並外れた耐性を有する流体力学的にコンパクトなサイズで設計することができるため、近年、量子ドットは有効に尽力されました単一分子レベルでの複雑な高分子の挙動の長期観測。しかし、これらの粒子はまだそのような彼らのサイズがまだ大きすぎる4,6細胞質および神経シナプス間隙などの混雑した環境での分子拡散障害を示すことが見出された、7。 コロイド安定性、光安、明るさ、過去8,9にコンパクトQDの効用を妨げてきた非特異的結合に対するオフセットバランスを取りながら、最近我々は、コアおよび流体力学的サイズを最小化するための量子ドットの表面コーティングを設計した。この記事の目的は、実証することである絶縁カドミウム亜鉛Y 1-Y Sシェル、短いポリエチレングリコールで修飾された多座配位高分子でさらに被覆（でコーティングされた合金化水銀X CD 1-X SEのコアで構成され、これらの最適化されたナノ結晶の合成、修正、および特性PEG）鎖（ 図1）。従来のCdSeナノ結晶と比較して、水銀X CD 1-X SE合金は強化された細胞内の信号対雑音、非細胞毒性可視波長での励起のために赤と近赤外波長の蛍光、蛍光の大きい量子収率を提供します。多座ポリマーコーティングは、流体力学的サイズを最小にするために閉鎖とフラットなコンフォメーションでナノ結晶表面に結合し、PEGは細胞や生体分子に非特異的な結合を最小限に抑えるために表面電荷を中和する。最終的な結果は、550から800 nmおよび12 ​​nm付近合計流体力学的サイズとの間の発光と明るい蛍光ナノ結晶である。これは、sにありますAMEサイズの細胞には多くの水溶性球状タンパク質などの範囲、および従来のPEG化された量子ドット（25-35 nm）に比べてかなり小さい。

図2は、CdSeナノ結晶、陽イオン交換後の水銀X CD 1-X SEナノ結晶、およびHg X CD 1-X SE / CD Y Znの殻の成長後の1-Y Sナノ結晶の代表的な吸収および蛍光スペクトルを示す。コアのCdSeナノ結晶は15％近くに蛍光の量子収率を持っている（長波長ディープトラップの排出を含む）が、この効率は、表面原子の中断9を通じて導入されたキャリアのトラップを充電によって生じる可能性が高い、水銀交換後は1％未満に低下します。しかしカドミウムYのZn 1-yを Sの薄いシェルの成長は、主に水（50％が典型的である）への移転後 ​​も維持される70％以上にこの効率を向上させます。厚い殻が栽培されていない限り、それとは対照的に、水銀の取り込みなしのCdSe / CD YのZn 1-Y Sナノ結晶は、水にそれらの量子収率のかなりの部分を失う。従ってコアnanocrystaに水銀を組み込むことにより、リ...

我々は、単一分子蛍光イメージングのための最小限に流体力学的サイズを有するコロイド量子ドットの調製を記載している。従来の量子ドットに比べ、これらのナノ粒子はサイズが球状タンパク質と類似しており、単一分子の明るさ、光分解に対する安定性、タンパク質や細胞への非特異的な結合への抵抗のために最適化されています。

単分子イメージングは、バイオ分子機能のメカニズムを理解し、空間的および時間的な...を可視化するための重要なツールである。

本手順の全体的な目的は、単一分子イメージングに使用するために、輝度と安定性を最適化し、サイズと非特異的結合を最小限に抑えた蛍光量子ドットを作製することです。これはまず、小さなセレン化カドミウム量子ドットコアを作製することで達成されます。次に、これらのコアに水銀を合金化させ、蛍光を赤色スペクトルへシフトさせ、輝度を高めます。次に、蛍光発光を安定させるために、ナノ結晶上に薄い合金シェルを成長させます。最終ステップとして、多座ポリマーを用いてこれらの粒子を有機溶媒から水性バッファーへ転移させます。このポリマーは、生物学的に不活性なポリエチレングリコールで修飾することが可能です。最終的に、蛍光分光法、ゲルクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動を用いて、これらの粒子が強い蛍光、コンパクトな流体力学的サイズ、および中性の静電電荷を有しており、生物学における単一分子蛍光イメージングに適した特性を備えていることを示します。これらの量子ドットの既存の市販材料に対する主な利点は、ナノ粒子の流体力学的サイズが大幅に減少していることです。量子ドットが小さくなると、蛍光強度の低下、蛍光安定性の低下、および青色スペクトルのみで蛍光を発するという悪影響がありますが、水銀カチオン交換プロセスを用いることで、これらの影響を相殺しました。これらのナノ結晶は、混雑した生物学的環境における単一バイオ分子のダイナミックイメージングを可能にすることで、生物物理学および細胞シグナル伝達における重要な疑問への回答に寄与します。まず、50 mLの三口フラスコにセレンを加え、高真空下でフラスコ内を排気し、シュレンクラインを用いて脱気条件下でアルゴンで充填して、TOP中に0.4 Mのセレン溶液を調製します。10 mLのTOPを加え、攪拌しながら100 °Cまで加熱し、1時間保持して、澄明で無色の溶液を得ます。溶液を室温まで冷却し、フラスコを置いておきます。また、書面によるプロトコルに記載された分量を用いて、250 milliliterの三口フラスコに酸化カドミウム、TDPA、およびODEの溶液を調製します。このビデオに合わせて、攪拌しながらシュレンクラインを用いて溶液を脱気します。温度を100 °Cまで上げ、さらに15分間排気します。アルゴンガス下で低沸点不純物を除去するため、混合物を300 °Cで1時間加熱し、酸化カドミウムを完全に溶解させます。溶液は赤色から透明で無色に変化します。溶液を室温まで冷却してください。次に、カドミウム溶液にHDAを加え、70 °Cまで加熱して排気します。圧力が一定になったら、温度を上げて溶液を30分間還流させます。シュレンクラインのバルブを不活性ガスに切り替え、熱電対を溶液に直接挿入します。脱気条件下で、カドミウム溶液にDPPを加え、温度を310 °Cまで上昇させます。次に、16ゲージの針を装着した使い捨てプラスチック製シリンジを用いて、0.4 MのTOPセレン溶液を7.5 mL分採取します。温度が310 °Cで安定したら、温度コントローラーを0 °Cに設定し、TOPセレン溶液をカドミウム溶液に迅速に直接注入します。溶液は無色から黄色、オレンジ色へと変化し、温度は急激に低下した後、再び約280 °Cまで上昇します。この手順で最も困難なステップは、シリンジの全量をできるだけ速くカドミウム溶液に注入することです。これにより、粒子が均一に核生成されます。1分間反応させた後、フラスコを加熱マントルから取り出し、温度が200 °C以下になるまでエアフローで速やかに冷却します。温度が約40 °Cに達したら、30 mLのヘキサンで希釈します。すると、残っているカドミウム前駆体の大部分が溶液から析出します。この沈殿物を遠心分離によって除去してください。6本の50 milliliterポリプロピレン製コニカル遠心チューブに、得られた粗nano Krystal溶液を12 millilitersずつ分注して希釈します。同様の条件で遠心分離を行った後、40 millilitersのアセトンを用いて、上清を慎重にデカントして廃棄します。次に、nano krysttalペレットをヘキサンに溶解させます。同量のメタノールで溶液を抽出し、上層を回収します。この抽出操作をさらに2回繰り返し、計3回の抽出を行います。メタノールの量は、純粋なセレン化カドミウム量子ドットの濃縮ヘキサン溶液（約200 µM）を得るために、約15 mLに調整してもかまいません。この反応の一般的な収量は、直径2〜3 nmの3 µMのセレン化カドミウム結晶です。記述された手順に従い、紫外可視吸収スペクトルを測定して、ナノ結晶の直径と濃度を決定します。吸収および蛍光放出をレッドシフトさせるために、ナノ結晶を水銀で部分的に置換することがあります。これを行うには、撹拌子を入れた20 mLのガラスバイアルにヘキサンとクロロホルムを混合し、そこにセレン化カドミウム量子ドット溶液、OLA、およびオクタン酸水銀を加えます。記述された手順に従ってナノ結晶を精製し濃度を決定した後、シェルの成長させるため、ナノ結晶を室温で少なくとも24時間エージングさせます。50 mLの三口フラスコに0.1 Mのシェル前駆体溶液を調製し、真空下でカドミウム前駆体、亜鉛前駆体、および硫黄前駆体の溶液を1時間リフラックスさせ、透明な溶液を得ます。その後、三口フラスコにアルゴンを充填します。TOPO-ODEおよび調製したセレン化水銀カドミウム量子ドットを添加します。シュレンクラインを用いて、室温でヘキサンを真空排気します。温度を100 °Cまで上げ、15分間還流させます。ラインバルブをアルゴンガスに切り替え、熱電対をnano Krystal溶液に挿入します。温度を120 °Cまで上げた後、0.5モノレイヤー（または140 µL）の硫黄前駆体溶液を加え、15分間反応させます。温度を140 °Cまで上げます。カドミウム前駆体溶液を0.5モノレイヤー分、すなわち140 µL加え、15分間反応させます。その後、反応溶液に無水OLAを500 µL加えます。160 °Cで、0.5 単分子層または 220 µLの硫黄前駆体溶液を加え、続いて170 °Cで同量の亜鉛前駆体溶液を、各添加の間に15 分の間隔を空けて加えます。次に180 °Cで、0.25 単分子層または 150 µLの硫黄前駆体溶液と亜鉛前駆体溶液を15 分間隔で加えます。溶液を室温まで冷却し、これらの粒子の新しい消衰係数を決定します。UV-visスペクトルを用いて、ナノ結晶の数が変化していないと想定し、反応溶液を粗混合物としてフリーザーに保存します。この段階で、電子顕微鏡、UV-vis吸収分光法、および蛍光分光法を用いてナノ結晶を特性評価することが可能です。精製したコアシェル量子ドットを50 mLの三口フラスコに加え、高真空下でヘキサンを除去します。ドライフィルムを得るために、フラスコをアルゴンで満たします。ナノ粒子フィルムに無水プリンを加え、1〜2時間かけてスラリーを80 °Cまで加熱します。これにより、ナノ粒子が完全に溶解します。1 FIO グリセロールを1 mL溶液に加え、80 °Cで2時間撹拌します。溶液を室温まで冷却した後、チオグリセロールを脱プロトン化するためにトリエチルアミンを0.5 mL加え、30分間撹拌します。この溶媒混合物に対する極性ナノ結晶の溶解度が低いため、トリエチルアミンの添加後に溶液が白濁することがあります。量子ドット溶液を、20 mLのヘキサンと20 mLのアセトンの混合液を含む50 mLコニカル遠心チューブに移し、よく混合します。遠心分離によって沈殿したナノ結晶を単離し、続いてアセトンでペレットを洗浄します。量子ドットのペレットを5 mLのDMSOに溶解させ、バスソニケーションを行った後、遠心分離を行います。これにより凝集物を除去し、その後、UV-Vis吸収スペクトルからナノ粒子の濃度を決定します。純粋な量子ドット溶液は、空気中の環境条件下で表面が徐々に酸化するため、3時間以内に使用してください。量子ドット溶液をDMSOで10 µM以下に希釈し、50 mLフラスコに移します。攪拌しながら、調製済みの5 mg/mL DMSO希釈ポリアクリル酸溶液を量子ドット溶液に滴下し、室温で5分間脱気します。量子ドットポリマー溶液をアルゴンでパージし、80 °Cで90分間加熱します。溶液を室温まで冷却した後、pH 8の50 mMホウ酸ナトリウムを同量ずつ滴下し、10分間撹拌します。記載された手順に従って量子ドットを精製し、UV-vis吸収スペクトルから濃度を決定します。撹拌子入りの4 mLガラスバイアル中で、1 molの量子ドットをホウ酸緩衝液中で、750 Daltonのモノアミノポリエチレングリコールを40,000倍モル過剰に加えて混合します。ナノ結晶に特定の化学的機能性を付与する方法については、記述された手順書を参照してください。 freshly prepared 活性剤溶液を、量子ドット溶液に対して 25,000 倍のモル過剰量で迅速に添加し、室温で 30 分間撹拌します。この工程をさらに 4 回繰り返し、ナノ結晶の表面を PEG で飽和させます。最後に、1 MのTris緩衝液を200 µL加えて反応を停止させ、透析遠心フィルターまたは超遠心分離を用いてナノ結晶を精製します。得られたナノ結晶の単分散性、流体力学的サイズ、および表面電荷は、液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および蛍光顕微鏡を用いて分析できます。ここでは、セレン化カドミウムナノ結晶、カチオン交換後の水銀・カドミウム・セレン化物ナノ結晶、およびシェル成長後のコア水銀・カドミウム・セレン化物／シェルカドミウム・硫化亜鉛ナノ結晶の代表的な吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示します。コアセレン化カドミウムナノ結晶の蛍光量子収率は約15%ですが、水銀交換後は、表面原子の乱れによって導入された電荷担体トラップが原因と考えられ、この効率は1%未満まで低下します。硫化カドミウム亜鉛の薄いシェルを成長させることで、この効率は70%以上に向上し、水に転移した後もほぼ維持されます。対照的に、水銀を導入していないカドミウムセレンコア・硫化カドミウム亜鉛シェルナノ結晶は、厚いシェルを成長させない限り、水中で量子収率の大部分を喪失します。硫化カドミウム亜鉛でキャッピングすると、電子電荷担体がシェル材料に漏出するため、スペクトルがレッドシフトすることに注意が必要です。このシフトは、カドミウムコアでは約20から30ナノメートルであり、コア中の水銀含有量が増えるにつれて増大します。したがって、コアナノ結晶に水銀を組み込むことで、輝度を損なうことなくナノ結晶の小サイズを維持することが可能です。この小サイズは、平均粒子径が3.2 ± 0.6ナノメートルであるコア水銀・カドミウム・セレン／シェルカドミウム・亜鉛硫化物ナノ結晶の透過電子顕微鏡写真および粒子径分布によって示されています。水への2段階相転移を用いることは、クラスターや凝集物を取り除くためのさらなるサイズ排除によるサイズ分画を必要としない、均一なナノ結晶集団を得るために極めて重要です。ここに示したサイズ排除クロマトグラムは、サイズがコンアルブミンと同程度であることを裏付けています。75 kilodaltonsで、750 DaltonのアミノPEGで修飾した後、サイズはわずか12 nanometersまで増加し、これはIgG抗体と同程度です。PEG修飾によって表面電荷が中和されることは、ここに示すアガロースゲル電気泳動実験で確認されており、ウェルは矢印で示され、右側に電極の極性が表示されています。これにより、接合前はナノ結晶が電荷を持つ粒子として移動し、PEG化されたナノ結晶は静電的に中性であることがわかります。ここでは、ガラスカバースリップ上に堆積させ、545 nanometerの可視光で励起したこれらのナノ結晶のエピ蛍光顕微鏡写真を示しています。これらのナノ結晶は、電子倍増CCDカメラを用いて、30 frames per secondで単一分子レベルで容易に観察することが可能です。このプロットは、連続励起下において、各フレームで観察される蛍光粒子の数が時間とともに変動することを示しています。これは、ブリンキングと光劣化の両方が組み合わさった結果です。最初の7分間はブリンキングが支配的であり、その後、酸化的な光劣化が徐々に顕在化します。このビデオを視聴することで、量子ドットの化学的合成方法、水性バッファーへの転移方法、およびバイオイメージングへの応用に向けた修飾方法について十分に理解することができるはずです。カドミウムや水銀を含む試薬を取り扱う際は極めて危険であるため、個人の被曝を防ぐために十分な予防策を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Engineering

工学

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複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

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生産と一価量子ドットの標的

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量子ドット標識DNAと全反射蛍光顕微鏡を用いて、非標識タンパク質を用いた制限エンドヌクレアーゼの反応機構を調べることができます。この単一分子技術により、個々のタンパク質-DNA相互作用の大規模な多重化観察が可能になり、データをプールして、十分に蓄積された滞留時間分布を生成できます。...

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HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

本プロトコルは、量子ドットを用いて心臓組織切片中のタンパク質を免疫標識する方法を記載する。この技術は、あらゆるタンパク質の細胞内局在と発現を微細構造レベルで視覚化するための有用なツールを提供します。...

量子ドットを介した免疫標識とそれに続く透過型電子顕微鏡法を用いた心臓におけるタンパク質の細胞内局在の可視化(英語)

ここでは、量子ドットナノビーズ(QDNB)の調製と、QDNBベースのラテラルフローイムノアッセイストリップを使用した疾患バイオマーカーの検出のためのプロトコルについて説明します。試験結果は、UV光照明下で定性的に評価し、蛍光ストリップリーダーを使用して15分以内に定量的に測定できます。...

量子ドットナノビーズに基づく蛍光ラテラルフロー免疫測定法

学ぶ 単一分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドットの調製法。カドミウムセレン化物コアに水銀を合金化し、薄い合金シェルを成長させ、多座ポリマーで水相に移行させることで、高輝度・高安定性・小サイズ・低非特異的結合を実現する。

1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット

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