複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

こんにちは。このビデオでは、単一量子追跡実験の全工程を紹介します。専用のアルゴリズムは、画像解析の専門家であるISISと共同で完全に設計されました。このビデオでは、この手法を説明するためのモデルとして、上皮成長因子受容体を使用します。

上皮成長因子受容体は膜貫通タンパク質です。この受容体は、AおよびBフラグメントのみを保持するように還元されたモノクローナル抗体を用いて標識します。AおよびBフラグメントはビオチン化され、その後、量子ドットのストレプトアビジンに結合させることで、このシステムによりEGF受容体を正確に認識することが可能になります。

私たちの目的は、細胞表面受容体のダイナミクスの包括的な視点を提供することです。実際、分子の軌跡はナノドメイン内に閉じ込められることで、ブラウン拡散から逸脱することがあります。例えば、これはシグナル伝達パートナーや分子スキャホールドなどの基礎となる相互作用の徴候である可能性があります。

我々は、細胞全体にわたってこれらのイベントをマッピングすることで、それらを網羅的に記述することを目指しています。これには、高い標識密度の維持とともに、高いSPECT時間分解能での解析が必要となります。したがって、我々はこの手法をマルチターゲットトレーシング（multi target tracing）と呼んでいます。実験の最初のステップは、サンプルの調製です。

抗生物質を用いない生細胞を用いて作業を行います。ここでは、EGF受容体を内在的に発現しているCos-7細胞を使用します。細胞を剥離させた後、各ウェルに同数の細胞を配置するため、正確に確認する必要があります。

細胞数を正確に調整することは、細胞あたりの量子ドット数の予測可能性を高めるために非常に重要です。細胞をHウェルに分注した後、7% CO2存在下の37 °Cで24時間インキュベートしてください。次のステップは、抗体に結合させた量子ドットの調製です。量子ドットは小型の蛍光ナノ粒子です。

これらの粒子は、従来の蛍光プローブや信号と比較して非常に明るく安定しているため、本研究において非常に有用です。この種の実験では、ノイズ比が極めて重要になります。ここでは、量子ドット周囲のストリップ端を飽和させ、凝集を防ぐために完全培地を使用します。

その後、統計的に単価の量子ドットをより多く得るために、量子ドットを目的のビオチン化タンパク質または抗体と1:1の比率で混合しました。この実験では、研究室でモノクローナル抗体から作製し、ビオチンで標識したEGF受容体に対するFab断片を使用しています。約15分間のインキュベーションの間、1,200 rpmのシェーカーを用い、25 °Cで凝集を抑制し均質性を維持します。

混合液の準備ができたら、細胞に添加します。ラボテック上で細胞が剥離するのを防ぐため、ウェルから培地を非常に緩やかに除去し、実験に必要な量の混合液を添加してください。本例では、1ウェルあたり100 µLの混合液を添加します。

混合物を添加した後、細胞を15分間インキュベートします。この際、37 °C、7% CO2の条件下で行ってください。このインキュベーション後、培地中に多数の頻繁なツインドット（二連点）が懸濁しているのが確認される場合があります。

これらの量子ドットは、イメージングの前に除去する必要があります。ノイズの原因となるためです。そのため、各ウェルを、この場合は5回というように、十分に洗浄して取り除く必要があります。

自己蛍光のないイメージング用培地を使用してください。ここでは、apsを含むHBSS緩衝液を使用します。これで細胞の準備が完了しました。

それでは、データ収集のためのセットアップを確認しましょう。このセットアップは、倒立顕微鏡、眼感度を持つカメラ、強力な水銀ランプ、そして細胞を37°Cに保持するためのインキュベーターの4つの主要部分で構成されています。水銀ランプからの光は、ファイバーとフィルターホイールを通過してサンプルを照射します。

試料の蛍光はフィルタリングされ、左側のE-M-C-C-Dカメラによって収集されます。現在は、開口数1.3および1.49の油浸対物レンズを使用しています。この実験の中心的ステップは、画像取得そのものです。

細胞にピントが合ったら、ラベルが強く導入されている代表的な細胞を観察します。量子ドットを用いる場合、まず透過白色光で単一画像を撮影し、細胞の状態やLA podiaの空間的な限界を確認するために利用します。その後、通常は36 millisecondのレートでビデオを撮影します。これはフルフレームで許容される最速のレートです。

単一分子感度を達成し、少なくとも20 dB以上の十分な信号対雑音比を得るために、電子増倍CCDを使用します。通常は25 dB程度であり、一般的に300フレームを取得します。特定のデータセットを評価するには、ビデオファイルが含まれているディレクトリへのパスを指定するだけで十分です。

次にコマンドを入力すると、MetLab内でテキストが再接続されるか、またはコマンド MTT 23 I によって、使用されるすべてのパラメータをリストしたグラフィックインターフェースが表示され、完全自動解析が開始されます。MTT解析の核心は各フレームに対して行われ、主に3つのタスクを呼び出します。まず、各ピクセルにおいてターゲット量子ドットの有無を検出することです。

次に、各検出において、ピクセル位置や信号強度などのターゲットに関連するパラメータの推定を行います。最後に、各ピクセルの前フレームまでで構築済みのトレースを用いて、新しいターゲットの再接続を行います。

局所的なサブ領域を検討し、ノイズのみが存在するか、あるいは信号が存在するかという2つの仮説を比較します。点広がり関数により、ModuLiteは鋭いピークを持ちます。検出されたターゲット1つにつき1フレームあたり1回未満の誤検出となるよう、十分に低い誤警報率を保証するしきい値を使用します。

次に、検出されたガウス関数から位置、幅、高さを推定するために、最小二乗ガウスフィッティングを行います。これにより、特に色素のサブピクセル位置が得られ、一般的な信号対雑音比において通常10から20ナノメートルの精度が得られます。高密度では、ピーク同士が近すぎることがあり、強いピークが弱いピークの検出を妨げることがあります。これに対処するため、初期画像から検出されたピークをデフレート（減算）します。

同様に、残差による検出では、通常10%のピークに再び歪みが生じます。ほぼ網羅的な検出を実現することは、正確な再接続にとって非常に有益です。その後、新しいターゲットのセットと、この瞳孔における以前のトレースのセットとの照合が行われます。

可能な限り各トレースをターゲットに割り当て、またブリンキングに対処するため、検出ステップで得られたすべての利用可能な統計情報を利用します。したがって、単に最も近いトレースにターゲットを割り当てるわけではありません。トレースが交差する場合、つまりそれぞれの関連する探索領域が重複して競合が発生した場合は、トレースとターゲットの両方について、強度、速度、幅、およびブリンキングの統計値を考慮します。

これにより、統計的に最適な再接続スコアが得られます。この戦略により、可能な限り、最近接粒子への再接続（つまり最も緩やかな運動）へのバイアスを避けることができます。次に、軌跡内における一過性の閉じ込め（transient confinement）の可能性を評価するための関数を使用します。

この関数は、Sexton Simpsonらの研究によって確立されたように、局所拡散と逆相関の関係にあります。閾値を適用することで、閉じ込められたエピソードか否かを定義できます。これを全トレースにわたって繰り返すことで、最終的に一過性の閉じ込めや減速の証拠として膜ダイナミクスをマッピングし、これを表現することが可能です。

あるいは、この閉じ込め指数のバイナリ値または離散値を使用することで、デフォルト設定のMTTがこれらのタスクを自動的に実行し、各ビデオについて、各ピークの行パラメータをeskiファイルに保存して、さらなる詳細な調査に役立てることができます。各細胞上のトレースマップや、関心パラメータ、ピーク強度、SN比、局所的な欠損値などのヒストグラムプロットといった典型的な結果が得られ、この側面は任意の専用調査に容易に適応させることが可能です。このビデオでは、MTTによって得られた典型的な結果についてまとめます。

研究の大部分はアルゴリズムの精緻化に割かれており、運動の制限モードや相互作用などの個別の調査に合わせて調整が必要な場合があります。しかし、MTTの実行自体は非常に簡単です。ユーザーは、空間的および時間的な制限など、少数のパラメータを最適化するだけで済みます。

MTTを精緻化するにあたり、我々は各タスクに使用される解析オプションを全面的に再考することを目的としました。我々は2つの困難な軸に沿ってプロセスを最適化しています。第一に、表面上の最適な空間情報を得るために高密度に対応すること、そして第二に、通常は低消光および高速での動作を可能にする弱いSNRに対処することであり、閉じ込めは潜在的な相互作用の兆候として解釈できます。

膜受容体は、例えば膜下細胞骨格やプロリピッドドメインと相互作用することがあります。このような現象は、空間的および時間的な閉じ込め（confinement）の変化を通じて調査することが可能です。動的な測定値は、FRAPやFCS、あるいはFRETなどの相補的なアプローチと比較することができます。

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