Name: 複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学ぶ 複数のターゲットトレース（MTT）アルゴリズムを用いた細胞膜タンパク質のナノスケール動態解析。EGF受容体をモデルに、高感度イメージングで分子拡散をリアルタイム追跡し、膜ダイナミクスの理解を深める手法です。

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私たちは彼らのサポートと実りある議論のために、我々のチームのメンバーは、技術支援のために特にMC Blacheと同様に、MイルラとB Imhofに感謝します。デフレと閉じ込めの数値は、自然法の礼儀を再現しました。このプロジェクトは、CNRSからの機関の助成金によって、INSERMとマルセイユ大学、地域プロヴァンス=アルプ=コート·d&#39;Azur、研究所国立デュ癌、AFP通信国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR-08-PCVI-から、特定の補助金によってサポートされています0034から02、ANR 2010 BLAN 1214 01）·財団流動ラ·ルシェルシュMédicale（エキップlabéliséeFRM-2009）。 VRはリーグ国立Contre leのがんからのフェローシップでサポートされています。

<ol><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).</li>
<li>Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single+molecule+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging of single molecule diffusion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).</li>
<li>Lommerse, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+the+H-ras+membrane-anchor+reveals+domains+in+the+cytoplasmic+leaflet+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane.</a> Biophys. J. 86, 609-616 (2004).</li>
<li>Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+in+the+plasma+membrane%3A+how+to+combine+fluidity+and+order%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order.</a> EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).</li>
<li>Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+dynamics+of+glycine+receptors+revealed+by+single-quantum+dot+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking.</a> Science. 302, 442-445 (2003).</li>
<li>Harms, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+l-type+Ca%282%2B%29+channels+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells.</a> Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).</li>
<li>Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+imaging+of+green+fluorescent+proteins+in+living+cells%3A+E-cadherin+forms+oligomers+on+the+free+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface.</a> Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).</li>
<li>Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+EGFR+signalling+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells.</a> Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).</li>
<li>Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+lipid+microdomains+in+a+muscle+cell+membrane+visualized+by+single+molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy.</a> Embo. J. 19, 892-901 (2000).</li>
<li>Seisenberger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+imaging+of+the+infection+pathway+of+an+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus.</a> Science. 294, 1929-1932 (2001).</li>
<li>Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+fluid+mosaic+model+of+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Revisiting the fluid mosaic model of membranes.</a> Science. 268, 1441-1442 (1995).</li>
<li>Saffman, P. G., Delbruck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brownian motion in biological membranes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).</li>
<li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li>
<li>Papoulis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPapoulis%2C+A+%22Probability%2C+Random+Variables+and+Stochastic+Process+277%22">Probability, Random Variables and Stochastic Process 277</a>. , McGraw Hill. (2001).</li>
<li>Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).</li>
<li>Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mountains+yield+nanoscale+cell+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mountains yield nanoscale cell images.</a> Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Andrew, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion of monoclonal antibodies.</a> Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).</li>
<li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).</li>
<li>Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+confinement+and+jumps+in+single-molecule+membrane+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E.+Stat.+Nonlin.+Soft.+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories.</a> Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915(2006).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+effects+of+corrals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: effects of corrals.</a> Biophys. J. 69, 389-398 (1995).</li>
<li>Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+activation+and+homer+differentially+control+the+lateral+mobility+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+neuronal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane.</a> J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).</li>
<li>Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+temporary+lateral+confinement+of+membrane+proteins+using+single-particle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis.</a> Biophys. J. 69, 989-993 (1995).</li>
<li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li>
<li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+%28nanovid+microscopy%29.+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li>
<li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li>
<li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging%2C+labelling+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li>
<li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li>
<li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li>
<li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent%2C+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li>
<li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-target+tracing+%28MTT%29+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li>
<li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor%3A+comparison+between+single-molecule%2Fquantum+dot+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li>
<li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions%3A+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

単一粒子追跡では、セルと顕微鏡の側面の横に、分析の作業のかなりの部分を表しています。各フレームの上に、検出し推定し、再接続のピーク：これは、3つの主要なタスクを実行するために使用されるアルゴリズムに対応しています。しかし、この作業の結果としての側面は、最後に、余分な手順（例えば、運動、相互作用や化学量論のモードを解読など）のために本質的には、任意の新しい専用の調査のために適合させる必要があるかもしれませんアルゴリズム自体を起草に格納されています。 しかし、いったんアルゴリズムが完全にそれは我々が最小値（ 図3）で入力パラメータの数を維持するに注意を払って、特に以来、簡単で実行し、開発されています。これは、MTT非常に堅牢かつ簡単に実装できるレンダリングします。 MTTを起草するとき、我々は完全にそれぞれのタスクに使用される分析オプションを再考することを目指した。我々は2つ​​の挑戦的な軸に沿ってプロセスを最適化したい： <ol><li>ウィットを扱うラベリングのh高い密度は、細胞表面のサンプリング期間の詳細な空間情報を提供します。理想的には...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 量 </td></tr><tr><td> COS-7細胞株</td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td><td> 5,000細胞/ウェル</td></tr><tr><td>のCa 2なしHBSS + </td><td> GIBCO </td><td> 14175 </td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td> 0.05％トリプシンEDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td> 8ウェルのLab-TEK </td><td> NUNC </td><td> 155441 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Qdot®標識ストレプトアビジン-605 </td><td>インビトロジェン</td><td> Q10101MP </td><td> 20mMの</td></tr><tr><td colspan="4"> ビオチン化ファブ （ファブ合成のために、リファレンス21を参照） </td></tr><tr><td>モノクローナル抗体108からファブ</td><td> ATCC </td><td> HB-9764 </td><td> 200μgの</td></tr><tr><td> NHS-ビオチン<html></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 21435 </td><td> 18.5μgの</td></tr><tr><td colspan="4"> 完全培地 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 41965 </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td> SIGMA </td><td> F7524 </td><td> 50ミリリットル</td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td> GIBCO </td><td> 25030 </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td> GIBCO </td><td> 11360 </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="4"> イメージングメディア </td></tr><tr><td>のCa 2 + HBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14025 </td><td> 25ミリリットル</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 250μlの</td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> 機器 </td><td> 会社 </td><td> リファレンス </td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>日食TE2000U </td></tr><tr><td>蛍光灯</td><td>ニコン</td><td> Intensilight C-HGFIE </td></tr><tr><td> 1.3 NA 100倍目標</td><td>ニコン</td><td>計画弗素1.30 </td></tr><tr><td> 1.49 NA 100倍対物レンズ</td><td>ニコン</td><td> APO TIRF 1.49 </td></tr><tr><td>カメラ</td><td>ローパーサイエンティフィック</td><td>カスケード512 B </td></tr><tr><td>恒温ボックス</td><td>寿命イメージングサービス</td><td>ボックス</td></tr></tbody></table>付録A：MTT補足分析のスクリプトの例 機能 MTT_example（ファイル名） MTTの出力結果を回復する方法を示します。％％％基本的な例 それぞれのtracをプロットするの％％％eとヒストグラムを構築する 蛍光強度の％％の％ narginは&lt;1％ の場合にfile_nameはありません？ ファイル= DIR（ &#39;* STK。&#39;）; IsEmpty関数（ファイル）、DISP（ &quot;カレントディレクトリにデータがない&#39;）、 復帰、END IF file_nameは=ファイル（1）名、％デフォルト：最初のSTKファイル DISP（[&#39;デフォルトで&#39; file_nameは &#39;を使用して&#39;]） 終わり file_param = [ファイル名 &#39;_tab_param.dat&#39;];％の出力ファイル ％％のデータをロード 使用されているバージョンに応じてCD（ &#39;output23&#39;）％または（ &#39;output22&#39;）、 ％免責事項：バージョン2.2の場合のみ、7つのパラメータを生成する ％余分なパラメータ、ノイズが、バージョン2.3で追加されました。 単一のテーブルには、一度にすべてのパラメータを読み取るには％ ％tab_param = fread_all_param（file_param）; ％TAをb_i = tab_param（2:8：最後に、:); tab_j = ... 別のテーブルにすべてのパラメータを（frame_number除く）をお読みに％ ％[tab_i、tab_j、tab_alpha、tab_radius、tab_offset、tab_blk、tab_noise] = fread_all_data_spt（file_param）; tab_i = fread_data_spt（file_param、3）; 有益な非トレース番号とフレーム番号は、破棄されるため、％のインデックスは3です！ tab_j = fread_data_spt（file_param、4）; tab_alpha = fread_data_spt（file_param、5）; tab_blk = fread_data_spt（file_param、8）; トレース上の％％ループ N_traces =サイズ（tab_i、1）; ％のテーブルN_framesのcolumsによってN_tracesラインです N_traces：ITRC = 1 の場合 唯一の％は非点滅するステップ ; No_blk_index = tab_blk（ITRC、:)&gt; 0 プロット（tab_i（ITRC、No_blk_index）、tab_j（ITRC、No_blk_index）） ＆nbのSPのと題名（ &#39;I（ピクセル）&#39;）、ylabelは（ &#39;J（ピク​​セル）&#39;） タイトル（[&#39;トレース＃&#39; num2strは（ITRC）]） DISP（ &#39;次のトレースのために任意のキーを叩いてください。&#39;）、一時停止 終わり ％％のみたFluoヒストグラム N_datapoints = SUM（tab_blk（:)&gt; 0）;％以外の点滅する手順のみ 2sqrt（N）のビンを使用して HIST（tab_alpha（tab_blk&gt; 0）、2 * SQRT（N_datapoints））％ と題名（ &#39;強度（AU）&#39;）、ylabelは（ &#39;発生&#39;） タイトル（ &#39;粒子の蛍光強度のヒストグラム &quot;）

複数のターゲットトレース（mtt）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

私たちの目標は、異なる生物学的機能における細胞膜で起こる分子プロセスの包括的な説明を得ることである。 複数のターゲットトレース （MTT）1：我々は、高濃度で単粒子追跡 （SPT）に専用の分析ツールを開発することによって、単一分子レベルでの複雑な組織や細胞膜のダイナミクスを特徴付けるを目指しています。ミリ秒とナノ分解能1-11を提供する単一分子ビデオ顕微鏡は、正確にそのような細胞受容体の局在化、モビリティ、監禁や相互作用などの記述子をマッピングすることにより、膜組織12月14日の詳細に表現することができます。 我々は両方の実験とアルゴリズム、SPTを再訪。実験的な側面は、分子動力学の動的スナップショットを提供するために、可能な限り最高の標識密度に到達する上で特に重点を置いて、最適セットアップおよび細胞標識が含まれていのそれは膜内に発生します。ピーク検出、推定と再接続、画像解析15,16から、特定のツールによって対処：アルゴリズムの問題は、軌道を再構築するために使用される各ステップを懸念。検出後にデフレを実装するには、救出のピークは最初に隣接する、強力なピークによって隠さことができます。注目すべきは、検出を改善することを直接軌道内のギャップを減らすことによって、再接続に影響を与えます。性能は一般的に高い時空間分解能での並列測定のための2つの大きな制約を表すさまざまなラベリング密度とノイズ値に対してモンテカルロシミュレーションを用いて評価されています。 photoswitchingまたは非線形光学オン/オフどちらの連続を使用して、単一分子で得られたナノメートル精度17は 、徹底的な観測を提供することができます。これは、STORM 18、PALM 19,20、RESOLFT 21またはSTED 22,23、WHIとしてnanoscopy方法17の基礎であるchは、しばしばイメージング、固定のサンプルが必要な場合があります。中央のタスクは、単一分子から発せられる回折限界のピークの検出および推定である。したがって、そのような一定の位置精度の代わりにブラウン運動を扱うように十分な前提を提供し、MTTは、素直にナノスケールの分析に適しています。また、MTTは、基本的にどのような規模で使用することができます。分子のだけでなく、細胞や動物のために、例えば。したがって、MTTは、分子や細胞スケールでアプリケーションを見つける強力な追跡アルゴリズムである。

複数のターゲットトレースは、生きた細胞の細胞膜内で個別に標識分子を追跡するために開発した自家製のアルゴリズムである。効率的に検出するナノ膜のダイナミクスを調べるためにユーザーフレンドリーな、包括的なツールを提供し、高密度で時間をかけて分子を推定し、トレースします。

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

私たちの目標は、さまざまな生物学的機能における細胞膜で起こる分子プロセスの包括的な記述を得ることにあります。私たちは、高密度での単粒子追跡（Single-Particle Tracking: SPT）に特化した解析ツールであるMultiple-Target Tracing（MTT）を開発することにより、単一分子レベルで細胞膜の複雑な構成とダイナミクスを特性評価することを目指しています。ミリ秒およびナノメートル分解能を備えた単一分子ビデオ顕微鏡法は、細胞受容体の局在、可動性、閉じ込め、あるいは相互作用などの記述子を正確にマッピングすることで、膜組織の詳細な表現を可能にします。私たちは、実験的およびアルゴリズム的な両面からSPTを再検討しました。実験的側面では、膜内で起こる分子ダイナミクスの動的なスナップショットを提供するため、可能な限り高い標識密度を達成することに特に重点を置き、セットアップと細胞標識の最適化を行いました。アルゴリズム的な課題は、軌跡の再構築に使用される各ステップ（ピーク検出、推定、および再接続）に関わるものであり、これらは画像解析の特定のツールを用いて対処しました。検出後にデフレーション（deflation）を実装することで、近接するより強いピークに隠れていたピークを救出することが可能になります。特筆すべきは、検出精度の向上が軌跡内のギャップを減少させ、再接続に直接的に影響を与える点です。性能評価は、高時空間分解能での並行測定における2つの主要な制限要因となることが多い、さまざまな標識密度およびノイズ値を用いたモンテカルロシミュレーションによって行われました。連続的なオン/オフ光スイッチングまたは非線形光学を用いて単一分子に対して得られるナノメートル精度の正確性は、網羅的な観察を可能にします。これが、STORM、PALM、RESOLFT、あるいはSTEDなどのナノスコピー法の基礎となっており、これらの手法では固定標本のイメージングが必要となることが多いです。中心となるタスクは、単一分子から放出される回折限界のピークを検出および推定することです。したがって、ブラウン運動ではなく一定の位置精度を扱うなどの適切な仮定を設ければ、MTTはナノスコピックな解析に直接的に適応させることができます。さらに、MTTは根本的にあらゆるスケールで使用でき、分子だけでなく、例えば細胞や動物にも適用可能です。ゆえに、MTTは分子スケールおよび細胞スケールで応用可能な強力な追跡アルゴリズムです。

こんにちは。このビデオでは、単一量子追跡実験の全工程を紹介します。専用のアルゴリズムは、画像解析の専門家であるISISと共同で完全に設計されました。このビデオでは、この手法を説明するためのモデルとして、上皮成長因子受容体を使用します。上皮成長因子受容体は膜貫通タンパク質です。この受容体は、AおよびBフラグメントのみを保持するように還元されたモノクローナル抗体を用いて標識します。AおよびBフラグメントはビオチン化され、その後、量子ドットのストレプトアビジンに結合させることで、このシステムによりEGF受容体を正確に認識することが可能になります。私たちの目的は、細胞表面受容体のダイナミクスの包括的な視点を提供することです。実際、分子の軌跡はナノドメイン内に閉じ込められることで、ブラウン拡散から逸脱することがあります。例えば、これはシグナル伝達パートナーや分子スキャホールドなどの基礎となる相互作用の徴候である可能性があります。我々は、細胞全体にわたってこれらのイベントをマッピングすることで、それらを網羅的に記述することを目指しています。これには、高い標識密度の維持とともに、高いSPECT時間分解能での解析が必要となります。したがって、我々はこの手法をマルチターゲットトレーシング（multi target tracing）と呼んでいます。実験の最初のステップは、サンプルの調製です。抗生物質を用いない生細胞を用いて作業を行います。ここでは、EGF受容体を内在的に発現しているCos-7細胞を使用します。細胞を剥離させた後、各ウェルに同数の細胞を配置するため、正確に確認する必要があります。細胞数を正確に調整することは、細胞あたりの量子ドット数の予測可能性を高めるために非常に重要です。細胞をHウェルに分注した後、7% CO2存在下の37 °Cで24時間インキュベートしてください。次のステップは、抗体に結合させた量子ドットの調製です。量子ドットは小型の蛍光ナノ粒子です。これらの粒子は、従来の蛍光プローブや信号と比較して非常に明るく安定しているため、本研究において非常に有用です。この種の実験では、ノイズ比が極めて重要になります。ここでは、量子ドット周囲のストリップ端を飽和させ、凝集を防ぐために完全培地を使用します。その後、統計的に単価の量子ドットをより多く得るために、量子ドットを目的のビオチン化タンパク質または抗体と1:1の比率で混合しました。この実験では、研究室でモノクローナル抗体から作製し、ビオチンで標識したEGF受容体に対するFab断片を使用しています。約15分間のインキュベーションの間、1,200 rpmのシェーカーを用い、25 °Cで凝集を抑制し均質性を維持します。混合液の準備ができたら、細胞に添加します。ラボテック上で細胞が剥離するのを防ぐため、ウェルから培地を非常に

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生物学

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