複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング
May 27th, 2012
複数のターゲットトレースは、生きた細胞の細胞膜内で個別に標識分子を追跡するために開発した自家製のアルゴリズムである。効率的に検出するナノ膜のダイナミクスを調べるためにユーザーフレンドリーな、包括的なツールを提供し、高密度で時間をかけて分子を推定し、トレースします。
このビデオ Hi.In、完全な単一量子追跡実験を紹介します。専用のアルゴリズムは、ISISのイメージ専門家とのコラボレーションによって完全に考案されました。このビデオでは、上皮成長因子受容体をモデルとして、この手法の方法を説明します。
上皮成長因子受容体は膜貫通タンパク質です。この受容体は、モノクローナル抗体を使用してタグ付けされ、モノクローナル抗体はA a Bフラグメントのみを保持するように減少します。A a Bフラグメントはビオチン化され、その後、量子ドットのストレプトアビジンに結合して、壁システムはEGF受容体を正確に認識します。
私たちの目標は、細胞表面受容体のダイナミクスを包括的に把握することです。実際、分子の軌跡は、ナノドメイン内に閉じ込められることにより、ブロト拡散から逸脱する可能性があります。例えば、これは、例えば、シグナル伝達パートナーまたは分子スキャフォールドとの基礎となる相互作用のシグネチャーであり得る。
このようなイベントをセル上にマッピングすることで網羅的に記述することを目指していますが、これには高いSPECT時間分解能と高いラベリング密度での作業が必要です。したがって、このアプローチをマルチターゲットトレースと名付けます。実験の最初のステップは、サンプルの調製です。
私たちは抗生物質を使用せずに生きた細胞に取り組んでいます。ここでは、EGF受容体を内因的に発現するコスト7の細胞を使用します。細胞を切り離した後、研究室のhウェルに同じ数の細胞が存在するためには、正確に確認する必要があります。
細胞の正確な数は、細胞あたりの量子ドットの数の予測可能性を高めるために非常に重要です Hで細胞を分注した後、7%のCO2で37度で24時間ラボをインキュベートする必要があります。次のステップは、抗体に結合した量子ドットの調製です。量子ドットは、小さな蛍光ナノ粒子です。
これらの粒子は、従来の蛍光プローブやシグナルと比較して非常に明るく安定しているため、ここで非常に大きな関心を集めています。このタイプの実験では、鼻の比率が非常に重要です。この場合、完全な媒体を使用して、量子ドットの周りのストリップideを飽和させ、凝集を防ぎます。
その後、統計的に一価の量子ドットを持つために、目的のbioTE高揚タンパク質または抗体の量子ドットを1対1の比率で持っていました。この実験では、モノクローナル抗体から実験室で作製され、ビオチンを標的とするEGF受容体に対するa-bフラグメントを使用します。約15分間のインキュベーション中に、1分あたり1,200回転と2つの5度でシェーカーを使用して、凝集と均質性の下で制御を維持できます。
ミックスの準備ができたら、細胞に追加できます。ラボテックで細胞の剥離を防ぐために培地をウェルから非常に穏やかに取り出し、実験に必要な量の混合物を追加します。この場合、ウェルごとに100マイクロリットルの混合物を追加します。
ミックスを添加した後、細胞を15分間インキュベートできます。この場合、37度でCO2の7%です。このインキュベーションの後、培地上に頻繁に浮遊するツインドットが大量に見つかる場合があります。
この量子ドットは、イメージングする前に除去する必要があります。私たちがもたらす騒音のためです。だからこそ、私たちはそれぞれを、この場合は数回、よく5回洗う必要があるのです。
非自家蛍光性のイメージング媒体を使用してください。ここでは、apsでHBSSバッファを使用します。これで、セルの準備が整いました。
いよいよ取得のためのセットアップに進みます。セットアップは、倒立顕微鏡、眼感度カメラ、強力な水銀ランプ、細胞を37度に保つためのインキュベーターの4つの主要な部分で構成されています。水銀ランプからの光は、サンプルを照らす前にファイバーとフィルターホイールを通過します。
サンプルのインフルエンザeSenseは、左側のE-M-C-C-Dカメラでろ過および収集されます。現在、1.3および1.49の開口数式オイルマーチャントオブエルドを使用しています。この実験の中心的なステップは、それ自体で取得することです。
細胞に焦点が合ったら、強い標識を持つ代表的な細胞を見ます。量子ドットでは、まず透過白色光で1枚の画像を取得し、さらにLA足の細胞様相や特殊限界を確認するために利用することができます。次に、通常、フルフレームで許容される最速の速度である 36 ミリ秒の速度でビデオを取得します。
電子増倍CCDを使用して、少なくとも20デシベルを超える十分な信号対北比で単一分子の感度に到達します。通常、約25デシベルですが、通常は300フレームを取得します。特定のデータセットを評価するには、ビデオ ファイルを含むディレクトリへのパスを提供するだけで済みます。
その後、コマンドを入力すると、テキストはMetLabまたはコマンドMTT 23 Iに再接続され、最初にグラフィックインターフェイスのリストが表示されます。使用されるすべてのパラメータにより、完全に自動化された解析が開始されます。コアMTT解析は各フレームで実行され、3つの主要なタスク(最初に各ピクセルでターゲット量子負債の有無を検出する)を呼び出します。
次に、ターゲットの検出ごとに、ピクセル位置、信号強度などの関連パラメーターを推定します。新しいターゲットの最後の再接続。トレースは、すべてのピクセルの前のフレームにすでに構築されています。
局所的な小領域を考慮して、ノイズのみまたは信号の2つの仮説の存在を比較します。点拡散機能により、ModuLiteにはヒンピークがあります。しきい値を使用して、検出されたターゲットごとにフレームあたり 1 回未満のパーラス検出で誤警報を十分に低く
抑えます。次に、最小二乗ゴースト栄養素フィートを実行して、検出されたGoshenの位置、幅、高さを推定します。これにより、色素のSPIC細胞位置が特に得られ、高密度ピークでの典型的なS/N比に対しては通常約10〜20ナノメートルの精度が得られますが、多くの場合、閉じすぎている可能性があり、強いピークは最も弱いピークがそれを処理するのを妨げる可能性があります。最初の画像の実行から検出されたピークを収縮させます。
この場合も、残差の検出は通常、ピークの10%を歪める可能性があります。ほぼ網羅的な検出に到達することは、正確な再接続にとって非常に有益です。次に、新しいターゲットのセットが、この瞳孔の以前のトレースのセットと照合されます。
可能であれば各トレースをターゲットに割り当て、起こりうる点滅を処理するために、検出ステップから取得した利用可能なすべての統計情報を使用します。したがって、ターゲットは最も近いトレースだけに割り当てられるわけではありません。競合する場合、トレースが交差する可能性がある場合、つまり、それぞれの関連する研究領域が重複する場合、トレースとターゲットの両方について、強度、速度、幅、および点滅の統計値を考慮します。
これにより、統計的に最適な再接続スコアが得られます。この戦略では、可能な限り回避し、再接続を最も近い隣人、つまり最も遅い動きに偏らせることができます。次に、関数を使用して、軌跡内での一時的な閉じ込めの可能性を評価します。
この機能は、セクストン・シンプソンらによって確立された局所拡散に反比例します。しきい値を適用すると、限定されたエピソードまたはそうでないエピソードを定義できます。この全体的なトレースを繰り返すことで、最終的に膜のダイナミクスを一過性の閉じ込め、スローダウンの証拠の観点からマッピングすることができ、これを表現することができます。
あるいは、この制限インデックスのバイナリ値または離散値を使用して、デフォルトでは、MTTはこれらのタスクを自動的に実行し、各ビデオ、eskiファイルの各ピークの行パラメータを保存し、さらに高度な調査のために保存します。各セルのトレースのマップや、関心のあるパラメータ、ピーク強度、シグナル対ノイズ比、局所的な不足値のヒストグラムのプロットなどの典型的な結果が得られるため、この側面は、専用の調査にも簡単に適応できます。このビデオでは、MTT によって取得される一般的な結果をまとめます。
作業の大部分はアルゴリズムの精緻化にあり、苦痛の運動モードや相互作用などの専用の調査に適合させる必要があるかもしれません。しかし、MTT の実行は非常に簡単です。ユーザーは、スペースや時間の制限など、いくつかのパラメーターのみを最適化する必要があります。
MTTを精緻化するにあたり、各タスクで使用される分析オプションを全面的に再考することを目指しました。私たちは、2つの困難な軸に沿ってプロセスを最適化します。第一に、表面表面上で最良の特殊情報を得るために高密度を扱うこと、第二に、通常、低脱離と高速閉じ込めでの作業を可能にする弱いSNRを処理することは、基礎となる相互作用のシグネチャとして解釈できます。
膜受容体は、例えば、膜下の細胞骨格やプロ脂質ドメインと相互作用することがあります。このような事象は、空間と時間の閉じ込められた変化を通じて調査することができます。動的測定は、FRA、FC、または貨物などの補完的なアプローチと比較できます。
オープンソースコードは学術研究に利用できます。これは、ダウンロード用のリンクを提供する私たちのチームページにS frがある場合、CMLドットユニブの私たちのウェブページからダウンロードすることができます。興味のある産業も私達に連絡することを歓迎します。
特に、私たちのチームと共通の施設のメンバーには、サポートと実りある議論をしてくれたことに感謝したいと思います。このプロジェクトは、c MAA University Pac Region National de LaのCNRSからの資金提供によって支えられており、Foundation Medicalはリーグコントローラーによってサポートされています。ご覧いただきありがとうございます。
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概要
この記事では、生細胞のプラズマ膜内で個別にラベル付けされた分子を追跡するための新しいアルゴリズムを紹介します。この方法は表皮成長因子受容体をモデルとして、ナノスケールの膜ダイナミクスを調査するための包括的なツールを提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- イメージング技術
背景
- 表皮成長因子受容体は膜貫通タンパク質です。
- 分子のダイナミクスを追跡することは細胞プロセスを理解する上で重要です。
- 高密度の分子の検出と追跡は実験の正確性を向上させます。
- 画像解析の専門家との協力によりアルゴリズムの開発が改善されます。
研究目的
- 分子を追跡するためのユーザーフレンドリーなアルゴリズムを開発すること。
- 膜タンパク質のナノスケールダイナミクスを調査すること。
- 表皮成長因子受容体をこの技術のモデルとして利用すること。
使用した方法
- 専用の追跡アルゴリズムの開発。
- 表皮成長因子受容体へのモノクローナル抗体によるタグ付け。
- 量子ドット連結のための抗体フラグメントのビオチン化。
- データ収集のための先進的なイメージング技術の利用。
主要な結果
- アルゴリズムはラベル付けされた分子をリアルタイムで成功裏に追跡します。
- 高密度の検出により膜ダイナミクスの詳細な分析が可能になります。
- この方法は膜貫通タンパク質の挙動に関する洞察を提供します。
- 専門家との協力により結果の堅牢性が向上します。
結論
- 開発されたアルゴリズムは膜タンパク質の追跡に効果的です。
- この技術は細胞ダイナミクスの理解を進めることができます。
- 将来の応用には様々な膜貫通タンパク質が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Mapping molecular diffusion in the plasma membrane enables precise characterization of receptor dynamics, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. By providing high-density, single-molecule tracking data, Multiple-Target Tracing (MTT) enhances predictive confidence in understanding protein interactions and confinement events critical for signaling pathway analysis. This approach addresses a key discovery-stage challenge: obtaining quantitative, spatially resolved insights into membrane organization that inform lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping receptor localization, mobility, and confinement patterns at nanometer scale.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of receptor interactions with signaling partners or scaffolds.
- Predictive Value: Generates quantitative descriptors such as diffusion coefficients and confinement indices to assess target behavior under physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline receptor dynamics in live cells.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through high-density detection and algorithmic trace reconnection.
- Scalability: Facilitates platform reuse across membrane protein targets due to MTT’s applicability at any scale, from molecules to cells.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase membrane dynamics to preclinical validation by enabling comparison of receptor behavior across model systems.
- Mechanistic De-risking: Identifies confinement variations that may reflect underlying interactions with cytoskeleton or lipid domains, reducing ambiguity in target mechanism.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides dynamic measures that complement complementary approaches like FRAP or FCS for informed go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
MTT fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a reusable capability for studying membrane protein dynamics across multiple projects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying receptor confinement, slowdown, and interaction signatures in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through high spatiotemporal resolution and quantitative outputs like peak intensity and signal-to-noise ratio.
- Analytics: Provides statistical outputs including local diffusion values and confinement indices that enable cross-condition comparison and trajectory classification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing dynamic measures to be compared with orthogonal techniques for target validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a standardized tracking algorithm applicable to diverse transmembrane proteins, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct nanoscale observation of receptor dynamics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated peak detection, estimation, and reconnection with deflation to handle high-density labeling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by supplying quantitative, replication-ready data that reduce late-stage biological risk in target advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by delivering dynamic membrane phenotype data that inform target selection and resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule videomicroscopy and image analysis for optimal setup and parameter tuning.
- Depends on instrumentation capable of high-speed, low-noise acquisition, including EM-CCD cameras and mercury lamp illumination.
- Necessitates cross-team standardization of labeling protocols, quantum dot conjugation, and imaging conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying MTT to different model systems or membrane protein targets beyond EGFR.
- Includes practical limitations such as the need for high labeling density and manageable signal-to-noise ratios to ensure accurate peak detection and trace reconnection.
