量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

この手法の全体的な目的は、蛍光免疫細胞化学情報と透過電子顕微鏡による超微形態学的構造を単一の画像に統合することで、相関光電子顕微鏡法（CLEM）データを得ることにあります。この手法は、目的の特定のタンパク質がどの細胞内構造に関連しているかなど、免疫細胞化学および病理学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、同一の量子ドットナノ粒子プローブを用いることで、標的タンパク質からの生体顕微鏡信号の取得と、電子顕微鏡による構造的な局在の特定の両方を実現できる点にあります。

本文のプロトコルに従ってヒトソマトスタチノーマ腫瘍組織の固定、包埋、および切片作成を行った後、2.0 mLのアセトンを入れた5 mLボトルに20 cmの透明粘着テープを入れて、切片接着溶液を調製し、10分間放置します。テープを取り出し、ニッケルグリッドを溶液に浸した後、グリッドを取り出して自然乾燥させます。乾燥後、グリッドの鈍い面を使用して、超薄切片をピックアップします。

選択した樹脂処方に対して適切なエッチング時間を設定することが極めて重要です。本処方では30分で良好な結果が得られますが、より硬い、あるいは柔らかい処方の場合は再計算が必要になる可能性があります。蒸留水を用いて、新鮮な飽和過メタ periodate ナトリウムエッチング溶液を1 mL調製し、洗浄したラボフィルム表面に溶液を滴下します。

切片を載せた完全に乾燥したグリッドを液滴の上に置き、室温で30分間インキュベートします。その後、グリッドを蒸留水の液滴に60秒間移して洗浄します。清潔なラボフィルム表面で抗体および量子ドット（QD）のラベル化を行うには、0.05 molar グリシンとPBSをピペットで滴下します。

グリッドを液滴の上に置き、10分間インキュベートして、切片上の残留アルデヒドをブロッキングします。アルデヒドブロックを除去するため、グリッドの端を軽くブロットします。その後、1%正常ヤギ血清（NGS）および1% BSACを含むPBSの液滴の上にグリッドを置き、10分間静置します。

PBS 890 µLにNGS 10 µLとBSAC 100 µLを加えて、ブロッキング液を1 mL調製します。次に、切片を抗体希釈液の液滴上に10分間置いてコンディショニングを行います。続いて、抗体希釈液を用いて抗ソマトスタチンポリクローナル抗体を1:10に希釈し、グリッドをその溶液の液滴上に置きます。

湿室にて室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、グリッドの端をブロッティングして抗体試薬を除去します。次に、抗体希釈液を用いて切片を5分間ずつ2回洗浄します。

二次抗体を10倍に希釈して滴下し、グリッドをその液滴上に室温で1時間インキュベートします。その後、抗体溶液を除去し、切片を2回洗浄します。ストレプトアビジン標識QDsを10倍に希釈し、サンプルをその溶液の滴上に室温・暗所で1時間インキュベートします。

次に、抗体希釈液を用いてグリッドを2回、それぞれ5分間洗浄し、グリッドの縁をブロッティングします。続いて、蒸留水でグリッドを2分間洗浄し、縁をブロッティングして乾燥させます。免疫染色したグリッドセクションをガラススライド上の水滴に置き、ガラスカバーのスリップで覆います。

蛍光光顕微鏡観察を行うには、以下の特性を持つフィルターキューブを挿入し、365ナノメートルのLED照明を使用します。免疫染色した切片を免疫蛍光顕微鏡のステージに設置します。光顕微鏡を用いて、ラベル化パターンと非特異的ラベル化の程度を評価し、陰性コントロールに染まりがないことを確認します。

次に、グリッドバーに基づいてROIを特定します。続いて、フルカラーデジタルカメラをFLオートカラーに設定し、ホワイトバランスを3,200 Kに設定します。画像の外観を最適化するため、カメラを自動露出モードに設定し、ガンマ設定を0.45から1.00の間に、アナログゲインを1xに設定します。ZEN Two Lightソフトウェアのグラフィカルインターフェースにあるカメラアイコンをクリックしてライブ表示にします。その後、画像にピントを合わせ、ZEN Two LightソフトウェアのグラフィカルインターフェースでSnapをクリックして、画像をフレームストアにキャプチャします。

圧縮やピクセレーションを避けるため、画像はtifファイルとして保存してください。グリッドバーまたはその他の重要な組織の指標に対するROIの位置を示すプリントを作成します。その後、スライドからグリッドを取り除き、蒸留水で洗浄し、端を優しく吸い取って乾燥させます。

透過電子顕微鏡観察を行うには、グリッドを顕微鏡に移し、加速電圧100 kilovoltsで観察します。まず、約1,400倍の低倍率でグリッド内を走査し、光学顕微鏡で確認した関心領域（ROI）を特定します。その後、70,000倍以上の倍率で個々のQDを観察します。

これらは、中程度の電子密度を持つ不規則な結晶構造として観察されます。次に、イメージングソフトウェアのグラフィカルインターフェースにある、1,392×1,040ピクセルのモノクロセンサーを備えたデジタルカメラを使用し、カメラアイコンをクリックしてオンにし、画像をキャプチャします。カメラアイコンをオフの位置に移動して、画像をフレームストアに保存します。

CLEMイメージングを行うには、光学顕微鏡イメージングのプリントを使用し、TEMで対応するROIを特定します。切片内でのナビゲーションには、組織構造の特徴が有用です。TEMを用いて、対応するROIの画像をキャプチャしてください。

次に、CLEM画像を作成するために、TEM画像の向きが正しく、かつ光学顕微鏡画像と同じサイズと解像度（本例では300 pixels per inch）に拡大されていることを確認します。光学顕微鏡画像のキャンバスサイズを2倍に拡張します。その後、蛍光画像の隣にTEM画像をコピーして貼り付けます。

Photoshop CS2で蛍光オーバーレイを作成するには、長方形選択ツールをクリックして蛍光画像を選択し、その複製レイヤーを作成します。レイヤー形式の描画モードの不透明度を30〜40%に調整します。次に、移動ツールをクリックして、蛍光オーバーレイレイヤーを対応するTEM画像の上にドラッグし、画像を合わせます。

画像を位置合わせした後、画像をフラット化して最終的なオーバーレイを作成します。次に、長方形選択ツールを使用して新しいオーバーレイ画像を選択し、新しいキャンバスにコピーします。最後に、画像をtifファイルとして保存します。

この蛍光顕微鏡画像では、個々のソマトスタチノーマ腫瘍細胞に豊富な分泌顆粒が含まれており、ソマトスタチンホルモンに対して陽性的に標識されています。核は暗い穴のように見え、低倍率では細胞質に強度の異なる顆粒状のオレンジ色QD蛍光が観察されました。光学顕微鏡で選択したROIは、ここに示す20倍の光学顕微鏡画像を参照することで認識され、TEMを用いて撮像されました。

高倍率では、細胞の細胞質顆粒に明るい蛍光と強力なQDラベルが認められます。この例のように、蛍光データをTEM画像に重ね合わせることで、強力な陽性ラベルが小胞限定膜内の適度な電子密度の物質を含む顆粒に対応していることが示唆されます。最後に、ここで高倍率で示されているように、適度な電子密度の顆粒に強力なQDナノ結晶免疫ラベルが認められました。

この手法を習得すれば、適切に実施することで8時間で完了させることができます。手順を行う際は、グリッドの端のみを持つようにし、慎重に取り扱うことが重要です。グリッドを拾い上げる際に切片に触れると、切片がグリッドから剥離する可能性があります。

本手順に続き、目的のタンパク質が他のタンパク質と共局在しているかなど、追加の疑問を解消するために、マルチプレックス免疫標識などの他の手法を行うことができます。本手法の開発により、病理学分野の研究者が、電子顕微鏡用に処理されたアーカイブヒト組織におけるタンパク質の局在を探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、蛍光光学的顕微鏡による免疫細胞化学的情報と、透過電子顕微鏡による超微形態構造をどのように組み合わせるかについて、十分に理解できるはずです。

四酸化オスミウムの取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施にあたっては、保護具の着用、ドラフトチャンバー内での作業、および適切な廃棄物処理などの予防措置を講じてください。