蛍光生涯イメージングを用いたエージングC.エレガンスにおけるアミロイド構造の特徴
2020年3月27日
蛍光寿命イメージングは、生きている、老化、およびストレスを受けたC.エレガンス病モデルにおけるタンパク質の凝集傾向を監視し、定量化し、区別する。
この方法により、統合アミロイドタンパク質構造と、可溶性および蓄積されたタンパク質構造を明確に区別することができます。この技術は、毒性の副作用がほとんどまたはまったくない非侵襲的な方法で生体内で行われる。蛍光植物自体の蛍光特性に依存するので、時間の経過とともに非常に堅牢で再現性が高い。
FLIMは癌診断の分野で利用されている。しかし、神経変性疾患に関するタンパク質凝集の基本的なメカニズムを研究するために採用しています。この方法論は、タンパク質凝集の分野で使用することができる。
疾患関連タンパク質が蛍光プローブでタグ付けされている限り、それは時間の経過とともに追跡および監視することができる。凝集を促進または防止する化合物および戦略を、正常に研究することができます。光顕微鏡で可視化できる任意の生物学的システムは、例えば細胞培養、固定または透過サンプルおよび必要な任意の媒体において、in vivoまたはex vivoのいずれかに適しています。
実験データを取得する前に線虫の中で選択した蛍光素の特性をテストし、測定を取得する前にセットアップが完全に機能することをテストしてください。まず、NGMプレート上で20°Cで線虫を成長させ、維持します。若い成人として人生の4日目まで線虫を老化させ、老人として人生の8日目を過ごします。
イメージングの日に、イメージングスライドを準備します。アガロースと二重蒸留水を3%重量の濃度で置きます。電子レンジに入れて溶かし、少し冷まします。
1ミリリットルのピペットチップの先端を切り、溶かしたアガロースの約200マイクロリットルを取ります。きれいなガラススライドにアガロースをピペットし、すぐに任意の気泡の形成を避けるために上に第二のものを置きます。スライドを乾燥させ、上のガラススライドをそっと取り除きます。
結果は線虫が配置される均一のアガロース表面を有するガラススライドである。イメージングのセットアップが準備ができたら、ステレオ顕微鏡の下で働き、10マイクロリットルの麻酔化合物をアガロースパッドに置き、5~10個の線虫をそっと移します。まつげの先端を使用して線虫を分離します。
それらを近くに保ちますが、画像取得中に線虫のローカライズを容易にするために触れないようにしてください。慎重にカバースリップで線虫をオーバーレイします。取り付け後1時間以内に、測定を行います。
線虫が完全に不動であることを確認してください。FLIM 取得ソフトウェアを開きます。タブボタンを見つけて、出力を有効にします。
ステージ上に取り付けられたC.elegansとスライドを配置し、伝送モードで10倍レンズを使用して、スライド上の線虫の位置を局所化します。スライドを取り外し、目的を63倍レンズに切り替え、必要な浸漬媒体を適用します。スライドをステージ上に置き、線虫を局地に入れる。
サンプルのスキャンを開始します。対象の領域を選択し、最大投影面に焦点を当てます。FLIM ソフトウェアのインターフェイスで、検出されたフォトンの数をプレビューします。
ADC 値は、10 ~ 4 番目の 10 から 5 番目の 10 倍の間にする必要があります。必要に応じて、別の平面に焦点を合わせるか、レーザーパワーを増やして、より多くの光子を収集します。フォトンの積み重ねを避けるが、適切な寿命フィットと測定を作成するために十分な量の光子を収集することを確認してください。
メニューバーで、取得パラメータを設定するタブを選択します。スキャン同期を選択して、単一のフォトン検出を許可します。取得を固定時間またはフォトン数に設定します。
取得を開始するには、[開始]を押します。ソフトウェアを開き、ファイルを介してFLIMデータファイルをインポートし、FLIMデータをロードします。異なるセッションで、異なる生物学的反復から得られた場合でも、1つの条件からすべてのサンプルをロードします。
必要に応じて、セグメントは、セグメンテーション、セグメンテーションマネージャを介して多くのFLIM画像のための線虫を信号する。トリミング ツールを目的の領域の周囲にドラッグして、ハイライト表示します。完了したら、[OK] をクリックします。C.elegans の強度ベースのイメージが表示される小さな領域を選択します。
その領域の減衰曲線は、インタフェースの右側にある大きな減衰ウィンドウに表示されます。有効期間を推定するには、[データ] タブで、40 ~ 300 の任意の統合最小値を設定して、薄暗すぎて適切なピクセルを除外します。FLIM 信号をこれらの値に制限するには、時間の最小値と時間の最大値を選択します。
1 のプリセットカウントフォトンは変更しないでください。取得時に使用したレーザーのメガヘルツで繰り返し率を入力します。ゲートの最大値を入力して、すべての飽和ピクセルを除外します。
[有効期間] タブで、使用するグローバル 継手を選択します。選択した蛍光減衰が多重指数であり、1 回の寿命を超える場合は、指数選択の数を除き、他のパラメーターを変更しないでください。IRF メニューから IRF をアップロードします。
IRF シフトを見積もるためには、IRF を選択し、IRF シフトを見積もります。値のセットが自動的に IRF タブに表示されます。これが確立されたら、このタブの他のパラメータは変更しないでください。
すべてのパラメーターを設定したら、fit データ・セットを押します。青い線でハイライト表示されたフィット感は、すべてのイベントと重なっている必要があります。すべてのイベントが適合に沿って揃えられると、適切な適合が得られます。
ソフトウェアのインターフェースの右上のメニューにあるパラメータタブをクリックし、統計値、加重平均を選択し、カイ二乗値が可能な限り近い値であることを確認します。このように選択された画像の寿命値はタウ1として明らかにされる。ファイル、エクスポート強度画像、フィット結果表、画像、ヒストグラムを介して関心のある情報をエクスポートします。
4日目または8日目の筋肉質Q40 RFPを表現するC.elegansの代表的な地図をここに示しています。IQ85のQストレッチが長いほど凝集しやすく、4日目のヒストグラムに蛍光寿命シフトが既に示された。実際、4日目には、IQ44にまだ存在しない間にIQ85の病巣形成が観察された。
しかし、老化の際、IQ44は病巣形成を示し、したがって蛍光寿命を減少させた。最後に、NQ40CFP株における蛍光寿命の低下も検出されなかった。この株については、老化時の平均蛍光寿命にわずかな有意な変化しかありませんでした。
線虫モデルが確立されると、収集される光子の量は、良好な寿命フィットを得るために最も重要です。この方法は、さらに、フォスター共鳴エネルギー伝達、FRET、光漂白後の蛍光回復、FRAP、または測定などの異なる技術と結合することができる。これらの適応はすべて、タンパク質研究の特性とその凝集形態に関する追加情報を提供します。
タンパク質凝集およびタンパク質恒常性の分野では、この技術は、システムに課せられた摂動、異なるタンパク質種の分布、人身売買、および一般的に生物内の可溶性および不溶性タンパク質画分の違いと有意性を調査することを可能にした。麻酔薬のアジ化ナトリウムは有毒であり、手袋とゴーグルで処理し、ヒュームフードの下で希釈する必要があります。この技術は顕微鏡ベースであるため、レーザーの処理に関連するすべての警告に従うことが重要です。
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概要
この研究では、蛍光寿命イメージング（FLIM）を使用して、生きているC. elegansモデルにおけるタンパク質凝集をモニタリングし定量化します。この技術により、神経変性疾患に関連するタンパク質構造の非侵襲的観察が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 細胞生物学
背景
- タンパク質凝集は神経変性疾患の重要な特徴です。
- FLIMは異なるタンパク質状態を区別する方法を提供します。
- この技術は、毒性が最小限でin vivoで実行されます。
- FLIMは神経科学以外にも、がん診断など応用があります。
研究の目的
- タンパク質凝集のメカニズムを調査すること。
- アミロイド構造と可溶性タンパク質を区別すること。
- C. elegansモデルにおける老化とストレスの文脈でFLIMを適用すること。
使用された方法
- 蛍光寿命イメージング（FLIM）
- C. elegansのin vivoイメージング
- 非侵襲的観察技術
- タンパク質凝集ダイナミクスの分析
主な結果
- アミロイドタンパク質構造と可溶性カウンターパートの成功した区別。
- 時間の経過に対するFLIMの堅牢性と再現性の実証。
- タンパク質凝集と神経変性疾患の関連性の強調。
- イメージング技術の最小限の毒性副作用を示しました。
結論
- FLIMは生きている生物におけるタンパク質凝集を研究するための価値あるツールです。
- この方法は神経変性疾患メカニズムの理解を深めることができます。
- 将来の応用はがん研究を含む他の分野にまで及ぶ可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Fluorescence lifetime imaging (FLIM) enables noninvasive, quantitative monitoring of amyloid fibrilization in living models, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs. By distinguishing integrated amyloid structures from soluble species without staining, FLIM provides predictive confidence in early discovery workflows. The method’s robustness and reproducibility facilitate cross-functional collaboration and scalable assay development for protein homeostasis research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing amyloid fibrils from soluble and accumulated protein species in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, fluorescence-lifetime-based readouts that correlate directly with aggregation levels.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by allowing comparison of fibrilization across genetic backgrounds, environmental stimuli, or amyloid variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling label-free, longitudinal tracking of protein aggregation in specific cells such as neurons.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through FLIM’s independence from fluorophore expression levels and resistance to photobleaching.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by detecting aggregation-promoting or -preventing strategies in any light-microscopy-compatible biological system.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by monitoring aggregation dynamics across aging and proteostasis network perturbations in disease-relevant models.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by quantifying soluble versus insoluble protein fractions in living organisms over time.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when studying protein homeostasis, enabling comparison of trafficking and distribution of protein species without further staining.
Pipeline & Workflow Integration
FLIM integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies by providing quantitative, noninvasive readouts of protein aggregation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of amyloid structures in specific cells such as neurons during aging.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through photon collection and lifetime fitting that exclude dim pixels and saturated signals for robust measurements.
- Analytics: Provides statistical outputs such as chi-square values near one and weighted mean lifetime (tau one) to compare conditions and assess fit quality.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling observation of aggregation in aging models and upon proteostasis network perturbation, relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for comparing fibrilization across different amyloid proteins, genetic backgrounds, or environmental stimuli in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein aggregation studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of amyloid detection in vivo without staining or bleaching.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early detection of aggregation propensity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, longitudinal aggregation data in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence lifetime imaging and laser safety protocols.
- Needs FLIM-capable microscopy setup with appropriate objectives (e.g., 63X immersion) and photon detection capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters such as scan sync, repetition rate, gate max, and photon collection thresholds (10⁴–10⁵ ADC).
- Involves adaptation considerations across model systems, including agarose pad preparation, anesthetic use (e.g., sodium azide), and immobilization protocols.
- Includes practical limitations such as the need to pre-test fluorophore properties in the nematode model and avoid photon pileup during acquisition.
