Name: 単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 52 s
Description: 学ぶ、永久歯由来のヒト歯髄幹細胞を酵素処理法と組織片培養法で単離・特徴付けし、オドントブラストへ分化させる方法。再生医療における歯組織工学への応用可能性を探る。

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我々は感謝し、彼の技術的支援のための彼らの重要な議論とモハマド·レザ·カデムシャリフ博士のレイラShakeri＆博士アレフDournaeiを認める。

1。酵素溶液及び増殖培地（PM）を準備<ol><li> コラゲナーゼI型溶液を作る：コラゲナーゼI型（12 mg / ml）を秤量し、0.2μmのシリンジフィルターを用いて1mlのPBSとフィルターで溶解する。それを15 mlチューブを配置し、必要になるまで-20℃で保管してください。 </li><li> ディスパーゼ溶液を作る：ディスパーゼを秤量（16 mg / ml）と1mlのPBSとフィルターが0.2μmのシリンジフィルターを使用して溶かす。それを15 mlチューブを配置し、必要になるまで4℃で保管してください。 </li><li> 酵素液を作る：1 mlのコラゲナーゼI型溶液（12 mg / ml）と100 mg / mlのペニシリンを含む2 mlの滅菌PBSに1ミリリットルディスパーゼ溶液（16 mg / ml）を、100 mg / mlのストレプトマイシンを追加します。最終体積ディスパーゼとコラゲナーゼIの合計濃度がreceptively 4 mg / mlおよび3 mg / mlであるべきです。次に、4つの15 mlチューブ、それぞれ含む1 mlの酵素液の中でアリコートこのボリューム。各チューブは1パルプ消化を使用することができる。 </li><li> PBSに100 mg / mlのペニシリン、100 mg / mlのストレプトマイシンを追加：洗浄液を作る 。 </li><li> 10％のFBS＆100単位/ mlペニシリンイーグル培地（α-MEM）、100 mg / mlのストレプトマイシンのアルファ改：基本的なメディアを作成します 。 </li><li> 10％のFBS、100μMのL-アスコルビン酸-2 -リン酸、2mM L-グルタミン、100ユニット/ mlペニシリン、100 mg / mlのを補ったイーグル培地（α-MEM）のアルファ改：増殖メディア（PM）を作るストレプトマイシン、0.25 mg / mlのアムホテリシンB </li><li>イーグル培地のアルファ改質（α-MEM）、10％FBS、100μMのL-アスコルビン酸-2 -リン酸、2mM L-グルタミン、100ユニット/ mlペニシリン、100 mg / mlのストレプトマイシン、0.01μMで補足：歯原性メディアを作るデキサメタゾン、5mMのβ-グリセロールリン酸、1.8 mMのリン酸一カリウム。 </li></ol> 2。歯髄幹細胞Isolatio用ヒト歯髄組織を準備N <ol><li>正常ヒト第三大臼歯が承認治験審査委員会（IRB）の下でイマーム·アリの歯科医院で大人（年齢21〜29歳）から収集された。 </li><li>歯は基本培地（α-MEM、10％FBSを添加した）に入れ、4℃で実験室に移した</li><li>無菌状態の下で、バイオハザード、層流フード内で作業して、セットアップが各歯1 100mmペトリ皿を処理することが行われていた。歯の表面を70％エタノールで洗浄した。 </li><li>ペトリ皿の一つで働いている間、歯は抜歯鉗子によって保たれ、手術用メスの刃は、根に破片や歯根膜をきれいにするために使用された。 </li><li>セメント質·エナメル接合はゆっくり髄室を明らかにするために滅菌歯科ディスクを使用して切断した。これは、切削加工、歯科組織の過熱を低減するためにゆっくりと実行しなければならないことを考慮すべきである。 </li><li>歯髄組織を穏やか冠と根から分離した。 </LI&gt; <li>歯髄組織は、手術用メスの刃の助けを借りて、小さな断片に切断した。 </li></ol> 3。ヒト歯髄アイソ<ol><li>歯髄組織は歯髄組織またはhDPSCsの単離のための歯髄組織外植片から直接細胞伸長のいずれかの酵素分解を受けた。 </li><li> 歯髄組織の酵素的解離： <ol><li>歯髄組織の小片を37℃で1時間、酵素溶液中に移した組織を壊すのに役立つ渦30分毎。 </li><li>その後、大きな細胞凝集体を除去し、単細胞懸濁液を70μmのセルストレーナーを介して細胞を通過させることによって得られた。 </li><li>単細胞懸濁液を室温で5分間1200 rpmで遠心分離した。 </li><li>上清を慎重にピペットし、ペレットを1mlの増殖培地（PM）に再懸濁した。 （ 注：増殖培地中のFBSは終了DIS酵素基群集。） </li><li>歯髄の単細胞懸濁液は、PMとの25cm 2の培養フラスコに播種し、次いで、5％CO 2中37℃でインキュベートした。 </li><li>細胞のコンフルエントに達するまで培養培地は3日ごとに変更されました。 </li></ol></li><li> 歯髄組織外植片から直接細胞伸長： <ol><li>歯髄組織が​​1-2mmの断片にみじん切りされ、各部分がPMと25 cmの2培養フラスコに入れた後、37℃、5％のCO 2インチそれは、細胞の伸長のためのPMの総量はさらに、細胞伸長のためのパルプ片（フラスコあたり2〜3 ml）の添付ファイルをサポートしなければならないことを考慮すべきである。 </li><li>伸長が観察された後に培地を変更しました。 </li><li>合流手狭細胞が1:4の割合（通路1）で継代培養した。 </li></ol></li></ol> 4。免疫表現型検査<ol><li> 250,000細胞/通路3内のセルの両方のタイプのチューブを4℃暗所で30分間、PEまたはそれらのアイソタイプとFITC結合抗ヒト抗体でインキュベートした。 （ 注：抗体の濃度は、製造プロトコルに従って適用された） </li><li>インキュベーション時間後、100μlのPBSまたはFACS希釈液を各チューブに添加し、暗所に5分間1,200 rpmで遠心分離した。 </li><li>上清を除去し＆ペレットを100μlのPBSや暗い場所でのFACS希釈液で再懸濁した。 </li><li>標的表面マーカー（CDマーカー）は、BD FACSキャリバーによって評価した。 </li></ol> 5。鉱化細胞へDPSCsの分化誘導とは、アリザリンレッドSアッセイを定量化<ol><li>歯髄組織外植片（DPSC-OG）から歯髄組織の酵素的解離（DPSC-EDとも呼ばれます）または直接的な細胞伸長のいずれかによって得られたDPSCsは3継代継代培養した。 </li><li> Aトン通路3は、細胞を5000細胞/ウェルで6ウェルプレートに種した。 </li><li> 60％の合流点に、歯原性媒体は、従来のPMに取って代わられた。スリーウェルを増殖培地を追加することにより、ネガティブコントロールとして残った。 </li><li>媒体は21日目まで3日ごとに変更します。 </li><li> 21日目に、細胞をPBSで洗浄し、1ml /ウェルを室温で15分間、10％パラホルムアルデヒドで固定した。 </li><li>その後、パラホルムアルデヒドは、慎重にピペットし、細胞を蒸留H 2 Oで3回（各回5〜10分）を洗浄した（ 注：単層を乱さないようにしてください。） </li><li>洗浄した後、1ml /ウェルアリザリンレッドSを室温で20分間添加した。 </li><li>細胞は、任意の追加のアリザリン赤を除去するために脱イオンH 2 O 4倍（優しく揺らしながらたびに、5分間）により洗浄した。 </li><li> 1ml /ウェルH 2 Oは乾燥から細胞を防ぐために追加されました。 </li><li>プレートは視覚insに想定したpectionおよび/または画像取得。 </li><li>アリザリンレッドS定量アッセイのために、H 2 Oを振とうしながら室温で30分間、6ウェルプレート＆インキュベーションの各ウェルに1mlの10％酢酸に置き換えられました。 </li><li>その後、細胞単層/井戸がスクレープ＆酢酸＆細胞の両方であった別の1.5mlマイクロ遠心管に移した。 （ 注：各ウェルは、3つの試験ウェル＆各ED＆OGのグループでは3つの対照ウェルすなわち別のチューブに転送する必要があります） </li><li>チューブは30秒間激しくボルテックスした。 </li><li> 85〜ヒート℃で10分間。 （ 注：蒸発を避けるために、チューブをパラフィルムで密封した。） </li><li>加熱後、試験管を5分間氷上に移した。 （ 注 ：冷却になるまでチューブは開かないでください。） </li><li>スラリーは、15分間20,000 xgで遠心分離した。遠心分離しながら、アリザリンレッド規格が作られたアップ。 </li></ol>アリザリンレッドS標準は、第一希釈緩衝液を希釈＆テーブルに基づいて、2倍希釈系列を作るために使用することにより調製した。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="7"> 染料の高域濃度 </td><td colspan="7"> 染料の低域の濃度 </td></tr><tr><td> 2mMの</td><td> 1mMの</td><td> 500μMの</td><td> 250μM </td><td> 125μMの</td><td> 62.5μM </td><td> 31.3μM </td><td> 15.6μM </td><td> 7.8μM </td><td> 3.9μM </td><td> 1.9μM </td><td> 0.9μM </td><td> 0.4μMの</td><td>ブランク</td></tr></tbody></table><ol start="16"><li>遠心分離後、上清/管1mlの新しい独立した1.5​​mlマイクロ遠心管に移した。 </li><li> pHは〜375μlの10で中和したチューブあたり％水酸化アンモニウム。 （ 注：pHの怒りは4.1から4.5でなければなりません。） </li><li>スタンダード＆サンプル（別々のテスト＆コントロールが含まれています）150μlを96ウェルプレートに不透明な壁、透明な底に添加した。 </li><li>吸光度を405nmで読み取ったと試料からのOD値をさらに分析するための標準的なプロットと比較した。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルは、2つの方法、酵素的解離と歯髄組織外植片からの幹細胞の直接の伸長を用いて歯髄からhDPSCsの単離および特性のプロセスについて説明します。また、象牙芽細胞へのこれらの細胞のインビトロ分化に 、定量的なアリザリンレッドS＆QPCRアッセイにより評価した。 人間の歯から歯髄組織を分離するための既存のプロトコルは、プライヤー（骨鉗子）9、摘出針29、グレイシーキュレット30、歯科裂溝バリ4などの低レベルを考慮しながら、これらの方法は、時間がかかるなど、様々な楽器を使用していた継続的に水を添加することによりパルプの過熱。しかし、現在の技術では、歯科用ダイヤモンドディスクをワンステッププロセスで最小汚染で歯をカットするための迅速な方法であり、切削加工時にパルプの過熱を最小限に歯髄組織の分離のために使用されます。また、hDPSCs再ようやく議論目的によるヒト永久歯の場合に比べて決してされている象牙芽細胞に分化した。量的アリザリンレッドSアッセイによる差別化hDPSCsの比較評価...

幹細胞は、マルチ効力と自己再生15として知られている2つの顕著な特徴を持っているクローン原性細胞である。異なる複製効力を持つすべての幹細胞のう ​​ち、生後幹細胞などの歯科幹細胞は、それらのアクセシビリティ、可塑性、および他の16の成体幹細胞と比較して高い増殖能力を近年注目を集めている。特徴的には、間葉系幹細胞と同様に、歯髄幹細胞は、複数の分化間充織に能力および/ ​​または in vitro および in vivo の両方において非間葉系統を持って付着クローン原性細胞である。1-8,17,18 DPSCsが特定される彼らの造血抗原の陰性発現（ 例えば 、CD45、CD34、CD14）、およびCD90、CD29、CD73、CD105、CD44およびSTRO-1の陽性発現。19,20 最小痛み＆罹患率との容易な得られた電位は貴重として人間DPSCsを作るMSCのできる源は、骨髄間葉系幹細胞21として普通のソースに比べて。一般的に、DPSCsは伸長法、 すなわち 、歯髄組織外植片からの幹細胞の遊走（DPSC-OG）22から24、および/ ​​または酵素消化によって（DPSC-ED）の4,6,25のいずれかの方法で単離されている。これまでの研究では、単離法と培養条件は 、in vitro の通路26,27 内で異なる集団または系統を誘導できることが示されている。永久歯（pDPSCs）の場合では、Huang らは、酵素消化pDPSCsが手狭DPSCsに比べて高い増殖能力を持っていることを明らかにした。また26は 、乳歯（dDPSCs）の場合、それが実証されたそのSTRO-1とCD34マーカーはdDPSC-OGと比較してdDPSC-EDの続きを表明した。また、dDPSC-EDは、定義された骨/ odonto培地で高い無機化速度が表示されていましたので27によりrのDPSCsの傑出した電位にegenerative薬は、より多くの研究は、異なる分離方法に由来している可能性のある様々な集団をよりよく理解するために必要となります。 ここでは、パルプ抽出のプロセスを容易にするためのワンステップデンタルダイヤモンドディスクを使用することにより、パルプ抽出の簡単な方法を紹介する試みであった。また、EDまたはOGの方法を適用することにより、ヒト歯髄由来幹細胞を単離した後、両群間の一般的なプロパティと分化能についても検討した。

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬の名称</td><td>会社</td><td>カタログまたはロット。数</td><td>コメント（オプション） </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> GIBCO </td><td> 11900-073 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C0130-100MG </td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td> GIBCO </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB </td><td> GIBCO </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td>定義されたウシ胎児血清（FBS） </td><td> Hyclone社</td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> L-アスコルビン酸-2 - リン酸</td><td>シグマ</td><td> A8960-5G </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td> GIBCO </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>シグマ</td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> β-グリセロールリン酸二ナトリウム塩水和物、BioUltra </td><td>シグマ</td><td> G9422-100G </td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td>骨形成アッセイキット</td><td>ミリポア</td><td> PS01802031 </td><td></td></tr><tr><td>マウスIgG2b-PEアイソタイプコントロール</td><td> BDファーミンジェン</td><td> 50808088029 </td><td></td></tr><tr><td> FITC標識マウスIgG2bアイソタイプコントロール</td><td> BDファーミンジェン</td><td> 559532 </td><td></td></tr><tr><td> FITC標識マウスIgG1κアイソタイプ</td><td> BDファーミンジェン</td><td> 11471471 </td><td></td></tr><tr><td> FITC / PEのマウス抗ヒトCD34/CD45 </td><td> BDファーミンジェン</td><td>341071 </td><td></td></tr><tr><td> PEの抗ヒトCD146 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 550315 </td><td></td></tr><tr><td>モノクローナルマウス抗ヒトCD90/FITC </td><td> Daka </td><td> 00034418 </td><td></td></tr><tr><td> PEのマウス抗ヒトCD73 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 550257 </td><td></td></tr><tr><td>抗H CD105/Endoglin PE </td><td> BDファーミンジェン</td><td> FAB10971P </td><td></td></tr><tr><td> PEのマウス抗ヒトCD11b/Mac1 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 5553888 </td><td></td></tr><tr><td> CD44は、PEマウス抗ヒト</td><td> BDファーミンジェン</td><td> 555479 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液（PBS） </td><td> GIBCO </td><td> 003000 </td><td></td></tr><tr><td> 70μmのセルストレーナー</td><td>ファルコン</td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td&gt;0.2μmのシリンジフィルター</td><td>マイレクス-GV </td><td> SLGV033RB </td><td></td></tr><tr><td> 25cm 2の培養フラスコ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> Z707481 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td> BD FACSキャリバー</td><td> BD </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレート分光光度計multiskan </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 51119200 </td><td></td></tr><tr><td> Fleurcense顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェアバージョン2.3.1を流れる</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

<p class="jove_content"開発&gt;親知らずはルーチン矯正治療によって得られることが成人期に幹細胞の容易にアクセス可能なソースです。ヒト歯髄由来幹細胞（hDPSCs）成体幹細胞の通常のソースと比較して多系統分化能力と高い増殖能力を持っている<sup&gt; 1月8日</sup&gt;ので、hDPSCsは、組​​織工学や再生医療における自家移植のための良い候補である可能性があります。これらの利点に加えて、そのようなimmunolodulatory効果などの間葉系幹細胞（MSC）の機能を有するも、同種移植の場合には、hDPSCsがより貴重作る<sup&gt; 6,9,10</sup&gt;。そのため、幹細胞のこのソースを使用する主なステップは、歯髄組織からhDPSCsを単離するための最適なプロトコルを選択することです。この目標を達成するためには、そのような彼らの一般的な表面マーカー＆またそれらの分化能など異なる細胞行動、上の様々な分離条件の影響を調査することが重要です。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;このように、ここで我々は影響を受け第三大臼歯歯からヒト歯髄組織を分離し、次にhDPSCsを単離するための文献に基づいて、両方の既存のプロトコルを使用し、<sup&gt; 11月13日</sup&gt;<em&gt;すなわち</em組織外植片から&gt;酵素歯髄組織の解離（DPSC-ED）または伸長（DPSC-OG）。これに関しては、我々は、歯科ダイヤモンドディスクを使用して単離法を容易にしようとしました。次に、これらの細胞はCD146ともSTRO-1のような間質関連マーカー（CD73、CD90、CD105、CD44＆）、造血/内皮細胞マーカー（CD34、CD45及びCD11bを）、血管周囲のマーカーで特徴付け。その後、これらの2つのプロトコルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（QPCR）＆アリザリンレッド染色の両方による象牙芽細胞への分化能に基づいて比較した。 QPCRは、鉱化関連遺伝子の発現（; ALP、マトリックス細胞外リン糖タンパク質; MEPE＆象牙シアロホスホ·タンパク質; DSPPアルカリホスファターゼ）の評価のために使用された。<sup&gt; 14</sup</p

<ol><li> 酵素的解離（DPSC-ED）により得られたDPSCsは10日、15,18（図1）ここに示されています。分離後約3〜5日に形成するために開始されたコロニーが。 </li><li> 手狭DPSCs（DPSC-OG）は5日、10、13＆18ページの図2に示されています。線維芽細胞様細胞は、平行播種後約5日で注文してフラスコに歯髄組織から移行し始めた。 </li><li> 両方の方法を使用して通路3でDPSCsを図3に示します。DPSCsどちらのタイプがほぼ同じ大きさと形態にあった。 </li><li> DPSC-EDとDPSC-OG（図4）の結果をイムノ。これらの結果は、CD44、CD73、CD105とCD90の間葉系幹細胞のマーカーの存在、そしてそのようなCD34、CD45とCD11bをのような造血＆内皮マーカーが存在しないことを示した。 CD105とCD146（血管周囲のマーカー）の発現はDPSC-EDと比較してDPSC-OGで多かった。STRO-1は両群ともに陰性であった。 （ED 1と呼ばれる赤い線は、黄色の線はアイソタイプを示し...

のいずれかを使用して人間の歯髄幹細胞（hDPSCs）の単離および特性を説明する方法<strongパルプ&gt;酵素的解離（DPSC-ED）</strong&gt;または<strong歯髄組織外植片からの幹細胞の&gt;直接伸長（DPSC-OG）。その後に続く</strong&gt;<em&gt; in vitroで</em象牙芽細胞へのhDPSCs両方のタイプの&gt;比較分化。

発育中の親知らずは、成人期において幹細胞を容易に採取できる供給源であり、日常的な矯正歯科治療を通じて得ることが可能です。ヒトの...

本手順の全体的な目的は、2つの方法を用いて、永久歯からヒト歯髄幹細胞を単離、特性評価および分化させることです。これは、健全な埋伏智歯を採取し、まずセメントエナメル接合部付近で切断することで達成されます。歯科パルプ幹細胞（D PSCs）は、2つの異なる方法で単離されます。第一の手法では、ポリープ組織をcollagenase type oneおよびdisc space solution中でインキュベートし、酵素的に消化させます。ここではこれをedと呼びます。第二の手法の単離方法では、ポリープ組織を消化処理せず、そのままフラスコに投入します。このようにして、dpssが組織からフラスコへと遊走し始めます。これらの細胞は、アウトグロース（outgrowth）分離法に由来するため、OGと呼ばれます。手順の第2ステップは、フローサイトメトリーを用いた幹細胞の同定です。手順の3番目のステップは象牙芽細胞分化の誘導であり、最終ステップは、アリザリンレッド染色およびqPCRによる2群間の象牙芽細胞分化の比較評価です。私はRian研究所幹細胞・発生生物学部門のRA Kdeです。本日は、2つの手法を用いたヒト間葉系幹細胞の単離、特性評価、および比較分化について解説します。こんにちは、リオ研究所のRezaian博士です。私たちはヒト歯髄幹細胞に関するプロジェクトに取り組んでいます。これらの細胞は間葉系幹細胞の一種であり、痛みや侵襲性を最小限に抑えて容易に採取することが可能です。間葉系幹細胞は、プラスチック接着能、コロニー形成能、および多分化能によって定義されます。幹細胞部門のDr.Amiです。当研究所のラボでは、研究および将来的な応用のために幹細胞を単離する目的で、本手順を用いています。再生医療において、将来的な幹細胞療法の源としてこれらの幹細胞を利用するための最初の手順は、ヒト組織から幹細胞を単離するための最適なプロトコルを選択することです。この目標を達成するためには、異なる幹細胞単離条件下における細胞挙動の特定の側面を調査することが極めて重要です。まず、歯髄の酵素的解離、または組織移植片からの幹細胞の外向増殖（outgrowth）のいずれかの方法を用いて、ヒト歯髄幹細胞を単離します。次に、それらを特性解析し、原芽細胞に分化させます。それでは始めましょう。まず、hyaluronidaseとcollagenase Type Iの両方をPBSに溶解させます。その後、0.2 micronのシリンジフィルターを用いてろ過します。両方をコニカルチューブに回収してください。次に、penerとPBSを加えて最終濃度に調整します。健全な親知らずを、滅菌条件下で冷やした基礎培地を用いてラボに搬送します。分析前に、70% ethanolで歯の表面を清掃します。歯の表面から不純物が完全に取り除かれていることを確認してください。滅菌済みの歯科用ディスクを用いて、歯のセメントエナメル接合部付近を切り出し、髄腔を露出させます。歯科組織の過熱を防ぐため、切断作業はゆっくりと行う必要があります。次に、Scarpaブレードを使用して、歯冠から歯髄組織を慎重に分離し、歯髄組織を1〜2 mmの断片に切り分けます。歯髄組織の小さな断片を1 mLの酵素溶液に移し、37 °Cで1時間置く。その際、歯髄組織の分解を促進するため、30分ごとにボルテックスミキサーで撹拌する。その後、70 µmのセルストレーナーに通して大きな凝集体を除去する。次に、PENERを含むPBSを加え、1,200 RPMで5分間遠心分離を行う。上清を慎重に除去します。次に、プレートを増殖培地で懸濁して培養フラスコに移し、培地を加えます。その後、インキュベートします。アウトワーク法において、細胞がコンフルエントになるまで3日ごとに培地を交換します。切断工程を繰り返します。歯の切断とは、組織を1〜2 mmの断片にすることです。その後、それらを培養容器に入れます。増殖培地を加え、インキュベートします。その後の細胞外方増殖のために、増殖培地の全量がすべての断片の接着をサポートできる量であることを考慮する必要があります。アウトグロースを確認した後、細胞がコンフルエントになるまで3日ごとに培地を交換します。免疫表現型解析では、2種類のD PSCsの両方を、PEまたはFITC標識抗体とともに4°Cの暗所で30分間インキュベートします。その後、PBSを加え、1,200 RPMで5分間遠心分離します。上清を除去し、プレートをPBSで再懸濁させた後、フローサイトメーターを用いて表面マーカーの評価を行います。両方のタイプのDPCを3代継代します。その後、トリプシン処理を行い、60%のコンフルエンシーで6つの赤い培養皿に播種し、PMを歯原性分化誘導培地に交換します。3つのウェルにはPMを添加し、陰性対照として保持します。3日ごとに培地を交換し、21日目にPBSで細胞を洗浄します。その後、1ウェルあたり1 mLの10%ホルマリン溶液を用いて、室温で15分間固定します。15分後、固定液を慎重に取り除き、蒸留水で細胞を3回洗浄します。次に、水を1 mLのred alza赤色染色液に置換します。20分後、過剰な染料を取り除き、脱イオン水で細胞を4回洗浄します。次に、細胞の乾燥を防ぐため、ウェルあたり1 mLの水を加えます。染色の後、顕微鏡下でコントロールと比較すると、3つのレールが赤色に変化していることが確認できます。高倍率で観察すると、赤色染色の定量化のために、細胞周囲の色吸収を確認することができます。水を除去した後、ウェルあたり1 mLの10%酢酸を加え、振盪しながら30分間インキュベートします。次に、セルスクレイパーを用いてプレートから細胞を静かに回収します。その後、それらを別々のチューブに移します。30秒間激しくボルテックス（VOR）します。その後、85 °Cで10分間加熱します。蒸発を防ぐためにチューブをParaFilmで密閉し、氷上で5分間冷却します。次に、20,000 ×gで15分間遠心分離します。その間に、規定のプロトコルに従ってアルザリンレッドの標準連続希釈液を調製します。遠心分離後、上清を除去し、新しいチューブに移します。10% ammonium hydrocyteを用いてpHを中和します。その後、標準品およびサンプルを96ウェルプレートに加えます。ウェルプレートを用い、405 nmで吸光度を測定し、標準的な段階希釈に基づいてデータを分析します。ここでは、10日目、15日目、18日目に酵素的解離によって単離されたDPSCsと、5日目、10日目、13日目、18日目に過成長したDPSCsを確認できます。Case 3における両タイプのDPSCsは、サイズと形態がほぼ同一です。免疫表現型解析の結果、CD 44、CD 73、CD 19などの間葉系幹細胞マーカーが陽性であり、CD 34、CD 45、CD 11 Bなどの造血系および内皮系マーカーは陰性であることが示されました。興味深いことに、CD 105およびCD 146の発現は、DPSCEDと比較して過成長したDPSCsでより高くなっていました。象牙芽細胞分化21日目におけるアリザリンレッド染色の定量結果では、コンデンタルチップを用いない幹細胞と比較して、DPSCEDでより多くのカルシウム沈着が認められました。qPCRの結果はまた、D-P-S-C-Dにおいて、ミネラル化マーカーであるMEPおよびALPの発現が、分化前の歯科幹細胞と比較して有意に高いことを示しています。同時に、これら両遺伝子は分化過程で制御されており、また、歯牙形成マーカーであるDSPPの発現も分化に伴い増加しました。しかしながら、分化細胞におけるDSPPの発現について、ED群とOG群の間に有意な差は認められませんでした。以上で、歯髄の酵素的解離または組織外植片からの幹細胞の遊出による、ヒト歯科幹細胞の分離方法について解説しました。本手順がお役に立てば幸いです。皆様の実験での成功を願っております。ありがとうございました。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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