単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

この手順の全体的な目標は、2つの方法を使用して、永久歯からヒトの非ユダヤ人パルス幹細胞を分離、特徴付け、および区別することです。これは、健康な埋伏親知らずを収集し、最初にセメントの周りでエナメル質の接合部にそれらを切断することによって達成されます。歯科用ポリ幹細胞D PSCは、2つの異なる方法で単離されます。

第1の方法では、ポリープ組織は、コラゲナーゼ1型プラス椎間板スペース溶液でインキュベートすることにより酵素的に消化されます。ここでは、それらをエドと呼んでいます。第2の方法の単離方法を考慮すると、触手組織は消化されずにフラスコにのみ配置されます。

このようにして、dpssは組織からフラスコに移動し始めます。OGと名付けられたこれらの細胞は、伸長分離法を指します。手順の2番目のステップは、フォールサイトメトリーを使用した幹細胞の同定です。

手順の 3 番目のステップは歯芽細胞分化の誘導であり、手順の最後のステップは、赤色染色と QBCR による 2 つのグループ間の歯芽細胞分化の比較評価です。私はRian InstituteのDepartment of Stem Cells and Developmental BiologyのRA Kdeです。今日は、2つの方法を使用して、ヒト間葉系幹細胞の単離特性評価と比較分化を示します。

こんにちは、リオ研究所のレザイアン博士です。ヒトの歯髄幹細胞に関するプロジェクトに取り組んでいます。これらの細胞は一種のメカイ幹細胞であり、痛みや罹患率を最小限に抑えて簡単に入手できます。

Mechy幹細胞は、可塑性アラン能力、コロニー形成、および複数の分化能力を特異的に特定します。こんにちは、幹細胞部の阿見先生です。研究所では、この手続きを研究室で使用して、調査研究や将来の応用のために幹細胞を分離しています。

再生医療において、この幹細胞源を将来の幹細胞ベースの治療に使用するための最初のステップは、ヒト組織から幹細胞を分離するための最適なプロトコルを選択することです。この目標を達成するためには、さまざまな幹細胞単離条件下での細胞の挙動の特定の側面を調査することが重要です。まず、歯髄の酵素解離または組織インプラントからの幹細胞の伸長のいずれかを使用して、ヒトの歯髄幹細胞を単離します。

次に、それらを特性評価し、オーゲンブラストに区別します。それでは始めましょう。まず、スペースとコラゲナーゼタイプ1は両方をPBSに溶解します。

次に、OH 0.2ミクロンシリンジフィルターを使用してそれらをろ過します。両方を円錐形のチューブに引き込みます。次に、ペナーとPBSを追加して、最終的な集中力を高めます。

健康な親知らずを、鋼の条件下で冷たい塩基性培地で研究室に移します。勉強する前に、70%エタノールで歯の表面をきれいにしてください。歯の表面からの風をきれいにしてください。

滅菌された歯科用ディスクを使用してセメントエナメル質接合部の周りを歯を切開し、歯髄チャンバーを明らかにします。歯組織の過熱を減らすために、切断プロセスをゆっくりと実行する必要があることを考慮する必要があります。次に、クラウンから歯髄組織をそっと分離し、スカルパブレードで歯髄組織を1〜2ミリメートルの断片にします。

30分ごとに37°Cの渦で1mLの酵素溶液に小片の歯髄組織を移し替えます。その後、大きな凝集体を70ミクロンの細胞株に通して除去します。次に、PINER遠心分離機を含むPBSを1, 200 RPMで5分間追加します。

スーパーナットを慎重に取り外します。次に、プレートを増殖培地に懸濁し、pmを培養フラスコに移し、培地を加えます。その後、インキュベートします。

アウトワーク法で細胞の合流が達成されるまで、3日ごとに培地を交換します。切断プロセスを繰り返します。歯を切った後、組織を1〜2ミリメートルの断片にポップすることを意味します。

次に、それらを文化の中に置きます。増殖を伴うフラッシュ、中程度およびインキュベート。増殖培地の総量は、さらなる細胞増殖のためにすべての断片の付着をサポートしなければならないことを考慮する必要があります。

増殖を観察した後、細胞の合流が達成されるまで3日ごとに培地を交換します。イムノフェノタイピングでは、両方のタイプのD PSCをPEまたはFITC標識抗体と4°Cの暗所で30分間インキュベートします。次に、PBSとcentiビューを1, 200 RPMで5分間追加します。

上清と蘇生を取り除き、プレートをPBSに懸濁し、最後にフローサイトメーターの継代培養を使用して表面マーカーを評価します。次に、氷でトリップし、60%Coの流暢さで6つの赤い培養皿に移し、PMを歯原性の培地に置き換えます。3つの井戸はpmを追加することでネガティブコントロールとして残っています。

21日目に3日ごとに培地を交換し、細胞をPBSで洗浄します。次に、ウェルごとに1ミリリットルずつ固定します。10%フォーマルゲルの高さで、自宅の温度で15分間。

15分後、固定剤を慎重に取り除き、蒸留水で細胞を3回巻きます。次に、赤い染色液に赤いアルザあたり1ミリリットルの水を交換します。20分後、余分な色素を取り除き、脱イオン水で細胞を4回洗浄します。

次に、細胞が乾燥するのを防ぐために、井戸水ごとに1ミリメートルを追加します。染色後、顕微鏡下のコントロールと比較して3本のアップレールが赤く変わるのを見ることができ、赤く染色を定量化するための大きな倍率で細胞周囲の染色色吸収が見られます。水を取り除いた後、ウェルごとに1ミリリットル、10%酸性酸を加え、振とうしながら30分間インキュベー

次に、セルスクレーパーを使用してプレートから細胞をそっとこすり落とします。次に、それらを別々のチューブに移します。VORは30秒間、勢いよく動きます。

次に、摂氏85度に10分間加熱します。ParaViewトランスファーチューブを氷に5分間使用したシールチューブの蒸発を避けるために、彼らは20, 000Gで15分間使用しました。その間、地域のプロトコルに従ってアルツハイマー病の赤を標準的な段階希釈にしてください。

遠心分離後、スナットを取り外し、新しいチューブに移します。10%アンモニウムハイドロサイトでpHを中和します。次に、標準とサンプルを96に追加します。

ウェルプレートをプレートし、405ナノメートルで吸光度を測定し、標準的な段階希釈に従ってデータを分析します。ここでは、10日目、15日目、18日目に酵素解離によって単離され、5日目、10日目、13日目、18日目にDPCが成長しなくなったDPCを確認できます。イムノフェノタイピングの結果は、CD 44、CD 73、CD 19などの間葉系幹細胞マーカーの存在、およびCD 34、CD 45、およびCD 11 B.興味深いことに、CD 1 0 5およびCD 146の発現は、D-P-S-C-E-Dと比較して、成長したd PSCsでより多くなっています。 歯芽細胞分化の21日目の酵素赤色染色の定量では、幹細胞のcondenticalトップなしと比較して、D-P-S-C-E-Dでのカルシウム沈着量が多いことが示されています。

また、QPCRの結果は、幹細胞の出向きの歯と比較して、D-P-S-C-Dの石灰化マーカーとしてMEPとA LPの発現が有意に高いことを示しています。一方、分化中には両方の遺伝子が調節され、分化中に歯原マーカーが増加するにつれてDSPPの発現も制御されます。しかし、分化した細胞におけるDSVPの発現には、ED群とOG群の間で有意な差はありません。

髄の酵素的解離または組織説明からの幹細胞の伸長のいずれかを使用して、ヒトの歯科部分の幹細胞を分離する方法を示しました。というわけで、これだけです。この手順を実験に使ってみて、頑張ってください。

ありがとうございます。