離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

本手順の全般的な目的は、疾患を有するヒト心室標本から生存可能な心筋細胞を単離し、その機能的な変化を特性解析することである。これは、まず、組織の過度な分解および細胞損傷を避けるため、氷冷した心停止液中で新鮮な心室検体を迅速に回収し、細切することによって達成される。第二のステップでは、自作の消化装置と酵素溶液を用いて、心筋塊の段階的な消化を行う。

6回のサイクルにおいて、各サイクルでバッファーを含む細胞をチューブに回収し、細胞保存液で希釈します。最終ステップでは、機能特性評価を行うため、6本のチューブに含まれる細胞を、正常なカルシウム濃度を持つ標準的な生理学的溶液のより少量の容量で再懸濁します。最終的に、活動電位のパッチクランプ記録と蛍光色素を用いた細胞間カルシウムの同時評価を行い、肥大型心筋症患者の心筋細胞における活動電位、電位持続時間、および細胞内カルシウムサイクルの変化を示します。

標準的なチャンク除去法などの手法と比較した際のDYS法の主な利点は、酵素溶液とともに特注の消化装置を使用することで、シリコンスクレイパーにより様々な細胞の同時解離が可能になる点です。この手法は、心疾患に伴う既知の分子および構造的リモデリングが、個々の心筋細胞の変動にどのように反映されるかという、循環器内科領域における重要な疑問への回答に寄与します。これらの変動は本手法で解析可能であり、特定の薬剤による標的治療の対象となります。したがって、本技術の応用範囲は、肥大型心筋症などの遺伝性心疾患の治療にまで及びます。

実際、この手法は、心臓手術を受けた肥大型または虚血性心疾患患者の心室心筋細胞を用いて、新しい神経病理学的アプローチを検証するために利用可能です。私たちは、心臓手術中に採取されたヒト動脈標本と心室生検試料の類似性を比較した際に、まずこの手法を考案しました。本手順を開始するには、50 mLチューブに40 mLの心停止液を注ぎ、手術室から細胞分離室まで標本を輸送する間、氷上で保存してください。標本を速やかにラボエリアに搬送し、標本採取から10分以内に標本処理を開始してください。

手術室にて切除直後の心室心筋検体を回収します。氷冷したCP溶液で洗浄し、検体を氷冷CPバッファーに浸した状態でチューブに保存します。その後、細い鋏を用いて心内膜の線維化層を慎重に除去します。

心筋組織を2〜3 mmの小さな断片に切り分けます。1回の単離に使用する心室心筋の総量は100 mgから1 gとします。組織片を消化装置のスクレイピングチャンバーに移した後、チャンバー内のCPバッファーを冷たいカルシウムフリー解離バッファーに交換します。その後、消化装置を恒温槽に入れます。

バスを37.5 °Cに設定し、電源を入れます。次に、消化装置のモーターを始動させ、回転速度を毎秒1回転に設定します。DBで3回の洗浄サイクルを行い、8分ごとにチャンバー内の溶液を37 °Cの酸素飽和クリーンDBに交換します。

その後、DB溶液に250 units/mLのコラゲナーゼtype fiveおよび4 units/mLのプロテアーゼtype 24を加え、酵素バッファー1を調製します。次に、250 units/mLのコラゲナーゼを加えて、酵素バッファー2を調製します。

DBソリューション酸素化EB 1を5μL加え、37°Cまで温めます。次に、回転消化装置を用いて、37°Cで100%酸素化EB 1を3mL使用し、12分間の消化サイクルを2回行います。各サイクルの後、溶液をピペットで吸引して除去し、廃棄してください。

次に、細胞回収用の15 mLチューブ6本と、バッファーを溶出するための4 °Cのクラフトビール溶液80 mLを準備し、EB2を酸素供給し37 °Cまで温めます。続いて、37 °Cで100%酸素供給されたEB2を3 mL用い、最初の15分間の消化サイクルを行います。消化サイクルの後、最初の遊離心筋細胞を含む溶液を15 mLチューブに回収し、細胞懸濁液を12 mLの冷KB溶液で希釈します。

チューブを室温で水平に保管し、3 mLのEBを用いて12分間の消化サイクルをさらに5回、37 °Cで実施します。各サイクルの心細胞を含むバッファーを15 mLの円錐チューブに回収してください。また、各サイクルで回収した3 mLのバッファーに12 mLのKB溶液を加えて希釈することを忘れないでください。最後に、細胞を含む6本のチューブを室温で保管します。

このステップでは、1 mg/mLのウシ血清アルブミンを20 mLのカルシウムフリーTyrode緩衝液に加えます。次に、この溶液をろ過し、心筋細胞を含む6本のコニカルチューブを100 ×gで5分間遠心分離します。心筋細胞を沈殿させた後、上清を除去し、各チューブの細胞を室温で適量のBSA含有TBで再懸濁します。

第1および第2のステップでは、100 mMの塩化カルシウム溶液を少量ずつ添加し、細胞含有バッファー中のカルシウム濃度を徐々に上昇させます。カルシウム濃度をそれぞれ50 µMおよび100 µMまで上げます。その後のカルシウム添加ステップは5分ごとに行い、各ステップで濃度を100 µMずつ上昇させ、最終濃度0.9 mMまで到達させます。

分離手順の収率を評価するため、心筋細胞を含む溶液0.5 mLを顕微鏡用ガラスボトムチャンバーに移します。10倍の対物レンズ倍率で15箇所の視野を評価し、明瞭な横紋があり、重大な封入体が認められない棒状の細胞などの、健康な心筋細胞の割合を算出します。活動電位と細胞内カルシウムフラックスの同時記録を含むヒト心筋細胞の機能評価を行うには、期待される収率は約20%である必要があります。

まず、perforated patch構成でのパッチクランプ実験用のピペット溶液を調製します。次に、カルシウムフリーtbに1.8 millimolarの塩化カルシウムを加えます。この溶液を、パッチクランプ蛍光実験中の心筋細胞の灌流に使用します。

次に、1 mLの細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µM/Lのflu fortと10 µLのpower loadを加えます。チューブを水平に置いた状態で、室温で30分間インキュベートします。その後、チューブを垂直に立て、5分間静置して細胞を沈殿させます。

次に、上清をピペットで取り除き、細胞ペレットをカルシウム含有tbで再懸濁します。細胞懸濁液25 mLを、温度制御可能な顕微鏡搭載記録チャンバーに転送します。加熱マイクロ灌流システムを用い、37 °C、流速0.3 mL/minで重力灌流を行います。

マイクロピペットプラーを用いて、先端径3〜5 µm、PS充填時の抵抗値3〜4.5 MΩのパッチクランプピペットを作製します。その後、PSに250 µg/mLのamphotericin Bを添加し、これを電極に充填して、電極をピペットホルダーに装着します。次に、明瞭な条線があり、封入体が認められない円錐形の細胞を選択します。

ギガシールを形成し、アクセス抵抗が 20 ohm 以下に下がるまで 5〜10 分間待機します。その後、異なる刺激周波数の短パルスを用いて、カレントクランプモードで活動電位を誘発します。記録段階では、492 nanometers の明視野照明を点灯し、505〜520 nanometers で Fluor fort 蛍光を検出します。

次に、蛍光信号と膜電位信号を取得します。この図は、HCMサンプルの心室心筋細胞における活動電位の変化を示しています。ここでは、コントロール群の心筋細胞およびHCM群の心筋細胞から得られた、0.2 hertz、0.5 hertz、および1 hertzで誘発された代表的な重ね合わせ活動電位を示します。

コントロール心筋細胞における0.5 Hzでの重畳動作電位。isoproterenol 10⁻⁷ M 非存在下および存在下での結果が示されている。また、こちらはHCM患者由来の心筋細胞の膜電位の代表的なトレースであり、複数の自発的な脱分極である早期後脱分極が認められる。図は、HCMサンプル由来の心室心筋細胞におけるカルシウム・トランジェントの変化を示している。

ここでは、コントロール心筋細胞およびHCM細胞において、パッチピペットを介した0.2 Hzの刺激で誘発された代表的なカルシウムトランジェントの重ね合わせを示します。HCMおよびコントロール心筋細胞における異なる時点でのカルシウムトランジェントのキネティクスが示されており、ここでは3つの異なる周波数での刺激中の細胞内カルシウムを示す代表的な長時間トレースを提示しています。これにより、HCM心筋細胞において高頻度のペーシング時に拡張期カルシウムが増加することが強調されています。この図は、ヒト心室心筋細胞を用いた追加の実験的応用を示しています。

異なる膜電位で記録されたL型カルシウム電流の代表的な重ね合わせ波形を左に、HCMサンプルから単離した18個の細胞における異なる膜電位でのL型カルシウム電流ピーク密度の平均値を右に示します。また、1 Hzの電界刺激中に心室筋細胞から記録された細胞内カルシウム波形をここに示します。この手順を行う際は、サンプルの新鮮さを確保するため、手術室から検体を回収した後、速やかに手順を開始することが重要です。本手順に従ってヒト心室心筋細胞を単離します。ライフスタイル共焦点顕微鏡法や免疫化学的手法などの他の手法も実施可能であり、これらは、心疾患の発症後、膜構造やカルシウム放出部位の細胞内局在がどのように変化するかといった根本的な疑問に答えるために極めて重要となります。

この手法は細胞心臓病学における道を切り開き、心室心筋細胞の機能的異常の研究や、新しい治療法の潜在的な有用性の検証を可能にしました。このビデオを視聴することで、ヒト試料から生存可能な単一心筋細胞を単離する方法と、さまざまな条件下で細胞機能を特性解析する方法について、十分に理解することができます。