離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

この手順の全体的な目標は、疾患のヒト心室標本から生存可能な心筋細胞を分離し、それらの機能的変化を特徴付けることです。これは、過度の組織劣化や細胞損傷を避けるために、まず新鮮な心室サンプルを氷冷の心臓麻痺溶液に迅速に収集してミンチすることによって達成されます。2番目のステップは、カスタムメイドの消化装置と酵素溶液を使用して、心筋チャンクの段階的な消化を行うことです。

6サイクルで、バッファーを含む細胞を各サイクルでチューブに集め、細胞保存溶液で希釈します。最後のステップは、機能特性評価を行うために、6本のチューブに含まれる細胞を、カルシウム濃度が正常な低容量の標準生理液に再懸濁することです。最終的に、活動電位のパッチクランプ記録と蛍光色素を使用した細胞間カルシウムの同時評価を使用して、肥大型心筋症患者の心筋細胞における作用、電位持続時間、および細胞内カルシウム循環の変化を示します。

DYSの主な利点は、標準的なチャンクデジェクション法と同様に、16メソッドよりもユニークなのは、酵素溶液との関連で、カスタムメイドの消化デバイスを使用することであり、これにより、シリコンスクレイプのおかげで可変サイトの結合結合を解除できます。この方法は、心臓病に関連するよく知られた分子的および構造的リモデリングが、私たちの方法で分析でき、特定の薬剤によって標的とされる単一の心筋細胞の変化にどのように反映されるかなど、心臓病学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。したがって、この技術の意味は、肥大型心筋症などの遺伝性心疾患の治療にまで及びます。

実際、この方法は、心臓手術を受けた肥大型または虚血性心疾患の患者の心室心筋細胞に対する新しい神経障害性アプローチをテストするために使用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、心臓手術中に得られた心室生検とヒトの動脈標本との類似性を比較したときでした。この手順は、50ミリリットルのチューブに40ミリリットルの心臓麻痺溶液を注ぎ、手術室から細胞分離ラボへの検体輸送のために氷に保管することから始め、検体をラボエリアに迅速に移し、検体切除から10分以内に検体処理を開始します。

切除直後の手術室からの次の集団心室心筋標本。氷冷したCP溶液で洗浄し、試料を氷冷CPバッファーに入れたままチューブに保管します。その後、細いハサミを使用して心内膜線維層を慎重に取り除きます。

心筋組織を2〜3ミリメートルの長さの小片に切り、心室心筋の総量を100ミリグラムから1グラムの分離ごとに行います。チャンクを消化装置のスクレイピングチャンバーに移した後、チャンバー内のCPバッファーを冷たいカルシウムフリー解離バッファーに交換します。次に、消化装置をサーモスタットバスに入れます。

お風呂を37.5°Cにセットして電源を入れます。次に、消化装置のモーターをONにし、回転速度を1秒あたり1回転に設定します。DBで3回の洗浄サイクルを行い、チャンバー内の溶液を摂氏37度の酸素飽和クリーンDBで8分ごとに交換します。

その後、コラゲナーゼ5型プロテアーゼ1ミリリットルあたり250単位とミリリットルあたり4単位を添加して、酵素緩衝液1を調製します。DB ソリューションに「24」と入力します。次に、コラゲナーゼ1ミリリットルあたり250ユニットを添加して、酵素緩衝液2を調製します。

DB溶液に5を入力してEBを酸素化し、摂氏37度まで温めます。次に、回転分解装置で、摂氏37度の100%酸素化EBを3ミリリットル使用して、12分サイクルの消化を2回行います。ピペット吸引で溶液を取り出し、各サイクル後に廃棄します。

次に、細胞収集用の6本の15ミリリットルチューブと、バッファーを逃れるための摂氏4度のクラフト醸造液80ミリリットルを準備し、EB2を酸素化し、摂氏37度まで作業します。その後、摂氏37度で100%酸素化されたEB 2の3ミリリットルで最初の15分間の消化サイクルを実行します。消化サイクルの後、最初の関連筋細胞を含む溶液を15ミリリットルのチューブに集め、細胞懸濁液を12ミリリットルの冷たいKB溶液で希釈します。

チューブを室温で平らに保管し、摂氏37度で3ミリリットルのEB 2を使用して他の5回の12分間消化サイクルを実行し、各サイクルで筋細胞を含む緩衝液を15ミリリットルの円錐管に収集します。また、3ミリリットルの回収した緩衝液を、各サイクルで12ミリリットルのKB溶液で希釈することを忘れないでください。最後に、チューブを含む6つのセルを室温で保存します。

このステップでは、20ミリリットルのカルシウムフリーチロバッファーに1ミリグラムのウシ血清アルブミンを添加します。次に、溶液をろ過し、次に、100チーズで6つの筋細胞を含む円錐形チューブを5分間遠心分離します。筋細胞を強制的に沈降させるには、上清を取り除き、室温で結核を含むBSAを可変量で各チューブに細胞を再懸濁します。

第1ステップと第2ステップで1リットルあたり100ミリモルの塩化カルシウム溶液の小さなOTTを添加することにより、バッファーを含む細胞内のカルシウム濃度を徐々に増加させます。カルシウム濃度は、それぞれ50マイクロモル/リットル、100マイクロモル/リットルに引き上げられます。次のカルシウム添加ステップは5分ごとに実行され、各ステップで濃度が1リットルあたり100マイクロモルずつ上昇し、最終濃度は0.9ミリモル/リットルになります。

単離手順の収率を評価するには、0.5ミリリットルの筋細胞含有溶液を顕微鏡のガラス底チャンバーに移します。15の顕微鏡フィールドを10倍の対物レンズ倍率で評価し、明確な縞模様があり、大きな介在物がない棒状細胞などの健康な筋細胞の割合を計算します。活動電位と細胞内カルシウムフラックスの同時記録を含む、ヒト心筋細胞の機能評価を実証するには、期待収率は約20%である必要があります。

まず、穴あきパッチ構成のパッチクランプ実験用のピペット溶液を調製します。次に、1.8ミリモルの塩化カルシウムをカルシウムを含まないtbに加えます。パッチクランプ蛍光実験中の心筋細胞の超融合にこの溶液を使用してください。

次に、1ミリリットルの細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移し、1リットルあたり10マイクロモルのインフルエンザフォートと10マイクロリットルの電力負荷を追加します。濃縮液を室温で30分間インキュベートし、水平にします。その後、チューブを垂直位置にセットし、セルを5分間落ち着かせます。

次に、上清をピペットで取り出し、細胞ペレットを結核を含むカルシウムに再懸濁します。細胞懸濁液のポイント25ミリリットルを、記録チャンバーに取り付けられた小さな温度制御顕微鏡に移します。重力によってスーパー融合し、37°Cで毎分0.3ミリリットルの流量で加熱されたマイクロフューアシステム

マイクロピペットプーラーを使用して、先端径が3〜5マイクロメートル、ps充填時の抵抗が3〜4.5メガオームのパッチクランプピペットを準備します。その後、PSにアムホテリシンBを1ミリリットルあたり250マイクログラムで添加し、電極を充填するために使用した後、電極をピペットホルダーに取り付けます。次に、明確な縞模様があり、介在物がないロン形のセルを選択します。

ギガシールを形成し、アクセス抵抗が20オームを下回るまで5〜10分待ちます。続いて、電流クランプモードで、異なる刺激周波数の短いパルスを使用して活動電位を引き出します。記録フェーズでは、492ナノメートルの明視野照明をオンにし、505〜520ナノメートルの蛍光を検出してください。

次に、蛍光および膜電位シグナルを取得します。この図は、HCMサンプルからの心室心筋細胞の活動電位の変化を示しています。これは、制御筋細胞とHCM筋細胞から0.2ヘルツ、0.5ヘルツ、および1ヘルツで誘発される代表的な重ね合わせ活動電位です。

対照筋細胞からの0.5ヘルツでの重ね合わせ活動電位。10〜7モルのイソプロテレノールの不在と存在下で示され、これはHCM患者からの心筋細胞の膜電位の代表的な痕跡であり、脱分極の早い段階でいくつかの自発的な脱分極を示しました。この図は、HCMサンプルからの心室心筋細胞におけるカルシウム一過性の変化を示しています。

以下は、対照筋細胞およびHCM細胞のパッチピペットを介して0.2ヘルツの刺激中に誘発される代表的な重ね合わせカルシウム一過性です。HCMと制御心筋細胞におけるカルシウム過渡現象の異なる時間における動態が示されており、ここでは、3つの異なる周波数での刺激中に細胞内カルシウムを示す代表的な長いトレースが示されており、HCM筋細胞の高ペーシング速度で拡張期カルシウムが増加していることが強調されています。この図は、ヒト心室筋細胞を用いた追加の実験的応用を示しています。

左に異なる膜電圧で記録されたL型カルシウム電流を示す代表的な重ね合わせトレースを、右側に異なる膜電圧でHCM試料から単離された18個の細胞からの平均L型カルシウム電流ピーク密度を示し、ここに示したのは、1ヘルツの電界刺激中に心室筋細胞から記録された細胞内カルシウムトレースである。この手順を試行している間は、手術室から検体を採取した直後に手順を開始することを忘れないでください ses この手順に従って人間の心室心筋細胞を分離します。他の方法は、ライフスタイル共焦点顕微鏡法や免疫化学法のように実行することができ、これは、例えば、膜構造およびカルシウム放出ユニットの細胞内局在が心疾患においてどのように変化するかなどの基本的な質問に答えるために重要になりますその開発後。

この技術は、心室心筋細胞の機能異常を研究し、新しい治療オプションの潜在的な有用性をテストするための細胞心臓病学への道を開きました。このビデオを見れば、ヒト検体から生存可能な単一心筋細胞を単離する方法や、さまざまな条件下で細胞機能を特徴づける方法についてよく理解できるはずです。