Name: 離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: 学ぶ新鮮な外科試料からヒト心室心筋細胞を分離する方法。酵素消化とカスタム装置を用いて生存細胞を得て、電気生理学的記録と細胞内カルシウム評価により機能変化を解析する技術です。

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この作品は、EU（STREPプロジェクト241577 &quot;大きな心、「第7回欧州フレームワークプログラムは、CP）、メナリーニ国際事業ルクセンブルク（AM）、テレソンGGP07133（CP）とギリアド·サイエンシズ（AM）によってサポートされていました。

（; 2009年5月リニューアル2006/0024713）、ヒトの組織についての実験プロトコルがCareggi大学病院の倫理委員会によって承認された。各患者は、書面によるインフォームドコンセントを与えた。 1。ソリューションと設備の準備溶液は、表1に記載されている。細胞単離手順の簡略化したフローチャートを図1に見出される。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2">ソリューション</td><td> CP </td><td> DB </td><td> KB </td><td> TB </td><td> PS </td><td> EB1 </td><td> EB2 </td></tr><tr><td rowspan="23">試薬（MM） </td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 50 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 硫酸マグネシウム</td><td> 8 </td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>アデノシン</td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 140 </td><td> 10 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td>マンニトール</td><td> 100 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td> 10 </td><td> 20 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 20 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td></td><td> 113 </td><td></td><td> 136 </td><td></td><td> 113 </td><td> 113 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td></td><td> 4.7 </td><td> 85 </td><td> 5.4 </td><td> 25 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> 塩化マグネシウム</td><td></td><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td></td><td> 0.6 </td><td> 30 </td><td></td><td></td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 </td><td></td><td> 0.6 </td><td></td><td></td><td></td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> 炭酸水素ナトリウム</td><td></td><td> 12 </td><td></td><td></td><td></td><td> 12 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KHCO 3 </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> BDM </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BHBA </td><td></td><td></td><td> 5 &lt;/ TD&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コハク酸</td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> K 2-ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クレアチン</td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> KMES </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 115 </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">酵素（U / ml）を</td><td>コラゲナーゼタイプV </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 250 &lt;/ TD&gt; <td> 250 </td></tr><tr><td>プロテアーゼタイプXXIV </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td></td></tr><tr><td> pHは</td><td></td><td> 7.4 KOH </td><td> 7.3のNaOH </td><td> 7.1 KOH </td><td> 7.35のNaOH </td><td> 7.2 KOH </td><td> 7.3のNaOH </td><td> 7.3のNaOH </td></tr></tbody></table> 。表1検体採取、細胞の単離と筋細胞の機能解析 、CP =心筋保護液のために使用される溶液 ; DB =解離緩衝液; KB =クラフト·Bruhe溶液; TB =タイロード緩衝液; PS =ピペット溶液; EB1 =酵素緩衝液1; EB2 =酵素緩衝液2。 <ol><li>心臓麻痺（CP）溶液を調製する。 CP溶液を1週間まで4℃で保存することができる。 </li><li>のCa 2 +を含まない解離緩衝液（DB）を準備します。このソリューションでは、一日の中で使用する必要があります。 </li><li>クラフト·Bruhe（KB）の溶液を調製する。 KB溶液を最大1ほんの4℃で保存することができるK。 </li><li>のCa 2 +を含まないタイロード緩衝液（TB）を準備します。このソリューションでは、一日の中で使用する必要があります。 </li><li>使用前にシリンジフィルターを使用して、すべてのソリューションをフィルタリングします。 </li><li>消化装置（ 図2）、電動モータによって回転一方がシリコーンエラストマーの対向する2ブラシからなる掻き容器を準備する。消化器がカスタムメイドなのです。消化装置の詳細については、 図8であり;デバイスのイメージを図2 Cと2Dである。 70％エタノールと水で組織チャンバーを洗浄します。 </li></ol>心筋のサンプル2。収集および処理<ol><li> 50ミリリットルチューブにcardiplegic（CP）の溶液40ミリリットルを注ぎ、それが細胞単離研究室に手術室から検体の輸送のための氷の中に保管してください。 </li><li>氷冷で洗って、すぐに切除した後に手術室から心室の心筋標本を収集CP液やチューブに保管します。心臓切開手術中に上部の間の心室中隔から切り出し心内膜標本、重み&gt; 100ミリグラムを使用してください。 </li><li>急速に研究室エリアに試料を移す。切除標本から10分以内に検体処理を開始します。 </li><li>氷冷CPバッファ内の試験片を保持しながら、慎重に実体顕微鏡下で微細なハサミを使用して心内膜線維化層を除去する。その後、小片（2-3 mmの長さ）の心筋組織をカット。組織試料の大きさに応じて、それぞれの単離のために100ミリグラムおよび1gの間の心室筋の総量を削減する。 </li><li>組織ミンチが完了すると、きれいな氷冷CP溶液を、消化装置に心筋チャンクを転送する。全組織のわずか1グラムを使用して、心筋のチャンクで2つのシリコンブラシ（3-4 ml）の間の全体のボリュームをいっぱいにならないよう。 </li></ol>心筋チャンクの3。洗浄し、消化<ol><li>アフト小胞体のチャンクを冷性Ca 2 +を含まない解離緩衝液（DB）でチャンバ内のCPバッファを変更し、消化装置の掻き取り室に移す。 </li><li>浴中で加熱された水（ 図1）と接触するようにするためには、チャンバ、恒温槽内の消化装置を配置する。 37.5℃までバスを設定し、徐々に組織室内の温度を上昇させるために、電源を入れます。 1革命/秒に回転速度を設定し、消化器のモーターの電源をオンにします。 </li><li>すべての8分きれいなDBにチャンバー内の溶液を変え、DBで3回の洗浄サイクルを実行します。 DBは、（37℃）まで温め、酸素が心筋の塊と接触して取得する前に飽和している。 </li><li> DB溶液にコラゲナーゼタイプVと4 U / mlのプロテ​​アーゼタイプXXIVの250 U / mlのを追加して、酵素緩衝液1（EB1）を準備します。 DB溶液に250 U / mlのコラゲナーゼタイプVを追加することにより、酵素緩衝液2（EB2）を準備します。ウォームアップ（37℃）とoxygenatEのEB1とEB2。 </li><li> （37℃）100パーセント酸素化EB1と回転の消化器内消化の2 12分のサイクルを実行します。各サイクルで、EB1の〜3ミリリットルを使用しています。ピペット吸引によって溶液を除去し、各サイクルの後に、それを捨てる。 </li><li>細胞回収と〜バッファを溶出させるための冷却（4℃）KB液80ミリリットルのために6 15ミリリットルのチューブを準備します。 </li><li> 37℃で3ミリリットル100パーセントの酸素化EB2で最初の15分の消化サイクルを実行蒸解サイクルの後、15mlチューブ内の最初の解離筋細胞を含む溶液を収集し、12ミリリットルの冷KB溶液と細胞懸濁液を希釈する。室温でフラットチューブに保管してください。 </li><li>次の消化サイクルのコラゲナーゼVの濃度を半分にするために、DB等量の残りEB2溶液を希釈する。 </li><li> 37℃で3ミリリットルEB2と他の5〜12分間消化サイクルを実行する;それらの各した後、15 mlコニカルチューブに緩衝液を含む筋細胞の収集および12ミリリットルキロバイト溶液で希釈する。 30分間室温で6セル​​を含むチューブに保管してください。 </li></ol> 4。細胞再懸濁およびCa 2 +の再適応<ol><li> + -遊離Ca 2 20mlに1 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）を追加するタイロードバッファー（TB）。溶液を濾過。 </li><li>遠心沈降筋細胞を強制的に5分間、100×gでコニカルチューブを含む6筋細胞は上清を除去し、可変量を各チューブ内の細胞を再懸濁（1-3 mlの収量に応じて）室温でのTBを含む、BSAの。 </li><li>徐々に100ミリモル/ LのCaCl 2溶液の少量ずつを追加することにより、緩衝液を含む細胞内のCa 2 +濃度を増加させる。第一及び第二のステップにおけるCa 2 +濃度は、それぞれ、50マイクロモル/ Lおよび100マイクロモル/ Lまで上昇させる。以下のCa 2 +の添加工程は、5分ごとに実行され、濃度が各ステップtで100マイクロモル/ Lで上昇させる0.9ミリモル/ LのOA最終濃度</li><li>単離法の収率を評価する。顕微鏡のガラスボトム室に筋細胞を含む溶液0.5mlを移す。 10倍の客観的な倍率で15顕微鏡視野を評価し、健康的な筋細胞の割合（クリア条線と有意な介在物など棒状の細胞、 図2）を計算します。期待利回りは約20％である。 </li></ol>絶縁型心筋細胞の5。機能評価。 次のプロトコルは、活動電位と細胞内Ca 2 +フラックスの同時録画を含むヒト心筋細胞機能評価の一例です。 <ol><li>穿孔パッチ構成のパッチクランプ実験のためのピペット溶液（PS）を準備します。溶液を最長3ヶ月間-20℃で保存することができる。 </li><li>のCa 2 +を含まないタイロード緩衝液（TB）に1.8モル/ Lの塩化カルシウムを追加します。 USEパッチクランプ/蛍光実験中の心筋細胞の灌流のためにこのソリューションを提供します。 </li><li> 1.5mlチューブへの転送細胞懸濁液の1ミリリットルをし、10マイクロモル/ LのFluoforteと10μlのPowerload濃縮物を追加します。室温で30分間インキュベートする。その後、垂直位置にチューブをセットし、5分間沈降細胞を残す。結核を含む内Ca 2 +の細胞を懸濁します。 </li><li> （37±0.5°Cの温度）小（0.5ml）中に細胞懸濁液0.25mlのを転送し、温度制御された顕微鏡は、0.3ml /分の流速で加熱さmicroperfusorシステムと重力によって灌流記録チャンバを、取り付けられている。 </li><li>マイクロピペットプラーを使用して、3〜5ミクロンの先端径とPSで満たされた3 M 4.5の抵抗でパッチクランプピペットを準備します。 </li><li> PS（250μg/ ml）をバッチにアムホテリシンBを追加し、電極を埋めるために使用します。 </li><li> FO、介在物のない、明確な条線を細胞に棒状を選択GIGAシールをRmとアクセス抵抗が20MΩを下回るまで、5か​​ら10分待ってください。 </li><li>刺激の異なる周波数（0.2 Hzで、0.5と1Hz、各周波数で1分）での短パルス（&lt;3ミリ秒）を使用して、電流クランプモードでの活動電位を誘発する。記録フェーズでは、492±3 nmで明視野照明をオンにして505から520 nmでFluoforteの蛍光を検出する。 Digidata 1440AとPCLAMPの10.0ソフトウェアを使用して蛍光および膜電位信号を取得。必要に応じて記録シーケンスを複数回繰り返します。しかし、各セルの15分以下の記録時間を保つ。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

私たちは、説明され、人間の心室の心筋の外科サンプルから実行可能な筋細胞を単離するための方法を検証しています。首尾よく心房外科試料から単離した細胞に使用されていた以前に記載されたプロトコルから始めて、病気の心室の心筋から単一の実行可能な筋細胞の分離を可能にする技術が開発され、微調整した。初期の報告では、冠灌流を介してバッファを含む酵素の配信が遅延整流を損なわなかったのに対し、心房および心室組織の塊から単一心筋細胞の単離は、選択的、生理的刺激8,24に変更された電気生理学的特性および応答で、その結果、カリウム電流を再分極減損ことを示した分離株の細胞25の電流。残念ながら、心室心筋の手術標本からのヒト心室筋細胞の単離は、冠状動脈枝の整合以来冠灌流によって実行することはできません外植心と分散で、失われます。本手法を用いて、心筋のチャンクから分離した心筋細胞は、ペーシング周波数の変化に応じて、活動電位持続時間の明確な適応を表示したり、アドレナリン刺激をβに。そのような応答が発生するためには、遅延整流カリウムチャネルの完全性は、これらのチャネルの全体的な完全性は、我々の分離法によって損なわれない示唆し<s...

心筋の電気生理学的特性の解剖は、単一の心筋細胞を単離するための技術の開発の後に顕著に進んでいる。心臓の興奮収縮連関（ECカップリング）の理解における最近の進歩はまた、完全な組織の全ての生理学的特性を保持している実行可能な単一の心筋細胞を単離する能力によって可能になってきた。パッチクランプ法は日常的機能および心臓筋細胞膜のイオン電流の薬理学的調節を研究するために使用される。のCa 2 +感受性色素と細胞内カルシウム動態の記録はまた、定期的に、ECカップリングの生理学上だけでなく、細胞内Ca 2 +の病理学的変化に重要なデータを提供し、健康で病気の様々なモデルから単一の心筋細胞上で実行される機械的な障害や心疾患増加催不整脈の負担につながる恒常性。情これらの研究からのTiONは、臨床現場における薬物の電気生理学的および機械的な影響を理解するために重要です。しかし、貫通電流および心臓の活動電位と心臓力学の特定の機能を占め、ECカップリングタンパク質における種特異的な違いがあります。非ヒト哺乳動物から単離した筋細胞の研究は、生物物理学的特性および特定の膜貫通イオンチャネルおよびEC結合タンパク質の生理的役割を解明しつつ、それらは必ずしも人間の心筋細胞の関連のモデルを提供していません。人間の心筋からの実行可能な筋細胞の単離は、完全に心疾患の病態生理を理解し、新たな治療アプローチを検証することが不可欠である。 心耳は、多くの場合、外科的手技中に破棄されたように、ヒト心房組織は、容易に入手可能である。成人の心臓の活動電位とイオンのCuの初期定量的研究rrentsを酵素的に孤立性心房細胞の1-4を採用。活動電位または単離された成人の心室細胞からの電流の記録は、その後3,5-10を報告されている。これらの研究のほとんどは、外植された心臓から得られた細胞を使用し、単離された細胞を得るためにコラゲナーゼ冠動脈セグメントまたは切除組織の比較的大量の暴露のコラゲナーゼ灌流のいずれかを利用している。これらの研究は、健康な心からの人間の心室心筋細胞からターミナル心不全患者からの膜貫通イオン電流の数の詳細な特性を可能にした。 L型の録音は、Ca 2 +電流（I CA-L）を 5-7、一過性外向きカリウム電流（I） は 8は 、整流カリウム内向き電流（私はκ1）8、遅延整流カリウム電流のさまざまなコンポーネントは、（私はκ 9）が報告されている。の進歩と精製単離手順10は 、脱分極12期および拡張期脱分極および早期のビートにつながる面白い、現在13に増加した後に遅れて活動電位延長11を含む、ターミナル心不全で増加催不整脈性のイオン根拠の明確な特性評価を可能にした。 アダルト心筋細胞は通常、様々な酵素混合物で心臓全体のCa 2 +トレラント細胞14を高収率で生産する技術の逆行性灌流によって小さな動物から単離される。組織の断片からの心筋細胞の単離は、冠状動脈の灌流によって達成されるものと比較しているため、個々の筋細胞への酵素の限られたアクセス、おそらく本質的にあまり成功しています。なぜなら、未使用のドナー心臓の非常に限られた入手可能性、定期的に正常なヒト心室細胞を得るための唯一の実用的な方法は、酵素digestioである待機的外科手術中に切除しばしば非常に小さな組織フラグメントのN。徹底的に細胞レベルで特徴付けられている唯一のヒト疾患モデルでは、移植された心臓へのアクセスのために、端末心不全である。しかし、端末の心不全は、少数の患者が発生し、多くの場合、根本的な原因15は比較的独立している心筋細胞の深刻な改造の共通の経路を伴う。疾患の初期非失敗の段階で患者からの単一心筋細胞の機能を評価する能力は、異なる遺伝性または後天条件の具体的な病態生理を理解することが重要です。肥大型心筋症（HCM）は語っ例です。 HCMは、流出路閉塞および拡張機能障害16による催不整脈リスクと収縮の変化を一般的な（1/500個体）心肥大が特徴継承心臓状態、増加している。 HCMの心臓から心筋細胞Uセル構造の変化（肥大、筋原線維混乱）とEC-カップリング17を含む複雑なリモデリング過程をndergo。しかし、HCMでの筋細胞機能障害のほとんどの情報は、トランスジェニック動物モデルから来ている。 HCM患者のごく少数が端末心不全に向かって進化し、心臓移植を必要とするため、HCMの心は非常にまれに、標準的な方法を用いた細胞単離のために使用できません。しかし、HCM患者の少なくとも30％が、収縮期（HCM）18中に流出路の血流を変化させる大規模な中隔肥大に起因する閉塞症状を発症する。 HCMにおける障害物の救済のための最も効果的な利用可能な治療の選択肢は、手術中隔の心筋切除術である：この外科手術中、上側の中隔の可変サイズの部分は、トランス大動脈アプローチによって除去される。肥大した中隔のこの部分は、新鮮な組織からの細胞を単離するための、したがって提供されています。 人間ventriculaの単離のための方法Rシングル、小型の経静脈心内膜心筋生検標本からの筋細胞は、以前に開発され、19を公表されている。私たちは、中隔心筋切除術および弁置換処置を受けた患者を受けHCMの患者を含む心臓手術を、受けている患者からの心室の心筋サンプルから単中隔の筋細胞を単離するための方法を実施しました。単離プロトコールの詳細な説明に加えて、代表的な電気生理学的およびCa 2 +の蛍光測定は、単離されたヒト心室筋細胞の生存率およびパッチクランプ及び細胞内Ca 2 +の研究の実現可能性を実証し、提示される。

<table><tbody><tr><td>リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p9791?lang=it&amp;region=IT">P9791 </a></td><td></td></tr><tr><td>Mg sulfate heptahydrate（MgSO4*7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m1880?lang=it&amp;region=IT">M1880 </a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it&amp;region=IT">H3375 </a></td><td></td></tr><tr><td>アデノシン</td><td>・シグマ・アルドリッチ</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9251?lang=it&amp;region=IT">A9251 </a></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8270?lang=it&amp;region=IT">G8270 </a></td><td></td></tr><tr><td>マンニトール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it&amp;region=IT">M4125 </a></td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it&amp;region=IT">S7653</a></td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it&amp;region=IT">P9333 </a></td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7907?lang=it&amp;region=IT">S7907 </a></td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s6297?lang=it&amp;region=IT">S6297 </a></td><td></td></tr><tr><td>重炭酸カリウム (KHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/237205?lang=it&amp;region=IT">237205</a></td><td></td></tr>ピル<tr><td>ビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2256?lang=it&amp;region=IT">P2256 </a></td><td></td></tr><tr><td>2,3-ブタンジオン一基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b0753?lang=it&amp;region=IT">B0753 </a></td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it&amp;region=IT">S8045 </a></td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸一カリウム塩一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/49601?lang=it&amp;region=IT">49601</a></td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/107360?lang=it&amp;region=IT">107360</a></td><td></td></tr><tr><td>3-ヒドロキシ酪酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/166898?lang=it&amp;region=IT">166898</a></td><td></td></tr><tr><td>アデノシン5&prime;-三リン酸二カリウム塩二水和物 (K2-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it&amp;region=IT">A8937</a></td><td></td></tr><tr><td>クレアチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0780?lang=it&amp;region=IT">C0780 </a></td><td></td></tr><tr><td>コハク酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s3674?lang=it&amp;region=IT">S3674 </a></td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&prime;,N&prime;-四酢酸(EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e0396?lang=it&amp;region=IT">E0396 </a></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清からのアルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a0281?lang=it&amp;region=IT">A0281</a></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8266?lang=it&amp;region=IT">M8266 </a></td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum, Type V</td><td>Sigma-Aldrich</td>からのコラゲナーゼ<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9263?lang=it&amp;region=IT">C9263 </a></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase, Bacterial, Type XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム溶液, ~1 M in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/21115?lang=it&amp;region=IT">21115</a></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム0.1 M溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/53704?lang=it&amp;region=IT">53704</a></td><td></td></tr>メ<tr><td>タンスルホン酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/83000?lang=it&amp;region=IT">83000</a></td><td></td></tr><tr><td>FluoForte 試薬</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-52015</td><td></td></tr><tr><td>Powerload concentrate, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>P10020</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Fast-Step System</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-77SP</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B 可溶化</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9528?lang=it&amp;region=IT">A9528 </a></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B パッチクランプアンプ</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0&nbsp;</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消化装置</td><td>カスタム</td><td>カスタム</td><td>この装置は、プラスチックチューブ、キャストシルガード、モーターを使用して当研究室でカスタムメイドされたもので、図1C-1Dと図7に詳細に説明されています。ご要望があれば、詳細をお知らせいたします。</td></tr><tr><td>消化装置のブラシ用シリコーンエラストマー</td><td>ダウ・コーニング・</td><td>シルガード&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>消化装置用可変速回転モーター</td><td>Crouzet</td><td>Crouzet 178-4765</td><td></td></tr><tr><td>ブラシ鋳造用モールド</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>金型は、標準的なPTFE直径2.5cmのロッドからカスタムメイドされています。</td></tr></tbody></table>

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

疾患のある心臓の心筋細胞は、細胞構造、励起収縮連関および膜イオン電流の変化を伴う複雑なリモデリングプロセスに供される。これらの変更は増加催不整脈リスクと心臓病患者における収縮期および拡張機能障害につながる収縮の変化の原因であると思われる。しかし、心疾患における心筋細胞機能の変化は上のほとんどの情報は、動物モデルから来ている。 ここでは、説明し、心臓手術操作を受けている患者からの心室の心筋の小さな外科的サンプルから実行可能な筋細胞を単離するためのプロトコルを検証する。プロトコルが詳細に記載されている。電気生理学的および細胞内カルシウムの測定は、この方法で得られたヒト心室心筋細胞における単一細胞の測定数の実現可能性を実証することが報告されている。 プロトコルは、彼を報告した再様々な心臓疾患の存在下で、人間の心臓の機能的変化の細胞および分子基盤の将来の調査のために役立ちます。また、この方法は、細胞レベルで新規な治療標的を同定するために、ダイレクト並進値と、ヒト心筋細胞に新規化合物の有効性を試験するために使用することができる。

非障害の非肥大手術患者21と比較して、上述の方法は、心筋切除術の手術を受けた肥大型心筋症（HCM）を有する患者の心室中隔から単離された心筋細胞の機能異常を特徴づけるために用いた。このセクションに含まれている結果は、ワーク21から誘導され、この技術は、心臓の疾患状態における心筋細胞機能の変化を特徴付けるために使用することができる方法の例として示されている。 HCMを有する患者からの代表的な外科的試料は、 図2Aに示されている。外科的試料は、心内膜線維ストリークの大きさおよび厚さの点で非常に可変であった。我々はHCMサンプルから各単離操作に使用する心筋組織の量は1グラムぐらいでした。その代わりに、対照サンプルに使用組織の量は、（100〜500ミリグラム。）小さかった、ロウによるR組織の可用性。対照試料は、組織内の生存可能な心筋細胞の相対量はHCM心筋において減少し、心内膜心筋線維症が22に増加するためか、HCMに対して処理した場合に収率が有意に高かった。これらの観​​察結果から、我々は...

心疾患の細胞に基づく現在の知識は、ほとんどの動物モデルの研究に依存しています。ここでは、説明し、人間の心室心筋の小さな外科的サンプルから単実行可能な心筋細胞を得るための新しい方法を検証する。ヒト心室筋細胞は、電気生理学的研究および薬物試験のために使用することができる。

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

本手順の全般的な目的は、疾患を有するヒト心室標本から生存可能な心筋細胞を単離し、その機能的な変化を特性解析することである。これは、まず、組織の過度な分解および細胞損傷を避けるため、氷冷した心停止液中で新鮮な心室検体を迅速に回収し、細切することによって達成される。第二のステップでは、自作の消化装置と酵素溶液を用いて、心筋塊の段階的な消化を行う。6回のサイクルにおいて、各サイクルでバッファーを含む細胞をチューブに回収し、細胞保存液で希釈します。最終ステップでは、機能特性評価を行うため、6本のチューブに含まれる細胞を、正常なカルシウム濃度を持つ標準的な生理学的溶液のより少量の容量で再懸濁します。最終的に、活動電位のパッチクランプ記録と蛍光色素を用いた細胞間カルシウムの同時評価を行い、肥大型心筋症患者の心筋細胞における活動電位、電位持続時間、および細胞内カルシウムサイクルの変化を示します。標準的なチャンク除去法などの手法と比較した際のDYS法の主な利点は、酵素溶液とともに特注の消化装置を使用することで、シリコンスクレイパーにより様々な細胞の同時解離が可能になる点です。この手法は、心疾患に伴う既知の分子および構造的リモデリングが、個々の心筋細胞の変動にどのように反映されるかという、循環器内科領域における重要な疑問への回答に寄与します。これらの変動は本手法で解析可能であり、特定の薬剤による標的治療の対象となります。したがって、本技術の応用範囲は、肥大型心筋症などの遺伝性心疾患の治療にまで及びます。実際、この手法は、心臓手術を受けた肥大型または虚血性心疾患患者の心室心筋細胞を用いて、新しい神経病理学的アプローチを検証するために利用可能です。私たちは、心臓手術中に採取されたヒト動脈標本と心室生検試料の類似性を比較した際に、まずこの手法を考案しました。本手順を開始するには、50 mLチューブに40 mLの心停止液を注ぎ、手術室から細胞分離室まで標本を輸送する間、氷上で保存してください。標本を速やかにラボエリアに搬送し、標本採取から10分以内に標本処理を開始してください。手術室にて切除直後の心室心筋検体を回収します。氷冷したCP溶液で洗浄し、検体を氷冷CPバッファーに浸した状態でチューブに保存します。その後、細い鋏を用いて心内膜の線維化層を慎重に除去します。心筋組織を2〜3 mmの小さな断片に切り分けます。1回の単離に使用する心室心筋の総量は100 mgから1 gとします。組織片を消化装置のスクレイピングチャンバーに移した後、チャンバー内のCPバッファーを冷たいカルシウムフリー解離バッファーに交換します。その後、消化装置を恒温槽に入れます。バスを37.5 °Cに設定し、電源を入れます。次に、消化装置のモーターを始動させ、回転速度を毎秒1回転に設定します。DBで3回の洗浄サイクルを行い、8分ごとにチャンバー内の溶液を37 °Cの酸素飽和クリーンDBに交換します。その後、DB溶液に250 units/mLのコラゲナーゼtype fiveおよび4 units/mLのプロテアーゼtype 24を加え、酵素バッファー1を調製します。次に、250 units/mLのコラゲナーゼを加えて、酵素バッファー2を調製します。DBソリューション酸素化EB 1を5μL加え、37°Cまで温めます。次に、回転消化装置を用いて、37°Cで100%酸素化EB 1を3mL使用し、12分間の消化サイクルを2回行います。各サイクルの後、溶液をピペットで吸引して除去し、廃棄してください。次に、細胞回収用の15 mLチューブ6本と、バッファーを溶出するための4 °Cのクラフトビール溶液80 mLを準備し、EB2を酸素供給し37 °Cまで温めます。続いて、37 °Cで100%酸素供給されたEB2を3 mL用い、最初の15分間の消化サイクルを行います。消化サイクルの後、最初の遊離心筋細胞を含む溶液を15 mLチューブに回収し、細胞懸濁液を12 mLの冷KB溶液で希釈します。チューブを室温で水平に保管し、3 mLのEBを用いて12分間の消化サイクルをさらに5回、37 °Cで実施します。各サイクルの心細胞を含むバッファーを15 mLの円錐チューブに回収してください。また、各サイクルで回収した3 mLのバッファーに12 mLのKB溶液を加えて希釈することを忘れないでください。最後に、細胞を含む6本のチューブを室温で保管します。このステップでは、1 mg/mLのウシ血清アルブミンを20 mLのカルシウムフリーTyrode緩衝液に加えます。次に、この溶液をろ過し、心筋細胞を含む6本のコニカルチューブを100 ×gで5分間遠心分離します。心筋細胞を沈殿させた後、上清を除去し、各チューブの細胞を室温で適量のBSA含有TBで再懸濁します。第1および第2のステップでは、100 mMの塩化カルシウム溶液を少量ずつ添加し、細胞含有バッファー中のカルシウム濃度を徐々に上昇させます。カルシウム濃度をそれぞれ50 µMおよび100 µMまで上げます。その後のカルシウム添加ステップは5分ごとに行い、各ステップで濃度を100 µMずつ上昇させ、最終濃度0.9 mMまで到達させます。分離手順の収率を評価するため、心筋細胞を含む溶液0.5 mLを顕微鏡用ガラスボトムチャンバーに移します。10倍の対物レンズ倍率で15箇所の視野を評価し、明瞭な横紋があり、重大な封入体が認められない棒状の細胞などの、健康な心筋細胞の割合を算出します。活動電位と細胞内カルシウムフラックスの同時記録を含むヒト心筋細胞の機能評価を行うには、期待される収率は約20%である必要があります。まず、perforated patch構成でのパッチクランプ実験用のピペット溶液を調製します。次に、カルシウムフリーtbに1.8 millimolarの塩化カルシウムを加えます。この溶液を、パッチクランプ蛍光実験中の心筋細胞の灌流に使用します。次に、1 mLの細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µM/Lのflu fortと10 µLのpower loadを加えます。チューブを水平に置いた状態で、室温で30分間インキュベートします。その後、チューブを垂直に立て、5分間静置して細胞を沈殿させます。次に、上清をピペットで取り除き、細胞ペレットをカルシウム含有tbで再懸濁します。細胞懸濁液25 mLを、温度制御可能な顕微鏡搭載記録チャンバーに転送します。加熱マイクロ灌流システムを用い、37 °C、流速0.3 mL/minで重力灌流を行います。マイクロピペットプラーを用いて、先端径3〜5 µm、PS充填時の抵抗値3〜4.5 MΩのパッチクランプピペットを作製します。その後、PSに250 µg/mLのamphotericin Bを添加し、これを電極に充填して、電極をピペットホルダーに装着します。次に、明瞭な条線があり、封入体が認められない円錐形の細胞を選択します。ギガシールを形成し、アクセス抵抗が 20 ohm 以下に下がるまで 5〜10 分間待機します。その後、異なる刺激周波数の短パルスを用いて、カレントクランプモードで活動電位を誘発します。記録段階では、492 nanometers の明視野照明を点灯し、505〜520 nanometers で Fluor fort 蛍光を検出します。次に、蛍光信号と膜電位信号を取得します。この図は、HCMサンプルの心室心筋細胞における活動電位の変化を示しています。ここでは、コントロール群の心筋細胞およびHCM群の心筋細胞から得られた、0.2 hertz、0.5 hertz、および1 hertzで誘発された代表的な重ね合わせ活動電位を示します。コントロール心筋細胞における0.5 Hzでの重畳動作電位。isoproterenol 10⁻⁷ M 非存在下および存在下での結果が示されている。また、こちらはHCM患者由来の心筋細胞の膜電位の代表的なトレースであり、複数の自発的な脱分極である早期後脱分極が認められる。図は、HCMサンプル由来の心室心筋細胞におけるカルシウム・トランジェントの変化を示している。ここでは、コントロール心筋細胞およびHCM細胞において、パッチピペットを介した0.2 Hzの刺激で誘発された代表的なカルシウムトランジェントの重ね合わせを示します。HCMおよびコントロール心筋細胞における異なる時点でのカルシウムトランジェントのキネティクスが示されており、ここでは3つの異なる周波数での刺激中の細胞内カルシウムを示す代表的な長時間トレースを提示しています。これにより、HCM心筋細胞において高頻度のペーシング時に拡張期カルシウムが増加することが強調されています。この図は、ヒト心室心筋細胞を用いた追加の実験的応用を示しています。異なる膜電位で記録されたL型カルシウム電流の代表的な重ね合わせ波形を左に、HCMサンプルから単離した18個の細胞における異なる膜電位でのL型カルシウム電流ピーク密度の平均値を右に示します。また、1 Hzの電界刺激中に心室筋細胞から記録された細胞内カルシウム波形をここに示します。この手順を行う際は、サンプルの新鮮さを確保するため、手術室から検体を回収した後、速やかに手順を開始することが重要です。本手順に従ってヒト心室心筋細胞を単離します。ライフスタイル共焦点顕微鏡法や免疫化学的手法などの他の手法も実施可能であり、これらは、心疾患の発症後、膜構造やカルシウム放出部位の細胞内局在がどのように変化するかといった根本的な疑問に答えるために極めて重要となります。この手法は細胞心臓病学における道を切り開き、心室心筋細胞の機能的異常の研究や、新しい治療法の潜在的な有用性の検証を可能にしました。このビデオを視聴することで、ヒト試料から生存可能な単一心筋細胞を単離する方法と、さまざまな条件下で細胞機能を特性解析する方法について、十分に理解することができます。

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我々は、細胞内Caために使用することができ、ヒト心房筋細胞の単離を記載...

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

人間の心臓組織は、心筋再生のために適切であり得る多能血管周囲の前駆細胞集団を保有します。ここに記載された技術は、ネイティブの血管に関連する2つの多能ストローマ細胞集団の同時単離および精製を可能にする、すなわち CD146 + CD34 -周皮細胞およびCD34 + CD146 -外膜細胞、ヒト心筋から。...

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この記事では、催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞を分離するメソッドが提供されます。その特性とその脂肪細胞分化を促進するためのプロトコルを説明します。...

催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞の分離と性状

このプロトコルは、皮をむいた心筋細胞を用いた心機能の抽出および評価の技術を段階的に記述することを目的とする。この方法論は、マウスから男性まで、異なる心臓の場所から収集することができる小さな凍結生検を使用して、myofilament機能の測定および急性調節を可能にする。...

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

提示は、ビブラートメカット心筋切れスライスからヒトおよび動物心室心筋細胞を単離するためのプロトコルである。カルシウム耐性細胞の高収率(最大200細胞/mg)は、少量の組織(&lt;50mg)から得ることができます。このプロトコルは、最大36時間の冷たい虚血にさらされた心筋に適用可能です。...

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

前向き灌流法により、高品質のマウスの心臓細胞を単離するためのシンプルe...

マウスからの心筋細胞分離のための前向きの灌流法

マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。...

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

学ぶ新鮮な外科試料からヒト心室心筋細胞を分離する方法。酵素消化とカスタム装置を用いて生存細胞を得て、電気生理学的記録と細胞内カルシウム評価により機能変化を解析する技術です。

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

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