Name: CD133の患者由来の細胞培養および分離 +推定されるがん幹細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 学ぶ悪性黒色腫由来の患者細胞培養とMACSによるCD133陽性がん幹細胞分離法。赤血球と線維芽細胞を除去し高純度細胞集団を迅速に取得する技術です。

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作者はこの仕事をサポートし、批判的に原稿を読み取るための教授M. Dietelとディルク·シューマッハに感謝します。 これらの結果につながる研究は助成合意nは下革新的医薬品イニシアティブの共同事業からの支持を受けています°の115234は、リソースは、欧州連合（EU）の第7次フレームワークプログラム（FP7/2007-2013）とEFPIA会社の中から拠出金で構成されています現物出資。この作品はまた、ベルリンKrebsgesellschaft（BKG）によってサポートされていました。

初代培養細胞、線維芽細胞の枯渇とCD133の磁気細胞選別の腫瘍組織、特性評価からの主なシングル細胞の調製を含む実験の全体的なスキームは、+およびCD133 -メラノーマ細胞を図1に示します。 1。サンプル取得<ol><li>次のステップを検討する前に、倫理的な承認のために確認してください。 </li><li>手術やチームに上に1％ペニシリン - ストレプトマイシン最終濃度と手を補充滅菌PBSで50mlチューブを準備します。 </li><li> 4℃で手術から細胞培養ラボに腫瘍組織の迅速な輸送を整理</li></ol> 2。腫瘍組織から原発性黒色腫シングルセルを調製し<ol><li>無菌条件下でのすべての手順を実行します。 </li><li>腫瘍を切除する前に、1つは解離ミックスを準備する必要があります。 2〜4グラム組織当たり10ミリリットル解離ミックスが必要となります。ミックスはimmediaを使用することができますtelyまたは後で使用するために-20℃で10 mlのアリコートに格納されている。 <ol><li> 150mM塩化ナトリウムを含む溶液を調製します。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混ぜる。 0.22μmのフィルターを使用して、必要な滅菌ろ過液塩化ナトリウム溶液ます。 </li><li> DNase Iを秤量し、150mMの塩化ナトリウムで10 mg / mlのDNase Iを含む溶液を調製します。溶液が透明になるまで転倒混和する。 </li><li> PBS中で100mg/mlコラゲナーゼIVを含む溶液を調製します。溶液が透明になるまで転倒混和する。コラゲナーゼ溶液のアリコートは、数ヶ月のために-20℃で保存することができます。 </li><li>クアンタム263媒体で1 mg / mLのコラゲナーゼIVおよび0.1 mg / mlのDNase Iを、1％ペニシリン - ストレプトマイシンの最終濃度で解離ミックスを調製する。渦を使って混ぜる。オプション：1.5μg/ mlのアムホテリシンBの最終濃度に解離ミックスにスキンアドオンアムホテリシンB溶液由来メラノーマ組織を使用する場合</li></ol></li><li>プリ暖かいREQ37〜解離ミックス、PBSおよび量子263媒体のuired金額℃、 </li><li>滅菌シャーレに腫瘍組織を置きます。組織から過度の液を除き、500μlの解離·ミックスを追加します。新鮮な、滅菌外科用メスを使用して2〜4mmの小さな部分に腫瘍をミンチ。 </li><li>転送2〜4グラムは5ml解離ミックスを含むgentleMACS Cチューブに腫瘍組織のみじん切り。追加の4.5ミリリットル解離ミックスとペトリ皿をすすぎ、gentleMACS Cチューブに残った組織片を追加します。 </li><li> gentleMACS C管を閉じ、gentleMACSの解離のスリーブの上に逆さまに貼り付けてください。 gentleMACSプログラム &quot;h_tumor_01&quot;を実行します。 </li><li>解離からgentleMACS Cのチューブを外し、37℃で30分間、サンプルをインキュベート℃で落ち着いた組織片を再懸濁するために、5分毎に最高走行速度（12回転）にするか、手動でチューブを回してMACSmixチューブローテーターを用いた連続回転下。 </li><li>トンのスリーブの上に逆さまにgentleMACS C管を取り付け彼gentleMACS解離とgentleMACSプログラム &quot;h_tumor_02&quot;を実行してください。 </li><li>解離からgentleMACS Cのチューブを外し、37℃で30分間、サンプルをインキュベート℃で落ち着いた組織片を再懸濁するために、5分毎に最高走行速度（12回転）にするか、手動でチューブを回してMACSmixチューブローテーターを用いた連続回転下。 </li><li> gentleMACSの解離のスリーブの上に逆さまにgentleMACS C管を取り付け、gentleMACSプログラム &quot;h_tumor_03&quot;を実行してください。 </li><li>解離、再懸濁したサンプルからgentleMACS Cのチューブを外し、50 mlチューブに置か70μmのセルストレーナーに細胞懸濁液を適用します。フィルターの目詰まりが発生した場合、完全な懸濁液が駆け抜けまで、滅菌フィルター先端で細胞懸濁液をかき混ぜる。 </li><li> 5ミリリットルクアンタム263培地で細胞ストレーナーを洗浄します。 </li><li>オプション：あなたはまだ量子263媒体と種子、それらを適切な細胞培養DISでのフィルタ、再懸断片に残って組織片を持っている場合hである。 37℃および5％CO 2のフラグメントをインキュベートする。 </li><li>セルストレーナーを破棄し、消化細胞懸濁液を50 mlチューブを閉じます。 300 xgで5分間、細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てる。 </li><li>オプション：細胞ペレットによる赤血球の大量に赤く表示された場合は、蒸留水で10倍ソリューション1:10に希釈して500μlのPBSに再懸濁し、細胞ペレットを1X赤血球溶解液を調製し、5 mlの1X赤血球溶解を追加ソリューション。 10分間室温でボルテックス5秒間インキュベートする。 300 xgで5分間遠心し、上清を捨てる。 </li><li>クアンタム263およびシード適切な細胞培養フラスコ内の細胞と腫瘍細胞を再懸濁します。彼らは80％のコンフルエンスに到達し37℃、5％CO 2で、日常的に継代細胞での培養腫瘍細胞。 </li></ol> 3。初代培養細胞および線維芽細胞枯渇のキャラクタリゼーション<ol><li>表現型がmicroscoを使用して初代細胞培養を分析PE。 </li><li>初代細胞培養の少量（0.5×10 6細胞）を採取し、腫瘍-、メラノーマ、幹細胞と間質細胞マーカー遺伝子のプライマーを用いてRT-PCRを行った。分析するための最も重要な遺伝子は、CD90（線維芽細胞マーカー）、TYR（メラノーマ/メラニン細胞マーカー）、CD133（癌幹細胞マーカー）、CD83（成熟樹状細胞のマーカー）およびハウスキーピング遺伝子（ 例えば HPRTまたはGAPDH）です。 </li><li> RT-PCRの間の微視的分析およびCD90高発現は、線維芽細胞を使用して、プライマリメラノーマ文化の高い汚染が明らかになった場合は、ミルテニーからAnti-線維芽細胞のマイクロビーズとD列を使用した線維芽細胞を枯渇させる必要があります。 </li></ol> 4。磁気細胞はCD133 +およびCD133のソート- LS列を使用したメラノーマ細胞を<ol><li> PBS中2mMのEDTA、5％FCSを含むMACSバッファーを準備します。 0.22μmのSteritop-GPフィルターユニットを使用して反転し、無菌ろ過バッファによるミックス。 4から8℃〜チル·バッファ使用前とドガ。 </li><li>プリ暖かいAccutase、37〜PBSと量子263媒体℃、 </li><li> PBSで80％コンフルエントの細胞を洗浄します。 Accutaseの適切な量を追加し、細胞が培養面からデタッチするまでインキュベートする。クアンタム263培地を用いて50 mlチューブに細胞を回収する。 </li><li>細胞数を決定し、5分間細胞を必要な数（2×10 9細胞の最大数はLSカラムごとにロードすることができます。セルラインの特定の最適な数値が決定されるべきであるとかなり低くなる可能性がありますMiltenyi社のプロトコルによる。）遠心300 xgで4〜8℃上清を完全に吸引します。 </li><li> 350μlのMACSバッファーを用いて1×10 8個の細胞の最大値（より高い細胞数に応じて、以下のすべてのMACSバッファーをスケールアップ、FcRブロッキング試薬CD133/1-BiotinとAnti-Biotin MicroBeadsは、ボリューム用）に再懸濁します。 </li><li> 100μlのFcRブロッキング試薬を追加します。 </li><li> 50μlのCD133/1-Biotinを追加します。 4月8日に渦とインキュベートを使ってよく混ぜ°C Fまたは10分。 </li><li> 300 xgで4〜8℃で5分間、10ミリリットルのMACSバッファーおよび遠心分離機を追加することにより、細胞を洗浄上清を完全に吸引します。 </li><li>洗浄工程（4.8）を繰り返し</li><li> 400μlのMACSバッファーを用いて再懸濁した細胞ペレット。 </li><li> 100μlのAnti-Biotin MicroBeadsはを追加します。 15分のための4-8℃で渦とインキュベートを使用してよく混ぜる。 </li><li>一方、磁気分離におけるMACSセパレータを準備します。 MACSセパレーターマルチスタンドにQuadroMACSを取り付けます。 QuadroMACSの磁場中でのフロントへの列の翼を持つLS必須列の番号を挿入します。各カラムの下に各LSカラムおよび適切なコレクションチューブ（15 mlまたは50 ml）にプレセパレーションフィルター（30μmのナイロンメッシュ付き）を配置します。 3ミリリットルのMACSバッファーでリンスすることにより、フィルタとカラムを準備します。フロースルーを捨てる。 </li><li> 300 xgで4〜8℃で5分間、10ミリリットルのMACSバッファーおよび遠心分離機を追加することにより、細胞を洗浄上清を完全に吸引します。 </li><li> 500μlの細胞を再懸濁MACSはバッファとプレセパレーションフィルターを持つLSカラムに細胞懸濁液を適用します。 </li><li>列ごとに3ミリリットルのMACSバッファーで3回洗浄する。カラムリザーバが空であるときにのみ、新しいバッファを追加します。 </li><li>細胞分画-収集された合計の流出物は、非標識CD133が含まれています。 </li><li>プレセパレーションフィルターを捨てて、セパレーターから列を削除し、適切な収集チューブの上に置きます。 </li><li> 5ミリリットルMACSバッファーを適用します。すぐにしっかりと列にプランジャーを押すことにより、標識されたCD133 +細胞を洗い流す。 </li><li>陰性分画の純度を高めるために、QuadroMACSに挿入された新しい平衡化したLSカラムに細胞懸濁液を適用します。分数-排水はCD133が含まれています。 </li><li>列を破棄します。 </li></ol>

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著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

腫瘍細胞ペレットから赤血球汚染を除去するために、我々は非常にミルテニーから赤血球細胞溶解液の使用をお勧めします。伝統的なフィコール密度勾配遠心分離の上赤血球を溶解することの利点は、それがより速く、より簡単であることです。さらに、フィコールまたは赤血球細胞と腫瘍細胞の喪失と汚染が回避されます。長すぎる待っているとき、彼らは通常、腫瘍細胞がはびこるので、あなたが初代細胞培養における線維芽細胞の成長を観察するとき、彼らはすぐに削除されるべきである。 ミルテニーのMACS技術を用いて細胞をソートするときに我々は、酵素的に細胞を収穫お勧めします。セルスクレーパーを使用すると、細胞とその表面エピトープに穏やかかもしれませんが、MACSカラムに非特異的に結合し、カラムを詰まらせる細胞断片をも生み出すだろう。従来のトリプシン/ EDTA処理上Accutaseの利点が減少し細胞ストレス、LEAを含める改善された生存率および細胞培養物に外来性物質を導入するリスクを最小化する鼎。 Accutaseの準備は、任意の哺乳動物又は組換え細菌タンパク質28が含まれてい...

皮膚の悪性黒色腫は皮膚癌の最も一般的でない、まだ最も致命的なタイプです。増加率、死亡の1,2に関連悪性皮膚腫瘍の75％は悪性腫瘍であり、急速な普及のハイグレード、今やメラノーマアカウントが原因。原発腫瘍の外科的切除、化学療法、放射線療法、免疫療法と組み合わせた化学療法と転移性黒色腫の免疫療法に加えメラノーマ治療3,4の最先端の戦略があります。しかし、悪性黒色腫は化学療法への反応が不良（5-12％）、5,6、およびのみvemurafenib 7〜による治療などの新しい標的治療に有望からBRAF V600E遺伝子変異の利益を運ぶメラノーマ患者のものと50から70パーセントによって特徴付けられる全生存期間を改善し、メラノーマ腫瘍形成のメカニズムのより良い理解が必要である。 過去には、十分に確立された商業でそれらのメカニズムを研究するために、cially可能な細胞株を用いた。がんの発生と進行の分子事象を研究するための、より最近のアプローチは、腫瘍組織に直接由来初代培養活用 - 戦略ベアリングマニホールドの利点を：研究者は、患者と組織選択の完全なコントロールを持っています。サンプリングされた細胞は巧妙に選ば腫瘍組織から得られた、そのすべての異質性腫瘍に似ているとフォローアップの患者のデータと詳細な病理学は、文化の特性は元の腫瘍8のものと比較することを許容するために利用可能です。 これとは対照的に、がん研究における関連モデルシステムとして確立された細胞株の使用は論争議論されている。すでに1987年にオズボーンらは異なる研究室9からMCF-7ヒト乳癌細胞株の間に有意な生物学的な違いについて説明しました。継代中のRNA発現のこの大規模なゲノム不安定性とバリエーションが共同であったHiorns らによるnfirmed。および細胞株は、それによってヒト癌10のモデルのような確立された文化の直接の関連性を弱める、文化の中で進化しないという証拠のための支援データを提供した。 大部分は長年にわたって無視されてきたもう一つの重要な考慮事項は、最初の細胞株の多数がHeLaによって汚染されたことを実証することによって、20年以上前に強調表示されていた無関係の &#39;false&#39;細胞と培養液の汚染や増殖のリスクである細胞8,11。 &#39;false&#39;の細胞株からのデータの誤った解釈は、最近になって再び文学で明るみになってきた。 DNAプロファイリングと分子細胞遺伝学の組み合わせを使用して、マクラウドらは 252の新しい腫瘍由来のヒト細胞株の、微生物や培養細胞（DSMZ）のドイツCollectionに寄託ほぼ18％が種内であることが判明したまたはクロス種差ことを明らかにした·汚染物質12,13。これらの問題を回避するためと、上記の利点を活用するために、我々は新たに摘出転移からの低通路メラノーマ細胞株を樹立することを決めた。 強固な細胞分離·解析技術は、同時に特徴的な表面のタンパク質の細胞死と破壊を制限しながら、単一セルの準備が生成する必要があります。単細胞懸濁液中に組織の解離のための自動化されたベンチトップ測定器は、ミルテニー製gentleMACSの解離です。抗原エピトープを維持し、セル損失を低減しつつ、gentleMACS Cチューブ、最適化された解離ソリューションと組み合わせて使用​​すると、クローズドシステム内の腫瘍組織の効果的かつ穏やかな解離が達成される。楽器は、特定のアプリケーションや保証で即時メラノーマ組織14から単細胞懸濁液の標準製剤の様々な最適化され、あらかじめ設定されたプログラムを提供しています。 &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;最近の報告では、腫瘍の大部分が専ら腫瘍の開始と自己再生能力発揮いわゆる癌幹細胞（CSCが）の小集団を抱いていることを明らかにした。皮膚の真皮にメラノサイト産生幹細胞の同定はUVA放射への曝露が悪性形質転換15のためにこれらの細胞を準備することができるので、これらの細胞がメラノーマにおける癌幹細胞（CSCが）の原点かもしれないという仮説につながった。このような遺伝的病変の結果は、腫瘍と幹細胞の特性の組み合わせを抱い細胞であろう。 メラノーマでCSCの亜集団を表現するために提案された重要なマーカーの一つは、CD133の16から20です。 CD133（またプロミニン1とも呼ばれます）、pentaspan膜貫通糖タンパク質のメンバーは、造血幹細胞、内皮前駆細胞、ニューロンおよびグリア幹細胞21から23で表されます。 CD133の発現と相関している非対称細胞分裂24、CD133のグリコシル化エピトープが細胞分化25時にダウンレギュレートすることが示された。最近では、CD133 +メラノーマ細胞は自己複製および腫瘍イニシエーション容量19,20を有することが示された。 細胞- CD133の機能+推定メラノーマCSCを勉強するために、我々は、CD133 +およびCD133の高濃縮および生存個体を得るためにミルテニーバイオテクから磁気活性化細胞選別（MACS）システムを変更し、最適化しました。 Matheu らによって示されているように磁気ビーズベースの細胞分離はどちら負の選択が可能になります26、または正の選択我々がここで示しているよう。正の選択中に特定の標的細胞型、 例えば CD133発現する細胞は、磁気に対して非常に特異的な抗体に結合しているMicroBeadsは、50 nmの超常磁性粒子で標識されている特定の細胞表面抗原。非標識細胞が通って流れるのに対し分離中、磁気標識した細胞は、セパレータの磁場中でカラム内に保持されています。洗浄工程の後、カラムセパレータの磁場から削除され、標的細胞をカラムから溶出される。 LSまたはMSカラムは、高純度の標識および非標識細胞の分画における正の選択の結果の間に使用。一方、負の選択に使用されるLDの列、、標識された画分の純度が若干低い結果。その行列のパッキング密度が高いのために、これらの列の流量は、カラムの中に閉じ込められる非標識細胞のリスクが高い低いに起因している。 LDの列は、望ましくない細胞亜集団の厳しいプリーションするためにのみ使用する必要があります。ポジティブ選択incubatio以下MicroBeadsで直接（MicroBeadsに結合した抗体）または間接磁気標識（インキュベーションによって行うことができるn個の一次抗体を使用）。特定のMACS MicroBeadsは前立腺または黒色腫27のような原発腫瘍細胞の多くの種類の細胞の正の選択のために用意されています。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAAラボラトリーズ社</td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水でアムホテリシンB液250μg/ mLの</td><td>シグマアルドリッチ社</td><td> A2942-50ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td>抗線維芽細胞のマイクロビーズ</td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1（W6B3C1） </td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV </td><td>シグマアルドリッチ社</td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td> Applichem社</td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td>は、Ca、Mgを含まないD-PBS </td><td> PAAラボラトリーズ社</td><td> H15-002 </td><td></td></tR&gt; <tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物エチレンジアミン四酢酸（EDTA） </td><td>シグマアルドリッチ社</td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBSスペリオル</td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td>間接CD133マイクロビーズキット人間</td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-091-895 </td><td>含まれています：CD133 / 1（AC133）-ビオチン、Anti-Biotin MicroBeadsはとFcRブロッキング試薬</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン、液体（100倍） </td><td>インビトロジェン社</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>量子263 </td><td> PAAラボラトリーズ社</td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解液（10倍） </td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr> &lt;TD&gt;セルストレーナー（70μm）の</td><td> BD Biosciences社</td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS Cチューブ</td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS解離</td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACSセパレーターマルチスタンド</td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Seperation柱25のLSカラム</td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmixチューブローテーター</td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchlo​​ride </td><td>メルク</td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td>プレセパレーションフィルター</td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-041-407 </td><td></TD&gt; </tr><tr><td> QuadroMACSセパレータ</td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo·シリンジフィルター（0.22μmで、PES） </td><td>カール·ロート社＆Co KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GPフィルターユニット500ミリリットル</td><td>ミルテニーバイオテク社</td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

cd133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

利用できるメラノーマ今日のための改良さ治療オプションにもかかわらず、高度な悪性黒色腫の患者は、まだ無増悪生存期間および全生存期間のため予後不良である。したがって、トランスレーショナルリサーチは、悪性黒色腫のための標的療法を改善するためのさらなる分子の証拠を提供する必要があります。過去には、黒色腫に関連する発癌メカニズムが広く確立された細胞株を用いて検討した。個々の遺伝的プロファイルに基づいて、よりパーソナライズされた治療法への道に、私たちは、患者由来の細胞株の代わりに、汎用的な細胞株を使用することを提案する。特に患者のフォローアップ一緒に高品質の臨床データと、これらの細胞は、より良いメラノーマの進行の背後にある分子メカニズムを理解する手段になるでしょう。 ここでは、解剖した新鮮な腫瘍組織からの原発性メラノーマ培養の設立を報告している。この手順は、単一細胞にミンチと組織の解離、再を含む赤血球と線維芽細胞と同様に細胞の悪性黒色腫由来の初代培養で信頼性の検証と汚染のmoval。 最近の報告では、腫瘍の大部分のようなメラノーマ、港もっぱら転移状態に向かって腫瘍の発生と進行を煽るように見える癌幹細胞（CSCが）、少量の亜集団が明らかになった。黒色腫におけるCSCの同定および単離するための重要なマーカーの一つはCD133です。バルク、栽培と機能的に分析することができます-原発性黒色腫の培養液から、CD133 + CSCを単離するために、我々は、CD133の高い選別純度および生存率で+ CSCおよびCD133を生じMiltenyi社からの磁気活性化細胞選別（MACS）の手順を変更し、最適化したその後。

腫瘍組織からの単一細胞の調製 図2（B）は、機械的解離は2-4 mmの小片にする前に、（A）と後の後期メラノーマ患者の切除リンパ節転移を例示している。 70μmのナイロンメッシュを通して組織とろ過の酵素的解離の後、細胞をペレットにし、上清を捨てる。このステップでは、我々は、 図2Cの細胞ペレットの赤みを帯びた色で示されるように赤血球と高い汚染を観測しました。その後、我々は、ライトブラウン色（ 図2D）の細胞ペレットをもたらした赤血球を、枯渇。これらの細胞は、℃、5％CO 2、37℃クアンタム263培地で再懸濁し、培養した。 初代培養細胞のキャラクタリゼーション細胞が腫瘍からではなく、周囲間質に由来するかどうかを検証するために、我々は、RT-PCRを行ったmelanocyte/melanoma-の、線維芽細胞、樹状突起と、幹細胞マーカー遺伝子。アダルトメラノサイト...

この記事では、初代培養細胞に新たに取得したメラノーマ組織の調製を記述する方法、および腫瘍細胞から赤血球および線維芽細胞の汚染物を除去する。最後に、我々はどのように説明したCD133<sup&gt; +</sup&gt;推定メラノーマ幹細胞は、CD133から順にソートされ<sup&gt; -</sup&gt;磁気活性化細胞選別（MACS）を使用してバルク。

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

この手順の全体的な目的は、悪性黒色腫から患者由来の細胞培養を構築し、CD133陽性と推定されるがん幹細胞を単離することです。これは、まず腫瘍組織から黒色腫の一次単一細胞を調製し、細胞ペレットから赤血球を除去することによって達成されます。必要に応じて、一次細胞培養の特性評価を行い、線維芽細胞を除去してください。最終ステップは、CD 1 33 陽性および CD 1 33 陰性のメラノーマ細胞の磁気細胞分離を行うことです。最終的に、この最適化された MACS 手順は、高度に濃縮された生存可能な CD 1 33 陽性および CD 1 33 陰性細胞の集団を得るための優れた手法となります。我々はまず、市販の細胞株が使用できない、癌患者の薬剤応答の予測を試みる個別化医療における in silico データの検証にこの技術を用いました。この手法の主な利点は、悪性黒色腫におけるがん幹細胞の候補であるCD 1 33陽性細胞に迅速にアクセスできることです。本手法の説明は、私の研究室のラボテクニシャンであるCatherine Davisが行います。手術で採取した直後の腫瘍組織を、1% penicillin streptomycinを含む滅菌PBS中で組織培養室へ運搬してください。腫瘍組織を滅菌済みのペトリ皿に移し、過剰な溶液を吸引します。次に、解離ミックスを500 µL加え、新しい滅菌済みのメスを用いて腫瘍を2〜4 mmの小さな破片状に細切します。その後、細切した腫瘍組織2〜4 gを、5 mLの解離ミックスを含むgentleMAX Cチューブに移します。ペトリ皿をさらに 4.5 milliliters の解離ミックスで洗浄し、残りの組織断片を gentle max C tube に加えます。チューブを閉じ、解離装置のスリーブに逆さまに装着して、プログラム H tumor zero one を実行します。次に、サンプルを 37 degrees Celsius で 30 分間、最高回転速度で連続回転させながらインキュベートします。次に、チューブを逆さまにして解離装置のスリーブに取り付け、「H tumor zero two」プログラムを実行します。その後、サンプルを37 °Cで30分間、12 RPMで連続回転させながらインキュベートします。続いて、「gentle max」プログラム（H tumor zero three）を実行してください。サンプルを再懸濁し、細胞懸濁液を70 micronのセルストレーナーを通して50 milliliterチューブに回収します。必要に応じて、細胞懸濁液が完全に通過するまで、滅菌フィルターチップで撹拌します。セルストレーナーを5 milliliterのquantum 2 6 3 mediumで洗浄し、細胞懸濁液を300 Gで5分間遠心してペレット化し、上清を捨てます。細胞ペレットが高密度の組織やライゼートのために赤く見える場合は、付随するテキストプロトコルに詳述されているように赤血球を除去してください。腫瘍細胞をquantum 2 6 3で再遠心し、培養プレートに播種します。細胞が80%コンフルエンスに達した際に、ルーチンで継代してください。顕微鏡を用いて、初代細胞培養の表現型を分析します。次に、cDNA合成後のRNA抽出のために初代細胞培養物を少量回収し、腫瘍性メラノーマ、幹細胞、およびストローマ細胞のマーカー遺伝子用プライマーを用いてRT-PCRを行います。分析すべき最も重要な遺伝子は、線維芽細胞マーカーであるCD 90、メラノーマおよびメラノサイトマーカー、がん幹細胞マーカーであるCD 1 33、成熟樹状細胞のマーカーであるCD 83、およびHPRTやGAPDHなどのハウスキーピング遺伝子です。顕微鏡観察とRT-PCRの複合的な分析により、初代メラノーマ培養物に高濃度の線維芽細胞混入が認められた場合は、抗線維芽細胞抗体、マイクロビーズ、およびLDカラムを用いて線維芽細胞を除去します。80%コンフルエンスの細胞を予熱したPBSで洗浄し、適量のAccutaneを加えて細胞が培養表面から剥離するまでインキュベートします。細胞をquantum 2 6 3培地で回収し、50 mLチューブに移します。細胞数を計測した後、必要な細胞数を300 G、4～8 °Cで5分間遠心分離します。上清を完全に吸引し、再懸濁させる。最大1×10⁸個の細胞を350 µLのmax bufferに懸濁し、100 µLのFCR blocking reagentと50 µLのCD 1 33.1 biotinを加える。よく混ぜ合わせ、4°Cで10分間インキュベートする。10 mLのmax bufferで細胞を洗浄し、続いて300 G、4〜8°Cで5分間遠心分離を行う。2回目の洗浄後、上清を完全に吸引除去する。細胞ペレットを400 µLのmax bufferで再懸濁します。100 µLのanti biotin microbeadsを加え、よく混ぜ合わせた後、4～8 °Cで15分間インキュベートします。その間に、磁気分離用のmax separatorを準備するため、quadro maxをmax separator multis standに取り付けます。Quadro Maxの磁場内に、カラムウィングを前方にして必要な数のLSカラムを挿入します。各LSカラムに分離前フィルターと適切な回収チューブをセットします。各カラムの下で、3 mLのMaxバッファーでフィルターとカラムを洗浄し、透過液を廃棄します。前述した通りにmax bufferで細胞を洗浄した後、500 µLのmax bufferで細胞を再懸濁し、準備したLSカラムに細胞懸濁液を適用します。1カラムあたり3 mLのmax bufferを用いて3回洗浄します。ラベルなしのcd 1 33陰性細胞分画の全流出液を回収してください。次に、分画用フィルターを廃棄します。セパレーターからカラムを取り外し、適切な回収チューブに設置します。5 mLのmax bufferを添加します。プランジャーをカラムに強く押し込んで、ラベルされたCD 1 33陽性細胞を直ちに洗い流し、陰性画分の純度を高めます。細胞懸濁液を新たに平衡化したLSカラムに適用し、流出液であるCD 1 33陰性画分を回収します。この切除されたリンパ節転移は、末期メラノーマ患者から得られたものです。組織を機械的および酵素的に解離した後、ろ過した細胞ペレットには赤血球が高濃度で混入していました。続いて赤血球を除去したところ、細胞ペレットは淡褐色の色調となりました。これらの細胞はquantum 2 6 3培地で培養され、メラノサイトおよびメラノーマ、線維芽細胞、樹状細胞、および幹細胞マーカーに対するR-T-P-C-Rが行われました。細胞が周囲の間質ではなく腫瘍に由来することを確認するために、遺伝子解析が行われました。成人のメラノサイトをtearの正常コントロール細胞として、また胚性癌細胞株N-C-C-I-Tを幹細胞マーカーCD 1 33のポジティブコントロールとして使用しました。これらのデータは、一部の初代細胞が実際にtear陽性であり、したがってメラノサイト由来であることを示しています。この培養液は、成熟樹状細胞のマーカーであるCD 83についても陰性です。興味深いことに、このメラノーマ細胞株は、非対称細胞分裂に不可欠な遺伝子であり、既知のがん幹細胞マーカーであるCD 1 33を発現しています。ここに示しているのは、線維芽細胞除去処理後も線維芽細胞が高度に混入している初代細胞培養の明視野顕微鏡写真であり、これらの培養物は初代メラノーマ細胞を表しています。原発性メラノーマ細胞をCD 1 33陽性細胞とCD 1 33陰性細胞に分取しました。免疫蛍光染色およびウェスタンブロット分析によるこれらのデータは、分取効率と純度が高いことを示しています。この手法は、患者由来の組織や細胞を用いて各患者の薬剤反応性をより正確に予測できるため、個別化医療において大きな意義を持ちます。この手法は、腫瘍の由来はどこか、患者をどのように治療できるかといった重要な疑問に答えるのに役立ちます。また、システム生物学的なアプローチにおける実験を検証することで、それらのアプローチをより適切に再定義することに寄与します。

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生体外 黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

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メラノーマ患者由来オルガノイドモデルによる治療機会の解明

学ぶ悪性黒色腫由来の患者細胞培養とMACSによるCD133陽性がん幹細胞分離法。赤血球と線維芽細胞を除去し高純度細胞集団を迅速に取得する技術です。

CD133の患者由来の細胞培養および分離

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