CD133の患者由来の細胞培養および分離 +推定されるがん幹細胞

この手順の全体的な目標は、悪性黒色腫から患者由来の細胞培養を確立し、推定 CD 1 33 陽性のがん幹細胞を単離することです。これは、最初に細胞ペレットから赤血球を枯渇させた後、腫瘍組織から原発性黒色腫単一細胞を調製することによって達成されます。必要に応じて、初代細胞培養を特徴付け、線維芽細胞を枯渇させます。

最後のステップは、CD 1 33陽性およびCD 1 33陰性黒色腫細胞の磁気細胞選別を行うことである。最終的に、この最適化された最大手順は、CD 1 33陽性細胞およびCD 1 33陰性細胞の高度に濃縮された生存可能な集団を得るための優れた方法です。私たちはまず、この技術を使用して、がん患者の薬物反応を予測しようとする個別化医療のinscoデータを検証し、そのために市販の細胞株を使用することはできません。

この技術の主な利点は、悪性黒色腫の推定がん幹細胞であるCD 1 33陽性細胞に迅速にアクセスできることです。この手法は、私の研究室の技術者であるCatherine Davisによって発表されます。手術から新たに分離された腫瘍組織を、1%ペニシリンストレプトマイシンを含む滅菌PBSの組織培養実験室に移します。

腫瘍組織を滅菌ペトリ皿に移し、余分な溶液を吸引します。次に、500マイクロリットルの解離混合物を追加し、新鮮な滅菌メスを使用して腫瘍を2〜4ミリメートルの小片にミンチします。次に、2〜4グラムのミンチ腫瘍組織を、5ミリリットルの解離ミックスを含む穏やかな最大Cチューブに移します。

さらに4.5ミリリットルの解離混合物でペトリ皿をすすぎ、残りの組織片を穏やかな最大Cチューブに加えます。チューブを閉じ、解離のスリーブに逆さまに取り付けて、プログラムH腫瘍ゼロワンを実行します。次に、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートし、最高回転速度で連続回転させます。

次に、チューブを逆さまにして解離のスリーブに取り付け、プログラムH腫瘍ゼロツーを実行します。次に、12 RPMの連続回転下で、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、ジェントルマックスプログラムH腫瘍ゼロスリーを実行します。

サンプルを再懸濁し、細胞懸濁液を70ミクロンの細胞ストレーナーに通して50ミリリットルのチューブに入れます。必要に応じて、完全な懸濁液が通過するまで、滅菌フィルターチップで細胞懸濁液を攪拌します。細胞ストレーナーを5ミリリットルの量子2 6 3培地ペレットで細胞懸濁液を300Gで5分間洗浄し、上清を捨てます。

細胞の味覚がチックや嘘の量が多いために読まれているように見える場合、赤血球は、コンパニオンテキストプロトコルに詳述されているように細胞です。腫瘍細胞を量子2 6 3で再スピンし、細胞が80%のコンフルエントに達したときに定期的に細胞を継代する培養物を播種します。初代細胞培養の表現型を顕微鏡で解析します。

次に、CD NA合成後のRNA抽出のために少量の初代細胞培養物を回収し、腫瘍性黒色腫、幹細胞、および間質細胞マーカー遺伝子のプライマーを使用してR-T-P-C-Rを実行します。解析すべき最も重要な遺伝子は、線維芽細胞マーカーCD 90、黒色腫およびメラノサイトマーカー引き裂きがん幹細胞マーカーCD 1 33、成熟樹状細胞のマーカーであるCD 83、およびHPRTやGAAP dhのようなハウスキーピング遺伝子です。顕微鏡分析と R-T-P-C-R 分析の組み合わせにより、原発性黒色腫培養物のファイバーブラスト汚染が高いことが明らかになった場合は、抗線維芽細胞、マイクロビーズ、および LD カラムを使用して線維芽細胞の枯渇に進みます。

80%コンフルエンス細胞を予温PBSで洗浄し、適量のアキュテインを加え、細胞が培養表面から剥離するまでインキュベートします。量子2 6 3培地で細胞を採取し、50ミリリットルのチューブに移します。細胞を列挙し、必要な数の細胞を300G、摂氏4〜8度で5分間遠心分離します。

上清を完全に吸引し、蘇生します。最大バッファー350マイクロリットルで8番目の細胞に1回まで10回懸濁し、100マイクロリットルのFCRブロッキング試薬と50マイクロリットルのCD1、33を追加します。1つのビオチン。

よく混ぜ合わせ、摂氏4度で10分間インキュベートします。細胞を最大10ミリリットルの緩衝液で洗浄し、続いて300G、摂氏4〜8度で5分間遠心分離します。2回目の洗浄後、上清を完全に吸引します。

細胞ペレットを最大緩衝液400マイクロリットルに再懸濁します。100マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズを加え、よく混ぜ合わせ、摂氏4〜8度で15分間インキュベートします。一方、磁気分離用の最大セパレーターを準備するには、クアドロマックスを最大セパレーターマルチスタンドに取り付けます。

クワドロマックスの磁場に、カラムウィングを前面に持たせた必要な数のLSカラムを挿入し、各LSカラムと適切な収集チューブにプレス分離フィルターを配置します。各カラムの下で、フィルターとカラムを最大3ミリリットルのバッファーですすぎ、流れを捨てます。

前述のように細胞を最大バッファーで洗浄した後、細胞を最大500マイクロリットルのバッファーに再懸濁し、調製したLSカラムに細胞懸濁液を塗布します。カラムあたり最大3ミリリットルのバッファーで3回洗浄します。標識されていないcd 1 33陰性細胞画分の総富裕

次に、プレス分離フィルターを廃棄します。カラムをセパレーターから取り外し、適切な収集チューブに置きます。最大5ミリリットルのバッファーを適用します。

プランジャーをカラムにしっかりと押し込み、標識されたCD 1 33陽性細胞をすぐに洗い流し、陰性画分の純度を高めます。細胞懸濁液を新しい平衡化LSカラムにアプライし、廃液CD1 33陰性画分を回収します。この切除されたリンパ節転移は、末期の黒色腫患者から得られた。

組織の機械的および酵素的解離後、濾過された細胞のペレットは赤血球による高い汚染を含んでいました。その後、赤血球が枯渇すると、薄茶色の細胞ペレットが得られた。これらの細胞を、メラノサイトおよびメラノーマ、線維芽細胞、樹状細胞および幹細胞マーカーのR-T-P-C-Rである量子2 6 3培地で培養した。

遺伝子は、細胞が周囲の間質ではなく腫瘍に由来することを確認するために使用されます。成体メラノサイトは、涙液の正常コントロール細胞として、胚性癌細胞株N-C-C-I-Tは幹細胞マーカーCD1 33の陽性コントロールとして役立った。これらのデータは、一部の初代細胞が実際に涙液に対して陽性であり、したがってメラノサイト起源であることを示しています。

この培養物は、成熟樹状細胞のマーカーであるCD 83に対しても陰性です。興味深いことに、この黒色腫細胞株は、非対称細胞分裂に重要な遺伝子であり、既知のがん幹細胞マーカーであるCD1 33を発現しています。ここに示されているのは、線維芽細胞枯渇の治療後に線維芽細胞で高度に汚染された初代細胞培養の明視野顕微鏡写真であり、培養物は初代黒色腫細胞を表しています。

初代黒色腫細胞を、CD1,33陽性細胞およびCD1,33陰性細胞に選別した。免疫蛍光分析、染色分析、ウェスタンブロット分析から得られたこれらのデータは、高いソーティング効果と純度を示しています。このアプローチは、患者由来の組織や細胞を使用して、各患者の薬物反応を個別により正確に予測できるため、個別化医療に大きな影響を与えます。

この方法は、腫瘍がどこから来たのかなどの重要な質問に答えるのに役立ちますか?患者さんはどのように治療できますか?また、彼らの実験を検証することで、システムバイオロジーのアプローチをより明確に再定義するのに役立ちます。