抗原特異的規制用のトランス生体内遅延型過敏アッセイ

この手順の全体的な目的は、trans vivo DTHアッセイを用いて、ヒト被験者における抗原特異的な前炎症性および抗炎症性の両反応をモニタリングすることです。まず、ヒト被験者の末梢血から末梢血単核細胞を単離します。次に、単離したPBMC調製液をPBSと混合します。

リコール抗原テスト抗原、およびテスト抗原とリコール抗原の混合液を用意します。足底の事前測定を行い、調製した混合液をSKIDマウスに注射します。24時間後に足底の測定を再度行います。3。

DTH反応の決定的なパターンには、調節性、非調節性、および感作性のものが考えられます。trans vivo遅延型過敏症アッセイは、抗原源が移植ドナーの細胞である同種反応などの臨床パラメータを決定するために適用できます。既存のin vitro法に対するこの手法の主な利点は、単一のアッセイシステムを用いて、同種抗原、自己抗原、または腫瘍抗原に対する炎症促進性反応と調節性反応の両方を容易に検出できることです。

私の研究室の研究員であるEgonが、血小板の活性化を避けるために酸性クエン酸デキストロース管で採取した新鮮なヒト末梢血を用いた手順を実演します。標準的な方法に従い、リンパ球分離培地を用いてPBMCを分離します。PBSでPBMC調製液を洗浄し、混入した血小板を除去します。

赤血球の混入が顕著な場合は、CK溶解バッファーを用いて赤血球の溶血を行います。その後、PBS Resusでさらに2回洗浄します。アロ抗原用に、PBMCをPBSに懸濁し、濃度を10 million PBMC/mLに調整します。

先に示した手順でドナーの末梢血から分離したP BMCsを用意します。次に、ドナー細胞をPBSで120 million cells/mLの濃度に懸濁し、タンパク質の分解を防ぐために1 µMのPMSFを添加します。

次に、2 mm プローブを備えたソニケーターを用い、1 秒間のパルスを 7 回与えて細胞懸濁液を超音波処理します。ヘモサイトメーターを使用し、90% 以上の細胞が破壊されていることを確認してください。

次に、混合液を 4 °C、14,000 RPM で 20 分間遠心分離します。上清を注意深くセーフロックチューブに移し、各注入サンプルについて標準的な方法でタンパク質濃度を測定します。10⁶ 個の PBMC を 2 mL ずつ 7 分注します。

セーフロックチューブを用い、遠心分離により細胞をペレット化します。まず、35 µLのPBSでPBMCの陰性対照懸濁液を調製します。次に陽性対照として、リコール抗原である破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドを25 µL加え、PBSで注入量を35 µLに調整します。

ドナー特異的反応を評価するための実験計画に従い、細胞ペレットをドナー抗原 10 µL と PBS 25 µL に再懸濁し、総量を 35 µL とします。実験的なドナー抗原特異的制御を評価する場合は、ドナー抗原 10 µL とリコール TT DT 抗原 25 µL を加え、細胞ペレットを 35 µL に再懸濁します。イソフルランでマウスを麻酔した後、スプリングロードキャリパーを足底の中心に配置し、一方の端を足の最後方の歩行パッドに接触させます。これにより、ゲージの読み値が安定した際に、測定部位を一定に保つための基準とします。

足底への注射を行うため、ベースラインの足底厚を記録します。注射針を足指に向け、針先（ベベル）を上にした状態でシリンジを配置します。次に、各細胞懸濁液をマウスの後肢足底に皮下注射します。

まず、右足底に陰性対照調製液をゆっくりと注入します。次に、左足底にPBMCとTT dtの陽性対照を注入します。その後、マウスをケージに戻します。

2番目に、右足底にPBMCとallo抗原を、左足底にPBMC、allo抗原、およびTT dtを注入します。注入から18〜24時間後に、漏出がないことを確認してください。各マウスをイソフルランで麻酔し、足底の腫脹の測定を繰り返します。

注入後の足底厚から注入前の足底厚を差し引き、足底腫脹値を求めます。次に、処置群から得られた足底腫脹値からコントロール群の足底腫脹値を差し引くことで、抗原特異的な正味の腫脹値を算出します。ポジティブコントロールとして、想起抗原TT DTに対し25 × 10⁻⁴インチ以上の陽性反応が得られていることを確認してください。

試験を有効とするには、PBSに対するバックグラウンド反応が必要です。次に、ドナー抗原存在下におけるリコール反応の抑制を決定します。この実験では、腎移植レシピエントにおけるドナー抗原特異的な反応および調節能を評価します。

移植レシピエントにおける遅延型過敏反応には、制御型、非制御型、感作型の3つの主要なパターンがあります。すべての患者が、リコール抗原ttの陽性対照に対して強い反応を示しました。患者番号62は制御型のパターンを示しており、ドナー抗原に対する反応が弱く、ドナー抗原の存在下でリコール抗原反応に対する顕著な連鎖抑制が認められることが特徴です。

これは臓器同種移植の許容に関連していることが判明したパターンです。患者番号48は非調節パターンを示しており、ドナーに対する反応は弱いが、連動した抑制は見られないという特徴があります。このパターンは、免疫抑制剤を服用している患者において頻繁に観察されています。

患者8は、ドナー抗原に対する高い反応性と連動した抑制の欠如を特徴とする、ドナー感作パターンを示しています。この反応は移植片拒絶に関連しています。臨床症例研究では、観察試験に登録された被験者のP BMCsを用い、ドナー特異的な間接経路、Tエフェクター細胞およびT調節細胞の反応を解析し、臨床的免疫寛容におけるドナー特異的な調節の役割を評価しました。

ドナー抗原に対する間接的なT細胞応答は、登録グループ間で明確なスペクトラムを示します。足底の腫脹は、患者の臨床状態が耐容状態から慢性拒絶状態へと移行するにつれて増大します。ここでは、リンカー抑制アッセイを用いて、ドナーに対する間接経路の制御性T細胞応答を測定します。

これらのデータは、最も耐性のある患者から、中間的な患者、そして最も耐性の低い慢性拒絶反応患者に至る範囲において、調節反応が減少していることを示しています。総合すると、trans vivo DTHアッセイで測定された免疫調節は、腎同種移植片の生着にとって重要なメカニズムであると考えられます。

有望な領域の一つに、自己免疫のモニタリングにおけるTDTHアッセイの応用が挙げられます。細気管支炎閉塞性細気管支炎（BOS）症候群の病理学的過程におけるV型コラーゲンの役割に関する我々の研究では、コラーゲンに対して陽性反応を示した肺移植レシピエントのPBMCにおいて、BOS発症の相対リスクが最も高いことが明らかになりました。一方、健康対照群やコラーゲンに対してはそのような傾向は見られませんでした。

腎移植後の反応性グッドパスチャー症候群患者4名は、頻繁にコラーゲンVに対して反応性を示しました。TDTHアッセイは、がん患者のPBMCにおける腫瘍特異的抗原への反応性の検討にも利用可能です。例えば、前立腺がん患者におけるPAP特異的T調節細胞の存在は、PAP抗原を用いたワクチン接種への反応を制限する可能性があります。

TRANSVAAL DTHアッセイは、移植、がん、および自己免疫疾患患者における細胞性免疫応答を評価するための臨床応用が可能な新しい診断テストです。本アッセイは、エフェクターT細胞の記憶応答のモニタリングに有用であるだけでなく、エフェクターT細胞または制御性T細胞の検出に特定のサイトカイン測定に依存しないため、制御性T細胞応答の検出にも使用できるという価値があります。非常に柔軟性が高く、幅広く適用可能です。