抗原特異的規制用のトランス生体内遅延型過敏アッセイ

我々は潜在的に移植片拒絶反応のリスク上昇せずに移植後免疫抑制の撤退を決定するために使用することができる貴重な診断アッセイを記述します。アッセイは、遅延型過敏の原則を使用し、受信者によってマウントされたドナーの特定のエフェクターと規制免疫応答の両方の正確な評価を提供します。

この手順の全体的な目標は、trans vivo DTHアッセイを使用して、ヒト被験者の抗炎症抗原特異的反応と抗炎症抗原特異的反応の両方をモニターすることです。まず、ヒト被験者の末梢血から末梢血単核細胞を単離します。次に、PBMC調製物とPBSを混合します。

リコール抗原検査抗原と検査抗原プラスリコール抗原。フットパッドのプレム測定を続行し、調製した混合物をスキッドマウスに注入します。フットパッドは24時間後に測定を繰り返します。3。

DTH応答の決定的なパターンは、調節的、非規制的、および感作的である可能性があります。trans vivo遅延型過敏症アッセイは、抗原の供給源が移植ドナーの細胞である場合の同種反応反応などの臨床パラメータを決定するために適用できます。この手法が既存のin vitro法と比較した場合の主な利点は、単一のアッセイシステムを使用して、同種抗原、自己抗原、または腫瘍抗原に対する炎症誘発性および調節性の両方の応答を容易に検出できることです。

私の研究室の研究者であるエゴンは、酸性クエン酸デキストロースチューブで採取した新鮮なヒト末梢血を使用して血小板の活性化を回避する手順を実演します。標準的な方法に従って、リンパ球分離培地を使用してPBMCを単離します。PBMC製剤をPBSで洗浄し、汚染された血小板を除去します。

顕著な赤血球の汚染がある場合は、CK溶解バッファーを使用して赤血球の溶解を行います。次に、PBS Resusでさらに2回の洗浄を行います。PBMCをPBS中に1ミリリットルあたり1,000万PBMCの濃度で懸濁します。

前に示した手順を使用してドナー末梢血から分離されたP BMCから開始します。その後、復活します。ドナー細胞をPBSに1ミリリットルあたり1億2000万個の細胞の濃度で懸濁し、PMSFを1マイクロモル添加してタンパク質の分解を防ぎます。

次に、2ミリメートルプローブsonicaで7つの1秒パルスを使用して細胞懸濁液を超音波処理します。ヘモサイトメーターを使用する。セルの 90% を超える中断を確認します。

次に、混合物を摂氏4度で14, 000RPMで20分間遠心分離します。上清を2つの安全なロックチューブに慎重に移し、各注入の標準的な方法でタンパク質濃度を決定します。2ミリリットルに6番目のP BMCに10の7倍をアリコートします。

セーフロックチューブは、遠心分離によって細胞をペレット化します。まず、PBMCの陰性制御懸濁液を35マイクロリットルのPBSに調製します。次に、ポジティブコントロールのために、リコール抗原、破傷風、トキソイド、ジプテリア、トキソイドを25マイクロリットル追加し、PBSで注入量を35マイクロリットルに調整します。

ドナー特異的反応を評価するための実験デザインに従って、細胞ペレットを 10 マイクロリットルのドナー抗原と 25 マイクロリットルの PBS に再懸濁して、総容量を 35 マイクロリットルにします。実験的なドナー抗原特異的調節を評価するために、10マイクロリットルのドナー抗原と25マイクロリットルのリコールTT DT抗原を添加することにより、細胞ペレットを35マイクロリットルに懸濁します。麻酔後、イソフッ素を配合したスキッドマウスは、フットパッドの中央にバネ式キャリパーを配置し、一方の端が足の最後のウォーキングパッドに接触するようにして、ゲージの読み取り値が安定したときに測定部位を一定に保つためのベンチマークを提供します。

フットパッド注入のベースラインフットパッドの厚さを記録します。針をつま先に向けて、ベベルを上に向けてシリンジを置きます。次に、マウスの後部フットパッドへの各細胞懸濁液の皮下注射を開始します。

1つ目は、ネガティブコントロールプレップで右足パッドをゆっくりと注入することです。次に、PBMCとTT dtのポジティブコントロールを左フットパッドに注入します。次に、マウスをマウスのケージに戻します。

その2、右のフットパッドにPBMCとアロ抗原を注入し、左のフットパッドにPBMCとアロ抗原とTT dtを注入します。注入後18〜24時間程度で漏れがないことを確認してください。各マウスにイソフッ素で麻酔をかけ、フットパッドの腫れの測定を繰り返します。

注入前の各フットパッドの厚さを注入後の値から差し引いて、フットパッドの腫れの値を求めます。次に、治療から得られたフットパッドの腫れ値からコントロールフットパッドの腫れ値を差し引くことにより、抗原特異的な正味の腫れを計算します。リコール抗原TT DTに対するポジティブコントロールレスポンスを、マイナス4インチオーバーの10倍以上の25倍以上で読み取り、ポジティブコントロールが読み取れることを確認します。

テストが有効であると見なされるには、PBSに対するバックグラウンド応答が必要です。次に、ドナー抗原の存在下での想起応答の阻害を決定します。この実験では、腎移植レシピエントのドナー抗原特異的反応と調節について評価します。

移植レシピエントの遅延型過敏症には、調節性、非規制性、感作性の3つの主要なパターンがあります。すべての患者は、リコール抗原ttの陽性制御に強く反応しました。患者番号62は、ドナー抗原に対する弱い応答と、ドナー抗原の存在下での抗原応答の想起に対する顕著な連鎖抑制を特徴とする調節パターンを示している。

これは、臓器同種移植片耐性と関連していることがわかっているパターンです。患者番号48は非調節パターンを示し、ドナーに対する反応が弱いという特徴がありますが、関連する抑制はありません。このパターンは、免疫抑制薬を服用している患者で頻繁に観察されています。.

患者番号 8 は、ドナー抗原に対する高い反応と連鎖抑制なしを特徴とするドナー感作パターンを示します。この応答は、グラフト拒絶反応に関連しています。臨床ケーススタディでは、観察試験に登録された被験者のP BMCを、ドナー特異的間接経路、Tエフェクター、およびT調節応答についてアッセイし、臨床的耐性におけるドナー特異的調節の役割を評価しました。

ドナー抗原に対する間接的なテクターの反応は、登録グループ全体で明確なスペクトルを明らかにします。フットパッドの腫れは、患者の臨床状態が耐性のあるものから慢性的に拒絶的なものに移行するにつれて増加します。ここで、リンク抑制アッセイは、T制御応答の抗ドナー間接経路を測定します。

これらのデータは、最も耐性のある患者から中程度から最も耐性の低い慢性拒絶患者までの範囲で規制反応が減少していることを示しています。まとめると。trans vivo DTHアッセイで測定される免疫調節は、腎同種移植片の受容にとって重要なメカニズムであると考えられます。

有望な分野は、自己免疫のモニタリングにおけるTDTHアッセイの応用です。細気管支炎OBL症候群の病理学的過程における5型コラーゲンの役割に関する私たちの研究は、コラーゲンに対して陽性反応を示す患者でBOS発症の最も高い相対リスクが観察されたことを明らかにしました。肺移植レシピエントからの5つのpbmcですが、健康なコントロールやコラーゲンからのものではありません。

腎移植後の患者は、コラーゲンが5反応性であることが多かった。TDTHアッセイは、がん患者からのpbmcの腫瘍特異的抗原に対する反応性をテストするためにも使用できます。例えば、前立腺癌患者におけるPAP特異的T制御細胞の存在は、PAP抗原によるワクチン接種に対する応答を制限する可能性がある。

TRANSVAAL DTHアッセイは、移植がん患者および自己免疫患者における細胞性免疫応答の評価に臨床応用できる新しい診断検査です。これは、Tエフェクターの想起応答のモニタリングに役立つだけでなく、効果または制御性T細胞を検出するために特定のサイトカイン測定に依存しないため、T調節応答の検出にも使用できるため、価値があります。非常に柔軟性があり、幅広く適用できます。