Name: 密度勾配多層重合（DGMP）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 学ぶ 密度勾配多層重合（DGMP）法による多層細胞培養足場の作製。RGDSペプチドとC2C12細胞を用いて、基質組成が細胞接着と増殖に与える影響を可視化する簡便で低コストな組織工学技術です。

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著者らは、NIHのディレクターの新イノベーター賞（1DP2 OD006499-01 AAと1DP2 AJEにOD006460-01〜）からの支援、そして科学技術（ナノメディシンの優秀なUCサンディエゴセンター）キング·アブドゥルアズィーズ市に感謝しています。我々は、原稿上の彼女の批判的なコメントのためにジェシカ·ムーア氏に感謝したいと思います。

1。蛍光標識アクリロイル-PEG-RGDSの合成<ol><li>室温でアルゴン下、ジメチルスルホキシド（DMSO）のモル比で1.2:1:2とNNジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）アクリロイル-PEGスクシンイミジルカルボキシメチルエステル（3400グラム/モルaPEG-SCMは、PEG MW）とRGDSペプチドを反応一晩。 </li><li>飛行のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間（MALDI-TOF）質量分析法によって共役を確認してください。 MALDIターゲットとドライでの試料スポットにaPEG-RGDS反応液の1μlを添加します。ユニバーサルMALDIマトリックスのテトラヒドロフラン（THF）と1分間ボルテックスの飽和溶液を調製します。同じサンプルのスポットにこのソリューションの約1μlを添加する。比較のためにaPEG-SCMの手順を繰り返します。ロードし、分析します。 aPEG-RGDSの分子量はaPEG-SCM（ 図2）より大きくなければなりません。 </li><li>蛍光色素を結合するために、溶解のAlexa Fluor 350カルボン酸（succinimydylエステル）の等モル量を追加DMSOの最小容量で、1.1からaPEG-RGDS反応溶液に、室温で一晩アルゴン下で反応する。 </li><li>日当たり少なくとも二回透析液を交換し、1,000:1体積比で48時間、4℃でのDI-H 2 Oに対して（MW 3500 Da）は透析によってaPEG-RGDS-350を精製する。 </li><li>精製LabconcoフリーゾーンPlusまたは同等のフリーズドライシステムでaPEG-RGDSを-350、-20℃で保存をフリーズドライ</li></ol> 2。 RGDS-350層を交互に使用した2DのPEGゲルの2Dモールドと製作の準備<ol><li>疎水性ガラススライドを準備します。真空オーブン内のガラス皿にきれいなガラススライドを配置します。 80熱が°Cで30分間完全に表面を乾燥させる。場所はドラフト内でスライドと皿と優しくコート表面全体に30秒間揺らし、各スライドに250μlのSigmacoteを追加します。徹底的にLEAがでで5分間ずつ2回浸漬し、蒸留水で洗浄した後、100％メタノールでコーティングされたスライドをすすぎトン10ミリリットル。 </li><li> 10ミリメートル生検パンチでシリコーンスペーサー（0.8mm厚）を切り取ります。 </li><li>シリコーンスペーサーとSigmacote処理したスライドガラスをオートクレーブ。 </li><li>最終濃度（ 例えば 40％、変化得イオジキサノールの異なる量（水中60％原液）と混合PEGアクリレート（PEGDA）前駆体（最終濃度15パーセントw / v）のことで、個々のマイクロチューブ内の各々の層のための解決策を策定する30％、20％と10％）、リン酸塩残量を補うことは傾斜密度の解を得るために、緩衝生理食塩水（PBS）。同様にして、交互層のために、イオジキサノールおよびPBSでミックスaPEG-RGDS-350（終濃度8 mm）が様々な濃度（ 例えば 35％、25％、15％）を得た。 </li><li>様々な層（各層の溶液1ml当たりの株式溶液10μl）の各溶液に（2 - ヒドロキシ-4&#39;-（2 - ヒドロキシエトキシ）-2 - メチルプロピオフェノン、N-ビニルピロリドンで333mg/ml株）光開始剤を追加します。光開始剤Isは光に敏感であるように、金型内のゲルの階層化する前に重合を防止するために最後に追加された。 </li><li>このプロトコルの後続ステップは、無菌性を確保するためにバイオセーフティキャビネット内で実行されます。 </li><li>滅菌した1mlシリンジおよび0.2μmフィルターを用いて、各溶液をろ過滅菌を。 2 Sigmacore処理されたガラススライド、 図1に示すように配置するクランプとの安全の間にスペーサーを挟むことにより、金型設定を組み立てます。 </li><li>密度の低い溶液（35％イオジキサノールと例えば aPEG-RGDS-350）に続く最初の最も密な溶液（40％イオジキサノールと例えば PEGDA）を追加することで、階層化ゲルをキャストします。 図1に示すように、所望の組成と密度のいくつかの層を達成するために代替の階層化を繰り返します。 </li><li>ポータブルUVR-9000ランプを使用して3分間365nmの光でモールドを照射します。重合したゲルは、5分間硬化させることを許可します。クランプを外し、そっと上部のガラスを持ち上げるスライドやカビ、成層DGMPゲルは、スライド上に残ります。無菌のスパチュラを使用して、慎重に滅菌PBSまたは洗浄用培地を含む50 mlチューブにゲルを置きます。 </li><li>密度調節剤、光開始剤、及び未反応のポリマーを除去するために一日に少なくとも二回バッファを交換し、1,000:1体積比でPBS中の重合ゲルを洗浄します。代わりに、PBSを細胞増殖培地と交換することができる。 PBSまたはステップ3で概説細胞培養実験のための増殖培地中DGMPゲルを保管してください。 </li><li>交互層を可視化するために、VersaDocゲルドキュメンテーションユニットのサンプルトレイ上の定規に沿ってDGMPゲル（これらのゲルは、細胞培養のため使用できません）を手配。 350 nmのゲルを公開。露光時間は、フルオロフォアの濃度に応じて異なります。 DGMPヒドロゲル中に濃い青とバンドを交互に異なる化学組成（ 図3）の離散的な層の形成を実証している。 </li></ol><ol><li> RGDSペプチドを組み込んだゲルは、そのようなC2C12筋芽細胞などの接着依存性細胞を使用しています。 </li><li>ゆっくりバイオセーフティキャビネット内で無菌のセルスクレイパーを用いて48ウェル細胞培養プレートのウェルにDGMPゲル（PBS中に保存）を挿入します。 </li><li>プリ暖かい増殖培地（10％v / vのウシ胎児血清および1％v / vの100xのペニシリン - ストレプトマイシン溶液を補充したダルベッコ改変イーグル培地またはDMEM）およびPBS 37℃に設定した水浴℃で</li><li> PBSでC2C12細胞3倍の60％コンフルエントのプレート（10 mm）を洗浄します。 0.25％トリプシン-EDTAの1mlを添加し、2分間37℃でインキュベートすることにより、PBSおよび収穫細胞を吸引。増殖培地とカウント細胞で細胞を​​再懸濁する。 C2C12筋芽細胞（20,000細胞/ cm 2）と同様にゲル含有細胞培養DGMPシード。 5％CO 2/95％相対湿度で37℃で細胞をインキュベートします。再しないように注意してください4時間後にそっと交換媒体、軽く接着した細胞を移動します。 </li><li> 24時間後、DGMPゲルのRGDS含有層上にC2C12筋芽細胞の付着は落射蛍光および位相差顕微鏡（ZEISS AXIOVERT 200）で確認することができる。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは、競合する利害関係はありません。

DGMPは高価な機器に依存しない多層ゲルを調製するためのシンプルな戦略です。このプロトコルは、コラーゲンやヒアルロン酸などの他の生体適合性材料を使用して、足場を作成するために適応させることができます。生理活性小分子は、例えば細胞接着促進RGDSペプチドのため、層の間の合図の混入を防ぐために、ポリマーマトリックスに係留することができます。マトリックスメッシュのサイズに応じて、彼らは、ハイドロゲル10を通って拡散しにくいようなタンパク質は、化学的結合を必要とせずに異なる層にカプセル化することができます。ここでは、イオジキサノール（Nycoprep）は、以前の生細胞アプリケーション用に使用されている不活性密度修飾子を使用していました。例えば、ショ糖、ブドウ糖などの他の密度調節剤を使用することもできます。セトリング時間（t s）を変化させることによって、人は、必要に応じて二つの層の間のインタフェースが（長いセトリング時間はスムーズな遷移を与える）またはスムーズな遷移を生成するために微調整することができます&lt;&gt; 10（商標）。たとえば、DGMPゲル層の間のスムーズな遷移が走化性などの細胞プロセスを研究する生物学的な手がかりの連続勾配を生成するために使用することができる。 ゲル剛性に密度調整剤の効果を15％aPEGdaゲルのため、図5に示されている。PEGDAとイオジキサノール濃度の関数としての剛性と気孔率のより完全な特性評価現在評価されている。この例ではPEGDA濃度が比較的高いですが、我々は、することなくゲルに比べて30％のイオジキサノールを含むゲルは60％以上の弾性率を観察した。ゲル剛性の変化を変調マクロマー濃度や架橋密度を調整することができる。 我々はまた、ポリアクリルアミドおよびPEG前駆体10を使用して 3D多層ゲルを作成するDGMP手法を適用している。濃度又はプレポリマーの架橋度を変化させることができにおける構造変化3Dで偏成長および移行などの細胞の挙動を調査するために使用することができる足場、。 要約すると、DGMPは、生物医学と基礎研究を幅広いアプリケーション向けに生体適合性材料の様々な2Dおよび3Dの足場を製造するために適用することができる、柔軟なテクニックです。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬またはインストゥルメント </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ポリエチレングリコールsuccinimydylカルボキシメチル（α-PEG-SCM） </td><td> Laysan </td><td> 120から64 </td></tr><tr><td> Polyethelyeneグリコールジアクリレート（PEGDA） </td><td> Dajacラボ</td><td> 9359 </td></tr><tr><td>アルギニン - グリシン - アスパラギン酸 - セリン（RGDS） </td><td>アメリカンペプチド</td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N、N -ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA） </td><td>シグマ</td><td> D125806 </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>シグマ</td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N、N-ジメチルホルムアミド（DMF） </td><td>フィッシャー</td><td> D119-4 </td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン（THF） </td><td>フィッシャー</td><td> T397 </td></tr><tr><td>透析カセット（3500ダ） </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 66330 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 350カルボン酸エステルsuccinimydyl </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> - 10168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td>シグマ</td><td> SL2 </td></tr><tr><td>シリコーンスペーサー</td><td>グレンジャー</td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td>生検パンチ</td><td> Acuderm </td><td> P1025（10ミリメートル） P850（8 mm）の</td></tr><tr><td> Dulbeccoリン酸（DPBS）緩衝生理食塩水</td><td> Hyclone社</td><td> SH30028 </td></tr><tr><td>イオジキサノール（NycoPrep） </td><td>フィッシャー</td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> 2 - ヒドロキシ-4&#39;-（2 - ヒドロキシエトキシ）-2 - メチル</td><td>シグマ</td><td> 410896 </td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 11054 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 10082 </td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 15140 </td></tr><tr><td> C2C12筋芽細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> MALDI </td><td>ブルカー</td><td> N / A </td></tr><tr><td> UVR-9000 </td><td> Bayco </td><td> UVR-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td>バイオ·ラッド</td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

密度勾配多層重合（dgmp）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

種類と生物学的刺激の濃度（ 例えば 、成長因子、阻害剤、または小分子）やマトリックス構造（ 例えば組成、濃度、またはマトリックスの剛性が）空間にわたって変化、調査の広い範囲を可能にする複雑な組織培養マトリックス、これらの変数は、細胞分化、移動、および他の現象にどのような影響を与えるかについて。階層化行列を作成する上での大きな課題は、各レイヤ1からの個々の成分の拡散せず、層界面の構造的完全性を維持している。これを達成するための現在の方法は、光パターニング2-3、リソグラフィ4、シーケンシャルfunctionalization5、6を凍結乾燥、マイクロフルイディクス7、またはそれらの多くは、洗練された計測機器や技術的なスキルを必要とする遠心分離8が含まれています。その他は9層の剥離につながる可能性があります個々の層の連続した添付ファイルに依存している</&gt;（商標）。 DGMPは密度10を変化させるレイヤーを作成するなどのような不活性イオジキサノール密度修飾子を使用することで、これらの問題を克服しています。密度修飾子は任意のプレポリマーまたは生物活性分子と混合することができるので、DGMPは各足場層をカスタマイズすることができます。彼らは水のままで単に密度調節剤の濃度を変化させることによって、隣接する層の混合を防ぐ。その後のシングルステップ重合は、各層が異なる化学的および機械的特性を有する構造的に連続多層足場を生じさせる。密度修飾子は、簡単に個々の層またはそのコンポーネントの摂動なしですすぎ十分に除去することができる。この技術は、それゆえ様々なサイズ、形状、材料のハイドロゲルを作成するための適している。 交互の層がRGDS-350を組み込むた2D-ポリエチレングリコール（PEG）でゲルを製造するためのプロトコルは、以下の通りです。我々は、PEG bを使用それは、生体適合性および不活性であるecause。 RGDS、細胞接着ペプチド11は 、生物学的な手がかりの空間的制約を示すために使用され、フルオロフォア（アレクサフルオル350）の接合は、私たちは視覚的に様々な層を区別することができますされています。この手順は、他の材料に適合させることができる（ 例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸など）と10いくつかの修正を加えて3Dゲルを作製するために拡張することができます。

MALDI-TOF分析はアクリロイル-PEG（ 図2）にRGDSペプチドの結合を確認します。ゲルイメージングは、光重合開始剤（ 図3A）の後RGDS-350（青）の交互層を明らかにする。 図3Aに示すように、2D DGMPゲルサイズはシリコーン型（左10ミリメートル; 8ミリメートル、右）の直径に基づいて変化させることができ、したがって、複数のアッセイにおける使用のために容易にカスタマイズ可能です-このケースに収まるように48ウェル細胞培養プレート（ 図3B）。 DGMPゲル上で培養したC2C12筋芽細胞の落射蛍光および位相差顕微鏡は、細胞接着ペプチド（RGDS）の区画を示す、RGDS-350-含有するPEG層（ 図4）で選択的結合を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> 図1。分子weigMALDI-TOFはRGDSペプチドの結合の後に得られたaPEG-RGDSにaPEG-SCMを比較することにより、HT分析。 <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> 図2。 DGMPゲル作製の模式図。勾配が積層された後、彼らは光重合続いメスインターフェイスを作成するために時間の期間（T S） を変化させるために解決させることができる。成層DGMPゲルは簡単にさらに使用するために金型から取り出すことができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="図3" /> 図3光重合後に得られた）2次元多層ゲルは350nmとVersaの白色光チャネルを使用して画像化ドクゲルドキュメンテーションユニット。画像が白でRGDSを含む交互層を明らかにする。B）は DGMPゲルの挿入を48ウェル細胞培養皿にグレースケール。 <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="図4" /> 図4 DGMPゲル（スケールバーは50μm）上に成長させたC2C12筋芽細胞の位相コントラストと落射蛍光画像を合併。 <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。ゲル表面の弾力性に関するイオジキサノールの効果。2 nNの力トリガ12を使用して、以前に確立された方法を用いて架橋したPEG基板の静的サンプルの原子間力顕微鏡の測定は。 * P &lt;0.05、** P &lt;0.01。

ここでは、組織工学のための異なった層の間の連続的なインタフェースを備えた生体適合性、階層化行列を作成するための独自の戦略を説明します。このような足場は、様々な生物学的、化学的または機械的な手がかりによって細胞の挙動を調節するのに理想的なカスタマイズ可能な環境を提供することができます

密度勾配多層重合（DGMP）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

この手順の全体的な目標は、多層の細胞培養スキャフォールドを作成することです。このビデオでは、接着ペプチドRGDSをC 2 C 12細胞の別々の領域に交互に組み込んで、2D細胞培養マトリックスを作製する方法を示します。これは、最初にRGDSペプチドをacro loyal macroにテザリングすることで達成されます。次に、マクロペプチドの組み合わせをLOR色素でタグ付けして、多層ゲルのペプチド含有層を可視化します。2番目のステップは、シリコンシートから型を切り出し、次の2つのスライドガラスの間に挟み込み、各層の個々のコンポーネントを混合して型を形成することです。peg di acrl と peg di acrl と PEG RGDS Alexa three 50 のソリューションは、金型内で交互に層状にされます。ゲルはUV照射により重合されます。最後のステップは、マトリックス組成が細胞の成長と接着にどのように影響するかを調べるために、2D多層ゲル上にC細胞2個をシードすることです。最終的に、明視野顕微鏡と蛍光顕微鏡を使用して、足場上のC 2 C 12細胞の選択的な増殖を視覚化します。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、多層の2Dおよび3D細胞培養マトリックスを作成するためのシンプルで費用対効果の高い方法であることです。高価な計装の必要性に依存しません。一方、レイヤー間のインターフェースは連続しており、構造的に不可欠です。個々のレイヤーのコンポーネント間で混合はありません。この方法は、パターン化された生物学的、化学的、機械的手がかりに応答して細胞がどのように移動し、分極するかなどの重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、細胞の遊走と分化に関する穏やかな洞察を提供することができ、ニューロン幹細胞の新たな右伸長やシナプス形成を指示するなどの他のシステムにも適用できます。この手順を開始するには、RGDSペプチドとアクロオイルペグスクシニルカルボメチルエステルを、アルゴンヌ下の乾燥DMSOで1対2対1モル比で組み合わせます。.次に、NNジオップ、プロピルメチルアミン、またはD-I-P-E-Aをaquilo PEG SCMに対して2対1のモル比で添加して反応を促進し、カビの生えたTOF質量分析を使用してaquilo PEG RGDS分子の結合を確認します。これとは別に、1マイクロリットルのAQUILO PEG RGDS反応溶液と1マイクロリットルの非反応性aquilo PEG SCMをカビの生えたターゲットの異なるスポットに加えます。両方を乾かします。次に、THF渦中で普遍的なカビの生えたマトリックスの飽和溶液を1分間調製し、同じ2つのスポットに1マイクロリットルを追加します。両方を乾かします。次に、サンプルをロードします。SAVIS ゴール、スムージング、トップハット、ベースライン減算、およびOIDピーク検出アルゴリズムを使用して、60ヘルツレーザーを約19%の出力でカビの生えたタフな分析を実行します。acro PEG RGDSの分子量は、共有結合ペプチドによる質量の変化に対応して、右にシフトする必要があります。次のステップは、等モル量のLORを添加することにより、3つの50カルボン酸がアキロイペグSCMに対してミダルエステルを吸い込み、最小量のDMSOに溶解したアキロペグSCMをアキロイグRGDS反応溶液に添加することにより、アルゴン下で室温で一晩インキュベートします。次に、3, 500 DAU分子量カットオフ透析カセットを使用して、摂氏4度の染料水に対して透析することにより、アクロオイルペグRGD S3 50を精製します。1001 容積比を使用して 48 時間透析を継続し、少なくとも 1 日 2 回冷水透析液を交換します。この製品は、0.22ミクロンのシリンジフィルターによるフィルター滅菌によりさらに精製されます。最後に、無菌環境で、無菌精製アクロオイルペグRGD S3 50を無菌の予備加重マイクロ遠心チューブに分注します。開いたマイクロ遠心分離チューブを滅菌ブリーザーチューブ内に密封します。サンプルを凍結乾燥し、各サンプルをパラフィンフィルムで密封し、マイナス20°Cで保存します。スライドを100%メタノールで予備洗浄し、液体が蒸発するまで摂氏80度のオーブンで乾燥させます。次に、スライドガラスが入った皿をドラフトに入れ、各スライドに250マイクロリットルのシグマコートを追加します。スライドを30秒間静かに揺らして、表面全体をコーティングします。次に、コーティングされたスライドを100%メタノールで十分にすすぎ、続いて洗浄して蒸留水で、少なくとも10ミリリットルの水に5分間2回浸します。すすぎたら、スライドを自然乾燥させます。シリコンシートをスライドガラスと同じ寸法にトリミングして、厚さ0.8mmのシリコンスペースを準備します。次に、生検パンチを使用して、かみそりの刃を使用して足場を保持するために、シリコンに10ミリメートルまたは8ミリメートルの穴を開けます。型の上部に約2ミリメートルのチャネルを作成して、足場材料を追加できるようにします。その後、シリコンスペースをオートクレーブし、シグマコート処理されたスライドガラスを滅菌します。また、アイナーチューブや鉗子など、ゲルをキャストするための追加の材料を滅菌します。組織培養フードフィルターで、滅菌済みの1ミリリットルシリンジと0.2ミクロンフィルターを使用して、Peg di aquilのストック溶液を滅菌します。個々の琥珀色のマイクロリフューズチューブの各層のそれぞれの層の体積比に15%の重量でPEGプレポリマー溶液を配合することから始め、50%PEG D acrlを異なる量の滅菌60%IO DALストック溶液PBSと光開始剤と組み合わせて、10%20%30%と40%Iオールの異なる最終濃度を徹底的に混合して溶液を混合し、蛍光標識された15%PEGプレポリマー溶液を調製します。 最終濃度8ミリモルの50%PEG di aquilとaquilo PEG RGD S3 50を組み合わせ、IO Dalストック溶液PBSと琥珀色のマイクロビューチューブ内のフォトイニシエーターを配合して、溶液を15%25%および35%IO ILANの濃度で完全に混合します。次に、シグマ共同処理された2枚のスライドガラスの間にプレカットスペーサーを挟み、クランプで固定して、金型のセットアップを組み立てます。金型が組み立てられたら、最初に10マイクロリットルの40%溶液を追加し、次に蛍光標識された10マイクロリットルの35%溶液を追加して、層状ゲルをキャストします。交互のレイヤー化を繰り返して、複数のレイヤーを実現します。次に、金型に365ナノメートルの光を3分間照射します。ポータブルUVR 9, 000ランプを使用して、重合したヒドロゲルを5分間硬化させます。次に、クランプを取り外し、上部のスライドガラスと型をそっと持ち上げます。層別密度勾配。マルチレイド重合ゲルまたはDG MPゲルはスライド上に残ります。滅菌ヘラを使用して、ゲルを型から慎重に取り出し、滅菌DMEMを含む50ミリリットルのチューブに入れます。重合ゲルを1000対1の容量比のDMEMを用いて48時間、1日2回のバッファー交換で洗浄します。これにより、密度、改質剤、光開始剤、および反応プレポリマーが除去されます。次に、DGMPゲルを1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEMに保存します。.交互の層を視覚化するには、ゲルドキュメンテーションユニットのサンプルトレイ上の定規に沿ってDGMPゲルを配置します。次に、DGMPハイドロゲル中のAlexa 3 50の交互の暗いバンドと青色のバンドを使用してゲルを露光し、イメージングすると、異なる化学組成の目立たない層が形成されることが示されています。DGMPゲルを細胞培養用に調製するには、48ウェル細胞培養プレートのウェルにゆっくりと挿入します。滅菌細胞スクレーパーを使用し、細胞培養培地で3回すすぎます。次に、100 mm細胞培養プレートからC 2つのC 12筋芽細胞を、60%コンフルエントな場合に回収します。これを行うには、プレートを予温PBSで3回すすぎます。次に、EDTAで0.25%tripsの1ミリリットルを追加し、プレートを摂氏37度で2分間インキュベートします。細胞が分離したら、1ミリリットルのプレウォーム培養培地を加え、細胞を50ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。細胞をペレット化した後、増殖培地にペンで入れ、トライアムブルーを添加し、TC 10セルカウンターを使用して生細胞をカウントします。次に、DG MPスキャフォールドにC、12筋芽細胞を2つ播種し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間インキュベートします。落射蛍光顕微鏡と位相差顕微鏡を使用して、DGMPゲルの層を含むRGDS上のC 2 C 12筋芽細胞の付着を確認します。DGMPゲルの交互の層には、右図に示すRGDSのような様々なペプチドが含まれていることがあり、これが細胞の接着と増殖をサポートします。しかし、左側の層には細胞接着ペプチドが含まれておらず、その領域では細胞が生き残れませんでした。IOジオールはゲルの硬さに影響を与える可能性があります。ここでは、原子間力顕微鏡を用いて弾性率を測定しました。このゲル配合で30%IALを使用すると、剛性が60%増加し、ILALがゲルの剛性に及ぼす影響は、使用されている材料によって異なりますこの手順を試みる際には、層の順序を覚えておくことが重要です。IEX ヌルの量が最も多いレイヤーが一番下になり、IEX ヌルの量が最も少ないレイヤーが一番上になります。周囲光からの重合を防ぐために、常に最後にフォトイニシエーターを追加することを忘れないでください。私たちは共同研究者とともに、この手法を応用して、神経突起の成長を3Dで整理しています。これにより、健康な個人に由来する神経前駆細胞と神経発達障害のある患者に由来する神経前駆細胞の比較が可能になります。紫外線での作業は危険な場合があることを忘れないでください。架橋ステップを実行するときは、UV保護メガネを着用してください。

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学ぶ 密度勾配多層重合（DGMP）法による多層細胞培養足場の作製。RGDSペプチドとC2C12細胞を用いて、基質組成が細胞接着と増殖に与える影響を可視化する簡便で低コストな組織工学技術です。

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