密度勾配多層重合（DGMP）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場

この手順の全体的な目標は、多層の細胞培養スキャフォールドを作成することです。このビデオでは、接着ペプチドRGDSをC 2 C 12細胞の別々の領域に交互に組み込んで、2D細胞培養マトリックスを作製する方法を示します。これは、最初にRGDSペプチドをacro loyal macroにテザリングすることで達成されます。

次に、マクロペプチドの組み合わせをLOR色素でタグ付けして、多層ゲルのペプチド含有層を可視化します。2番目のステップは、シリコンシートから型を切り出し、次の2つのスライドガラスの間に挟み込み、各層の個々のコンポーネントを混合して型を形成することです。peg di acrl と peg di acrl と PEG RGDS Alexa three 50 のソリューションは、金型内で交互に層状にされます。

ゲルはUV照射により重合されます。最後のステップは、マトリックス組成が細胞の成長と接着にどのように影響するかを調べるために、2D多層ゲル上にC細胞2個をシードすることです。最終的に、明視野顕微鏡と蛍光顕微鏡を使用して、足場上のC 2 C 12細胞の選択的な増殖を視覚化します。

この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、多層の2Dおよび3D細胞培養マトリックスを作成するためのシンプルで費用対効果の高い方法であることです。高価な計装の必要性に依存しません。一方、レイヤー間のインターフェースは連続しており、構造的に不可欠です。

個々のレイヤーのコンポーネント間で混合はありません。この方法は、パターン化された生物学的、化学的、機械的手がかりに応答して細胞がどのように移動し、分極するかなどの重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、細胞の遊走と分化に関する穏やかな洞察を提供することができ、ニューロン幹細胞の新たな右伸長やシナプス形成を指示するなどの他のシステムにも適用できます。

この手順を開始するには、RGDSペプチドとアクロオイルペグスクシニルカルボメチルエステルを、アルゴンヌ下の乾燥DMSOで1対2対1モル比で組み合わせます。.次に、NNジオップ、プロピルメチルアミン、またはD-I-P-E-Aをaquilo PEG SCMに対して2対1のモル比で添加して反応を促進し、カビの生えたTOF質量分析を使用してaquilo PEG RGDS分子の結合を確認します。これとは別に、1マイクロリットルのAQUILO PEG RGDS反応溶液と1マイクロリットルの非反応性aquilo PEG SCMをカビの生えたターゲットの異なるスポットに加えます。

両方を乾かします。次に、THF渦中で普遍的なカビの生えたマトリックスの飽和溶液を1分間調製し、同じ2つのスポットに1マイクロリットルを追加します。両方を乾かします。

次に、サンプルをロードします。SAVIS ゴール、スムージング、トップハット、ベースライン減算、およびOIDピーク検出アルゴリズムを使用して、60ヘルツレーザーを約19%の出力でカビの生えたタフな分析を実行します。acro PEG RGDSの分子量は、共有結合ペプチドによる質量の変化に対応して、右にシフトする必要があります。

次のステップは、等モル量のLORを添加することにより、3つの50カルボン酸がアキロイペグSCMに対してミダルエステルを吸い込み、最小量のDMSOに溶解したアキロペグSCMをアキロイグRGDS反応溶液に添加することにより、アルゴン下で室温で一晩インキュベートします。次に、3, 500 DAU分子量カットオフ透析カセットを使用して、摂氏4度の染料水に対して透析することにより、アクロオイルペグRGD S3 50を精製します。1001 容積比を使用して 48 時間透析を継続し、少なくとも 1 日 2 回冷水透析液を交換します。

この製品は、0.22ミクロンのシリンジフィルターによるフィルター滅菌によりさらに精製されます。最後に、無菌環境で、無菌精製アクロオイルペグRGD S3 50を無菌の予備加重マイクロ遠心チューブに分注します。開いたマイクロ遠心分離チューブを滅菌ブリーザーチューブ内に密封します。

サンプルを凍結乾燥し、各サンプルをパラフィンフィルムで密封し、マイナス20°Cで保存します。スライドを100%メタノールで予備洗浄し、液体が蒸発するまで摂氏80度のオーブンで乾燥させます。次に、スライドガラスが入った皿をドラフトに入れ、各スライドに250マイクロリットルのシグマコートを追加します。

スライドを30秒間静かに揺らして、表面全体をコーティングします。次に、コーティングされたスライドを100%メタノールで十分にすすぎ、続いて洗浄して蒸留水で、少なくとも10ミリリットルの水に5分間2回浸します。すすぎたら、スライドを自然乾燥させます。

シリコンシートをスライドガラスと同じ寸法にトリミングして、厚さ0.8mmのシリコンスペースを準備します。次に、生検パンチを使用して、かみそりの刃を使用して足場を保持するために、シリコンに10ミリメートルまたは8ミリメートルの穴を開けます。型の上部に約2ミリメートルのチャネルを作成して、足場材料を追加できるようにします。

その後、シリコンスペースをオートクレーブし、シグマコート処理されたスライドガラスを滅菌します。また、アイナーチューブや鉗子など、ゲルをキャストするための追加の材料を滅菌します。組織培養フードフィルターで、滅菌済みの1ミリリットルシリンジと0.2ミクロンフィルターを使用して、Peg di aquilのストック溶液を滅菌します。

個々の琥珀色のマイクロリフューズチューブの各層のそれぞれの層の体積比に15%の重量でPEGプレポリマー溶液を配合することから始め、50%PEG D acrlを異なる量の滅菌60%IO DALストック溶液PBSと光開始剤と組み合わせて、10%20%30%と40%Iオールの異なる最終濃度を徹底的に混合して溶液を混合し、蛍光標識された15%PEGプレポリマー溶液を調製します。 最終濃度8ミリモルの50%PEG di aquilとaquilo PEG RGD S3 50を組み合わせ、IO Dalストック溶液PBSと琥珀色のマイクロビューチューブ内のフォトイニシエーターを配合して、溶液を15%25%および35%IO ILANの濃度で完全に混合します。次に、シグマ共同処理された2枚のスライドガラスの間にプレカットスペーサーを挟み、クランプで固定して、金型のセットアップを組み立てます。金型が組み立てられたら、最初に10マイクロリットルの40%溶液を追加し、次に蛍光標識された10マイクロリットルの35%溶液を追加して、層状ゲルをキャストします。

交互のレイヤー化を繰り返して、複数のレイヤーを実現します。次に、金型に365ナノメートルの光を3分間照射します。ポータブルUVR 9, 000ランプを使用して、重合したヒドロゲルを5分間硬化させます。

次に、クランプを取り外し、上部のスライドガラスと型をそっと持ち上げます。層別密度勾配。マルチレイド重合ゲルまたはDG MPゲルはスライド上に残ります。

滅菌ヘラを使用して、ゲルを型から慎重に取り出し、滅菌DMEMを含む50ミリリットルのチューブに入れます。重合ゲルを1000対1の容量比のDMEMを用いて48時間、1日2回のバッファー交換で洗浄します。これにより、密度、改質剤、光開始剤、および反応プレポリマーが除去されます。

次に、DGMPゲルを1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEMに保存します。.交互の層を視覚化するには、ゲルドキュメンテーションユニットのサンプルトレイ上の定規に沿ってDGMPゲルを配置します。次に、DGMPハイドロゲル中のAlexa 3 50の交互の暗いバンドと青色のバンドを使用してゲルを露光し、イメージングすると、異なる化学組成の目立たない層が形成されることが示されています。

DGMPゲルを細胞培養用に調製するには、48ウェル細胞培養プレートのウェルにゆっくりと挿入します。滅菌細胞スクレーパーを使用し、細胞培養培地で3回すすぎます。次に、100 mm細胞培養プレートからC 2つのC 12筋芽細胞を、60%コンフルエントな場合に回収します。

これを行うには、プレートを予温PBSで3回すすぎます。次に、EDTAで0.25%tripsの1ミリリットルを追加し、プレートを摂氏37度で2分間インキュベートします。細胞が分離したら、1ミリリットルのプレウォーム培養培地を加え、細胞を50ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。

細胞をペレット化した後、増殖培地にペンで入れ、トライアムブルーを添加し、TC 10セルカウンターを使用して生細胞をカウントします。次に、DG MPスキャフォールドにC、12筋芽細胞を2つ播種し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間インキュベートします。落射蛍光顕微鏡と位相差顕微鏡を使用して、DGMPゲルの層を含むRGDS上のC 2 C 12筋芽細胞の付着を確認します。

DGMPゲルの交互の層には、右図に示すRGDSのような様々なペプチドが含まれていることがあり、これが細胞の接着と増殖をサポートします。しかし、左側の層には細胞接着ペプチドが含まれておらず、その領域では細胞が生き残れませんでした。IOジオールはゲルの硬さに影響を与える可能性があります。

ここでは、原子間力顕微鏡を用いて弾性率を測定しました。このゲル配合で30%IALを使用すると、剛性が60%増加し、ILALがゲルの剛性に及ぼす影響は、使用されている材料によって異なりますこの手順を試みる際には、層の順序を覚えておくことが重要です。IEX ヌルの量が最も多いレイヤーが一番下になり、IEX ヌルの量が最も少ないレイヤーが一番上になります。

周囲光からの重合を防ぐために、常に最後にフォトイニシエーターを追加することを忘れないでください。私たちは共同研究者とともに、この手法を応用して、神経突起の成長を3Dで整理しています。これにより、健康な個人に由来する神経前駆細胞と神経発達障害のある患者に由来する神経前駆細胞の比較が可能になります。

紫外線での作業は危険な場合があることを忘れないでください。架橋ステップを実行するときは、UV保護メガネを着用してください。