クッパー胞における遺伝子機能と繊毛発生する流体の流れの可視化の分析

この手順の目的は、左右のパターン形成に関与するゼブラフィッシュ胚のKavas小胞またはKVの機能遺伝子を調節し、蛍光ビーズをkvに送達することによりmotil cliaによって生成される非対称流体の流れを解析することです。これは、最初に、特定の目的の遺伝子の発現を抑制する蛍光形態オリゴヌクレオチドを中期Dilla期胚の卵黄細胞に注入することにより達成され、kvを生じさせる背側フォアランナー細胞にロードされます。次に、卵黄細胞とkvにのみ蛍光形態を持つ注入された胚を、さらなる分析のために選択します。

次に、胚を陥没スライドにマウントし、蛍光ビーズをkvの液体で満たされた小胞内腔に注入します。最後に、ビデオ顕微鏡を使用して、kv内を流れるビーズを記録します。最終的には、KV内の候補遺伝子の組織特異的な枯渇がビーズの動きの定量分析を通じて非対称流体の流れを変化させるかどうかを判断する結果を得ることができます。

ステージ特異的なモリノ注射と蛍光ビーズ注射は、どちらも胚の命題と実験の発生タイミングに依存するため、習得が難しいため、今学期のウイルス実証は重要です。グローバルモーフまたはMO注射を行うには、受精直後に胚を採取し、注入プレートにロードします。ピペットを過ぎて磨いた火を使用して、胚を注入プレートに入れ、胚を固定します。

注射針の先端を折って注入設定を調整し、1ナノリットルの体積の注入液滴を作成します。解剖顕微鏡を使用して、1ナノリットルのMOを1〜4細胞段階の間の少なくとも50個の胚のヨークに注入します。DFCを標的としたM mo注射の場合、受精直後に胚を採取し、摂氏28.5度でインキュベートします。

胚が256細胞期に達したら、すぐに注入プレートにロードし、1ナノリットルの蛍光MOを卵黄に注入します。256〜1000の細胞段階の間に少なくとも100個の胚を注入して、卵黄を標的とした注射を行います。受精卵をドームステージにインキュベートした後、ドームステージと30%アレプライステージの間の少なくとも100個の胚のヨークに1ナノリットルの蛍光MOを注入します。

M mo注入された胚が75%a層の段階に達するとき。未受精および死んだ胚を解剖顕微鏡で除去し、全体的なMO注射を行います。すべての細胞に均一に分布する蛍光を発する生きた胚を選択します。

DFCを標的としたM mo注射では、蛍光が卵黄全体に拡散し、背側ブラストされた皮膚縁に集中している胚を選択します。卵黄を標的としたMO注射用。蛍光が卵黄全体に均一に分布し、2〜4個の胚細胞では観察されない胚を選択します。

だからダニの段階。KV細胞と卵黄でのみ蛍光を示すDFC標的胚を選択し、残りは卵黄標的注射のために廃棄します。MO注入胚のKVの非対称流動を解析するために、卵黄のみに蛍光を発する胚を選別し、まず鋭利な鉗子を用いて、4個から6個の胚の間に約20個の胚を丁寧にコーティングします。

また、ステージは1つの胚をガラスのくぼみスライドに移し、できるだけ多くの水分を取り除くこともできます。エアロが固まるときに胚を覆うのに十分な暖かい1%低融点エアロを追加して、胚を固定します。鉗子を使用して、KVが上を向くように配置し、10個の胚をすばやく取り付けて、すべての注入が10個までに完了するようにします。

だからダニの段階。直径0.5ミクロンの蛍光マイクロビーズを滅菌水で1〜50に希釈した後。ビーズを十分に混合し、MO注射に使用したのと同じマイクロインジェクターを使用して、3マイクロリットルを毛細血管針にロードします。

鉗子を使用して針先を折らし、注入設定を調整して、可能な限り最小の注入を生成します。落とす。次に、解剖顕微鏡下で、針を最初に取り付けた胚のKV内腔に合わせます。次に、針を内腔に挿入し、0.5ナノリットル未満のビーズを注入します。

直立した蛍光顕微鏡の下で胚が乾燥するのを防ぐために、arosに滅菌水を一滴加えます。20倍の対物レンズスクリーニングを使用して、選択した各胚のビーズを成功裏に送達し、KV内のビーズを滅菌水滴でアロを覆います。次に、63 x 水浸対物レンズを備えた蛍光化合物顕微鏡を使用して観察します。

顕微鏡に搭載したハイスピードカメラで10秒の動画を撮影します。蛍光チャンネルを使用してビーズを約70フレーム/秒で記録し、明視野または微分干渉コントラストを使用してKVルーメンを記録します。ムービーをImage J.Create最大投影法にインポートし、ソフトウェアを使用して個々のビーズの動きを追跡します。

この図は、成功したステージ特異的生胚における蛍光MOの分布を示しています。溶液が卵黄細胞に凝集したままであるMO注入の失敗をここに示します。正常に注入された胚の流体の流れは、通常のフロービーズを持つ対照胚で定性的または定量的に測定できます。

反時計回りの経路をたどります。この経路は、蛍光ビーズの位置を経時的に最大限に投影するか、個々のビーズを経時的に追跡することで視覚化できます。協調流胚の喪失を実証するために、列キナーゼ2Bまたは岩石2Bを分解するためにMOを注入し、これにより流れが乱され、その結果、ビーズはkv内をランダムに移動し、コントロールおよび岩石2Bのmo胚からの5つのビーズの平均速度が、その発生後にここに示されている。この技術により、発生生物学分野の研究者がゼブラフィッシュの左右体へのアクセスを確立するための遺伝子とメカニズムを探求する道が開かれました。