高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

この手順の全体的な目標は、治療された前立腺腫瘍細胞の定量的画像を取得して、さまざまな時点でのオートファジーの程度と程度を測定することです。これは、まず細胞をアルギニン、DASE、またはその他の実験試薬で処理してオートファジーや細胞死を誘導することで達成されます。2番目のステップは、生細胞をイメージングするか固定細胞をイメージングするかを決定し、それに応じてサンプルを調製することです。

次に、広視野、デコンボリューション、または構造化照明蛍光顕微鏡を使用して、生細胞または固定細胞の3D蛍光画像を取得します。最後のステップは、オートファゴソームのサイズ分布と他の細胞内構造との共局在に関する統計データを収集することです。デジタル3D画像解析ソフトウェアを使用すると、このアプローチでは、アルギニンダーゼによる自動ファージ誘導が前立腺腫瘍細胞死を引き起こすだけでなく、これらの細胞がアポトーシスや壊死に関連する変化とは異なる形態学的に異なる構造変化を示す結果を得ることができます。

この技術の主な利点は、他の既存の方法よりも定量的な3Dイメージングが、生細胞内で発生する特定の分子イベントがいつ、どこで発生し、その後、それを3次元形式で提示することができることです 緑色蛍光タンパク質を発現するヒト前立腺癌細胞を成長させ始めるには、テキストプロトコル細胞に記載されているように、35ミリメートルのポリデリシンコーティングガラス底培養皿に3つの結合光鎖をめっきする必要があります急速な増殖を促進するのに十分な密度で、しかしイメージングの時までに細胞が生い茂って凝集するほどではありません。選択した細胞サンプルをアルギニンDASEまたはPBSのDIで処理して、遊離アルギニンの細胞を枯渇させ、イメージングの約1時間前に癌細胞に代謝ストレスを誘発し、1.5マイクロリットルのLyo tracker redを10%FPSと1%抗生物質を含む20ミリリットルのRPMIで希釈します。すべての培地を摂氏37度に温めた後に処理した選択したサンプルのDIを含む溶液を調製します。

各培養皿に適切な培地を添加し、イメージングの約30分前に、LYO Tracker redを含むRPMIを含む細胞を摂氏37度で15〜45分間インキュベートします。ウェザーステーションの環境エンクロージャーをオンにし、摂氏37度と5%二酸化炭素に平衡化し、細胞をPBSで洗浄し、培地を10%FBSと1%抗生物質のみを含む標準RPMIに交換します。示されているように、サンプルにDIを追加します。

35ミリメートルカバーガラス底培養皿をカスタマイズされたアダプターに取り付けます。倍率6倍、開口数1.42の対物レンズに液浸油を使用し、取り付けた培養皿を顕微鏡ステージ上に置きます。このビデオでは、Delta vision personal IDV applied position、deconvolution microscope、Associated Soft Worksアプリケーションスイートを使用して、3D顕微鏡のデモを行っています。

まず、取得ワークステーションと機器コントローラーを含む顕微鏡システムの電源を入れます。リゾルブ3Dコンピュータ制御アプリケーションを開き、顕微鏡ステージを初期化し、キセノン光源をオンにします。光源がウォームアップして安定した状態に達するまで10分待ちます。

倍率6倍、開口数1.42の対物レンズに液浸油を一滴加え、カバースリップを下にしてスライド試料を対物レンズの中央に置き、明視野または外部照明と粗い焦点を使用します。調整ノブ 浸漬油のビートが倒立カバーガラスに接触するまで、対物レンズをゆっくりと上げます。この時点から、ファインフォーカス調整ノブを数回回すだけでセル層にピントが合うはずです。

スライド上の固定サンプルを扱う場合は、気泡のある領域内または近くのセルを避けることをお勧めします。ガラス底皿に生きたサンプルを載せて見るときは、対物レンズをガラスカバースリップの境界外に動かさないでください。目的の視野を選択します。

理想的には、細胞はすべての適切なチャネルで良好な蛍光シグナルを示し、細胞内内容物が視覚化しやすいようにカバースリップ表面に十分に付着して広げる必要があります。横方向のX、Y、Zフォーカスの微調整は、コンピューターが取得3Dインターフェースを使用して制御できます。セルの中央部を通る特定の画像の視野に応じて、ベニングを1つずつまたは2つずつ設定し、最大ピクセル強度が3000カウントを超えないように露出パラメータを設定します。

一般に、透過率は、対応する露出を増やさずに、できるだけ低く設定する必要があります。1秒以上の時間。イメージングするすべての蛍光色と、個別の視野ごとにこの手順を繰り返します。

最高品質の画像を得るには、Zackの上限と下限を、セルサンプルの上部と下部にそれぞれわずかにフォーカスを調整して設定します。したがって、特定のZスタック内の画像の総数は、これらの制限とレイヤー間の間隔によって決定されます。画像取得中のモーションアーチファクトを最小限に抑えるために、画像取得モードを波長に設定できます。

次に、固定サンプル用のZSスタックとライブサンプル用の波長スタック。すべてのパラメータを設定した後、蛍光画像を取得できます。その後、蛍光画像はソフトワークを使用して展開され、後で速度を使用して分析されます。

ここに示す画像配列は、オートファジー誘導の最初の80分間にcwr 22細胞で起こる物理的変化を示しています。これらの画像では、白い点線が細胞の輪郭を表し、明るい影付きの領域が核の位置を表しています。80分間の画像では、細胞中心からの核の移動、焦点接着点の減少、細胞の中心への常染色体とリソソームの一般的な転座が明らかになっています。

また、常染色体とリソソームの間では、黄色で示されているように、共局在のわずかな増加も観察されました。次に、Velocity Digital Imagingアプリケーションスイートを使用して、CWR 22細胞の画像中の標識常染色体とリソソームの統計データを同定、カウント、および収集しました。ここに示されているのは、出現時に最初に形成された後の常染色体の数とサイズは時間とともに変化します。

オートファジー導入の80分後、常染色体の数が徐々に減少し、それに対応して常染色体の平均サイズが増加しました。さらに、Pearsonの相関係数分析に基づいて、常染色体とリソソームの共局在化に測定可能な増加が見られました。これらの知見を総合すると、オートファジーを刺激すると、多数の小さな常染色体が時間の経過とともにより大きな常染色体を形成することが示唆されました。

ここに示されているのは、DVモード、シミュレートされた広視野デコンボリューション、構造化照明モードで取得および再構成された画像を並べて比較したものです。OMX顕微鏡を使用すると、横方向の分解能が従来の回折限界顕微鏡の2倍の最大120ナノメートルに向上しました。常染色体とリソソームの小規模な共局在は、超解像顕微鏡法ではっきりと明らかになりましたが、従来の蛍光イメージングではほとんど明らかではありませんでした。

デコンボリューション顕微鏡を使用する利点の1つは、すべての画像を3Dモデルに再構築して、異なる分子間のより正確な空間情報を明らかにすることです。ここに示されているのは、Cwr 22 RVの1つの細胞が、常染色体とリソソームの間でかなりの量の共局在が起こり始める後の時点でオートファジーを受けていることの全体像です。白色で示されているeコヒーレント染色は、この動画の標的細胞の輪郭を明らかにしています。

3D再構成モデルは、常染色体とリソソームの融合について、より空間的な詳細を提供します。黄色で示されているように、緑色の軽鎖3つのシグナルと赤色のリソソームシグナルとの間の相互作用は、結合したシグナルの存在下で明らかであり、黄色を生成します。したがって、このアプローチは、オートファジーを研究する研究者にとって2つの主要な課題に対処することになります。

まず、顕微鏡ステージ上で本来の生理状態を保つために、マイクロ流体であるプロフュージョンチャンバーを使用することで、ストレスフリーな環境を維持したいと考えています。2つ目の課題は、統計的に関連性のある定量的な画像データを収集することであり、固定された細胞については、通常、さまざまな細胞から多くの画像を取り出し、それらを有用な情報にまとめます。しかし、生命細胞では、1つの細胞を時間をかけて追うだけで、同等の情報を得ることができます。

したがって、この技術により、他の研究者がさまざまな臓器やさまざまな疾患におけるオートファジーの機能と役割を研究できるようになると信じています。