高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

この手順の全体的な目的は、処理した前立腺腫瘍細胞の定量的な画像を取得し、異なる時点におけるオートファジーの程度と範囲を測定することです。まず、細胞をアルギニン、dase、またはその他の実験用試薬で処理して、オートファジーおよび/または細胞死を誘導します。次に、生細胞をイメージングするか固定細胞をイメージングするかを決定し、それに応じてサンプルを調製します。

次に、ワイドフィールド、デコンボリューション、または構造照明蛍光顕微鏡を用いて、生細胞または固定細胞の3D蛍光画像を取得します。最終ステップは、オートファゴソームのサイズ分布および他の細胞内構造との共局在に関する統計データを収集することです。デジタル3D画像解析ソフトウェアを用いたこの手法により、アルギニン分解酵素によるオートファジー誘導が前立腺腫瘍細胞の死を招くだけでなく、これらの細胞がアポトーシスやネクローシスに伴う変化とは形態学的に異なる構造変化を示すという結果を得ることができます。

この手法の既存の他手法に対する主な利点は、生細胞内で特定の分子イベントがいつ、どこで発生しているかを定量的な3Dイメージングで示し、それを三次元形式で提示できることです。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、緑色蛍光タンパク質およびライトチェーン3を共発現させたヒト前立腺がん細胞を、35 mmポリリシンコートガラスボトム培養皿で培養します。細胞は、急速な増殖を促進するのに十分な密度で播種する必要がありますが、イメージング時までに細胞が過剰に増殖し、凝集しないように注意してください。イメージングの約1時間前に、選定した細胞サンプルをPBS中のアルギニンデアミナーゼ（ADI）で処理し、細胞内の遊離アルギニンを枯渇させてがん細胞に代謝ストレスを誘導します。1.5 µLのLysoTracker Redを、10% FBSおよび1% 抗生物質を含む20 mLのRPMIで希釈します。すべての培地を37 °Cに加温した後、ADIで処理した選定サンプル用の溶液を調製します。

各培養皿に適切な培地を加え、イメージングの約30分前に、LysoTracker Redを含むRPMIを用いて細胞を37°Cで15〜45分間インキュベートします。ウェザーステーション環境エンクロージャーの電源を入れ、37°Cおよび5% carbon dioxideに平衡化させます。細胞をPBSで洗浄し、培地を10% FBSおよび1% antibioticsのみを含む標準的なRPMIに交換します。指示通りにサンプルにDIを添加します。

35 mmのカバーガラス底培養皿を専用のアダプターに取り付けます。60倍の倍率、開口数1.42の浸液対物レンズにイマージョンオイルを使用し、取り付けた培養皿を顕微鏡ステージ上に配置します。このビデオでは、Delta vision personal IDV applied position デコンボリューション顕微鏡および関連するSoft Worksアプリケーションスイートを用いた3D顕微鏡法を実演します。

まず、データ収集ワークステーションと装置コントローラーを含む顕微鏡システムを起動します。Resolve 3Dコンピュータ制御アプリケーションを開き、顕微鏡ステージを初期化してキセノン光源を点灯させます。光源がウォームアップされ、安定した状態になるまで10分間待ちます。

60倍の倍率、開口数 1.42 の浸液対物レンズに浸液を1滴滴下し、明視野照明または外部照明および粗動調整ノブを用いて、カバーガラス面を下にしてスライド標本を対物レンズの中央に合わせます。粗動調整ノブをゆっくりと回して対物レンズを上げ、浸液の滴が倒立したカバーガラスに接触するようにします。ここから微動調整ノブを数回回すと、細胞層にピントが合います。

スライド上の固定試料を用いる場合は、気泡がある領域内またはその付近の細胞を避けることが推奨されます。ガラスボトムディッシュを用いて生細胞を観察する場合は、対物レンズをカバーガラスの境界外に移動させないようにしてください。目的の視野を選択します。

理想的には、細胞はすべての適切なチャンネルで良好な蛍光信号を示し、細胞内コンテンツを容易に可視化できるよう、カバースリップ表面に十分に接着し展延している必要があります。X、Y、Z方向の側方および焦点の微調整は、acquire 3Dインターフェースを使用してコンピューターで制御できます。細胞の中断面における所望の視野に応じて、binningを1×1または2×2に設定し、最大ピクセル強度が3000カウントを超えないように露光パラメータを設定してください。

一般的に、透過率は、対応する露光時間を長くすることなく、可能な限り低く設定する必要があります。時間は1秒以上に設定してください。この手順を、イメージングするすべての蛍光色および各視野について繰り返します。

最高品質の画像を得るには、細胞サンプルの上端と下端をそれぞれわずかに超えるようにフォーカスを調整し、Zスタックの上限と下限を設定します。これにより、特定のZスタックにおける総画像数は、これらの制限範囲と層間の間隔によって決定されます。画像取得中のモーションアーチファクトを最小限に抑えるには、画像取得モードを波長に設定できます。

次に、固定試料ではZSスタックを、生細胞試料ではZSスタックに続いて波長を選択します。すべてのパラメータを設定した後、蛍光画像を取得できます。その後、ソフトウェアを用いて蛍光画像のデコンボリューションを行い、Velocityを用いて解析します。

ここに示す一連の画像は、オートファジー誘導後の最初の80分間にcwr 22細胞に起こる物理的変化を示しています。これらの画像において、白の点線は細胞の輪郭を、薄い網掛け領域は核の位置を表しています。80分間にわたる画像から、核が細胞中心から移動すること、焦点接着点が減少すること、および常染色体とリソソームが細胞中心に向かって全体的に転位することがわかります。これらは、後のタイムポイントにおいて、それぞれ緑色と赤色で表示されています。

黄色い色で示されているように、常染色体とリソソームの間にも共局在のわずかな増加が観察されました。その後、Velocity Digital imaging application suiteを用いて、CWR 22細胞の画像内の標識された常染色体およびリソソームの特定、カウント、および統計データの収集を行いました。ここに示すように、出現時の初期形成後の常染色体の数とサイズは、時間とともに変動します。

オートファジー誘導から80分後、オートファゴソームの数は徐々に減少し、それに伴いオートファゴソームの平均サイズが増加しました。加えて、ピアソン相関係数による解析に基づき、オートファゴソームとリソソームの共局在に測定可能な増加が認められました。以上の結果から、オートファジーの刺激により、多数の小さなオートファゴソームが時間の経過とともに融合し、より大きなオートファゴソームを形成したことが示唆されました。

ここでは、DVモードで取得・再構成された画像、シミュレーションによる広視野デコンボリューション、および構造照明モードの比較を並べて示しています。OMX顕微鏡を使用することで、横方向の分解能が最大120 nanometersまで向上し、従来の回折限界顕微鏡の2倍の分解能が得られました。超解像顕微鏡では、オートソームとリソソームの小規模な共局在が明確に認められましたが、従来の蛍光イメージングではほとんど確認できませんでした。

デコンボリューション顕微鏡を使用する利点の一つは、すべての画像を3Dモデルに再構築することで、異なる分子間のより正確な空間情報を明らかにできることです。ここでは、オートファジーが進行しているCwr 22 RV細胞の全体像を、オートファゴソームとリソソームの間で顕著な共局在が起こり始めた後半の時間時点で示しています。白色で示された一貫した染色は、この動画における標的細胞の輪郭を表しています。

3D再構成モデルにより、常染色体とリソソームの融合に関するより詳細な空間情報が得られます。黄色で示されているように、緑色のライトチェーン3シグナルと赤色のリソソームシグナルの相互作用は、それらがマージされて黄色となることで明確に確認できます。したがって、この手法はオートファジーを研究する研究者が直面する2つの大きな課題を解決することになります。

まず、顕微鏡ステージ上で元の生理的条件を維持するため、マイクロ流体装置である灌流チャンバーを用いて、ストレスのない環境を維持します。2つ目の課題は、統計的に有意な定量的画像データを収集することです。固定細胞の場合、通常は異なる多くの細胞から大量の画像を撮影し、それらを有用な情報にまとめます。しかし、生細胞では、1つの細胞を経時的に追跡することで、同等の情報を取得します。

したがって、本手法を用いることで、他の研究者がさまざまな臓器や疾患におけるオートファジーの機能および役割を研究できると考えています。