鉄源としてヒトヘモグロビンを用いた黄色ブドウ球菌の成長

この実験では、黄色ブドウ球菌がヒトヘモグロビンを唯一の鉄源として利用する能力をテストします。まず、新鮮な人間の血液から赤血球を分離します。高速液体クロマトグラフィーでヘモグロビンを精製し、ヘモグロビンの完全性を確保します。

次に、ヘモグロビンをヘモグロビンネクストカルチャーの形で鉄を供給するために、鉄が枯渇した培地にヘモグロビンを加えます。S reus.ヘモグロビンの存在下で、鉄源としてヘモグロビンを利用する能力を測定します。

結果は、レウスが唯一の鉄源としてヘモグロビンの存在下で増殖することを示しています。この方法は、病原体が鉄の供給源として宿主タンパク質を利用できるかどうか、このプロセスを使用して鉄を利用するために必要なメカニズムなど、微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。したがって、この方法は、ヘモグロビンからのブドウ球菌の鉄獲得に関する洞察を提供することができます。

また、他の細菌の研究や、他の細菌が宿主からの鉄含有タンパク質をどのように使用するかの研究にも適用できます。このテクニックを実演するのは、私の研究室のGLA AniとCatherine Haleyです。まず、新たに分離された人間の血液を取得し、抗凝固剤を補給し、浄化全体の摂氏4度で維持し、15、000 Gs.Carefully 吸引スナットを吸引し、氷冷、0.9%塩化ナトリウム溶液でペレットを穏やかに再懸濁します 3回の洗浄後、蘇生し、氷冷10ミリモルトリスの1つのボリュームでペレットを懸濁します。 浸透圧によってRBCsをlyするためのHCL。

次に、トルエンを最終容量の20%まで加え、ローテーターで摂氏4度で一晩インキュベートします。次の遠心分離機。ライセートは1時間あたり20, 000Gです。

中間の溶血液画分を採取し、上部のトルエン層とペレットを邪魔しないようにします。溶血液を0.44マイクロメートルのシリンジフィルターに通します。溶液に粒子状物質が含まれており、フィルターを通過できない場合は、高速遠心分離を繰り返してください。

次に、高速液体クロマトグラフィー陰イオン交換カラムでヘモグロビンを精製します。移動相 A は 10 ミリモルトリス、HCL、移動相 B は 10 ミリモルトリス、HCL と 0.5 モル塩化ナトリウムを使用します。溶媒Bの0%から100%のグラジエントを、毎分2ミリリットルの流速で2分間にわたって実行します。

410ナノメートルと280ナノメートルでの吸収に基づいて溶出を監視します。鮮やかな赤色と顕著な吸収ピークを特徴とする画分を収集します。リン酸緩衝生理食塩水に対する溶出を約16時間透析します。

サンプルを滅菌するには、ヘモグロビン濃度を測定するための0.22マイクロメートルシリンジフィルターにサンプルを通します。HP標準溶液をPBSで調製します。次に、標準溶液またはサンプル溶液を2つのxra kins試薬と2つのxra kins試薬と1対1の比率で混合し、540ナノメートルで15分間のインキュベーション測定吸光度を測定します。

標準曲線をプロットし、サンプルのHP濃度を5〜15ミリグラム/ミリリットルで決定します。収率は、2つの15%STSページゲルに15〜20マイクログラムの精製ヘモグロビンサンプルの典型的なランアリコートです。ゲルの1つを染色し、別のゲルからニトロセルロースメンブレンにタンパク質を移し、ヘモグロビン凍結のための免疫ブロットを行い、分離されたヘモグロビンの1ミリリットルのアリコートを凍結ストックストリーク黄色ブドウ球からの液体窒素中に三連祭壇画、大豆寒天培地に保存し、摂氏37度で20〜24時間インキュベートします。

E-D-D-H-Aを含む5ミリリットルのRPMIに単一のコロニーを接種し、摂氏37度で培養し、180 RP Mで一晩振とうします。7、500 Gs.Then Resusで5分間遠心分離によって細菌をペレット化し、0.5ミリモルのEDD-H-Aを含むRPMIの細菌を懸濁し、約3のOD 600に正規化します。次に、2.5マイクログラム/ミリリットル、HBおよび0.1〜1ミリモルのE-D-D-H-Aを含むN-R-P-M-Iを調製して、遊離鉄をキレートします。

次に、10マイクロリットルの細菌懸濁液を1ミリリットルのN-R-P-M-IとE-D-D-H-A、およびHPに継代培養し、6〜12時間ごとに180RRP Mで振とうしながら、摂氏37度で最大48時間培養します。50ウェルプレートで150マイクロリットルのPBSと96マイクロリットルの培養混合物を取り出し、OD600の読み取りを行います。溶血液からヒトヘモグロビンを精製するこのHPLCでは、ヘモグロビンを含む画分5を用いて、280ナノメートルおよび410ナノメートルの波長での溶出液の吸収を測定します。

通常、調製物あたり1ミリリットルあたり5〜15ミリグラムのヘモグロビンの収量が得られます。精製されたヘモグロビンをSDSページで二重に分析し、ゲルをタンパク質の略にするか、ニトロセルロースに移して免疫ブロットしました。次に、精製したヒトヘモグロビンについて、野生型ASUSおよびヘモグロビン由来の鉄獲得に必要なヘモグロビン受容体を欠くASUSの増殖をサポートする能力について試験しました。

経時的な培養物の光学密度の増加は、N-R-P-M-IとE-D-D-H-Aとhbでは、野生型のASUSは増殖するが、変異体は増殖しないことを示しています。対照的に、補充された遊離鉄を利用する能力は、野生型と変異型の両方の系統で同一であり、どちらも供給源がない場合には増殖しません。この、新鮮血液から精製されたヘモグロビンと凍結乾燥されたヘモグロビンを添加した培地の比較では、血液から精製されたヘモグロビンは成長のためにISDBを必要とします。

凍結乾燥ヘモグロビンはISDB変異体の増殖を可能にしますが、一度習得すると、ヘモグロビンの適切な精製は数時間で完了することができます。ドナーは血液媒介性病原体の潜在的なキャリアであるため、人間の血液をバイオハザード物質として扱うことを忘れないでください。