Name: 鉄源としてヒトヘモグロビンを用いた黄色ブドウ球菌の成長 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学ぼう、ヒトヘモグロビンを鉄源として利用する黄色ブドウ球菌の成長アッセイ法。HPLCによるヘモグロビン精製と鉄欠乏培地を用い、細菌の鉄獲得メカニズムを解明する。

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この研究は、国立アレルギー感染症研究所から米国公衆衛生局助成金AI69233およびAI073843によってサポートされていました。 EPSは、感染症の発症機序におけるバローズウェルカム·フェローでもある。 KPHは5 T32 A107611-10細胞·分子微生物学研修助成プログラムによって賄われていた。

1。新鮮な血液からヘモグロビンの精製<ol><li>抗凝固剤を補充した新鮮なヒト血液を取得します。浄化を通して氷上もしくは4℃で血液℃で保管してください。 </li><li> 1500×gで20分間血液を遠心分離します。赤血球は（赤血球）チューブの底になります。注意深く上清を吸引し、ゆっくりと氷冷0.9％（w / v）のNaCl溶液中でペレットを再懸濁します。遠心分離を繰り返し、3回洗浄します。 </li><li>氷冷10mMトリス-HCl（pH8.0）の1ボリュームにペレットを再懸濁します。これは浸透圧に起因する赤血球の溶解を誘導します。 〜20％の最終容量にトルエンを追加します。 </li><li>一晩ロティサリーで4℃でインキュベートする。 </li><li> 1時間20,000 xgでライセートを遠心分離します。手つかずのトルエン（上フローティング）とペレットを残して真ん中溶血画分を集める。中間留分を収集するために、長い首のピペットを使用しています。 </li><li> 0.44μmのシリンジフィルターを通過します。解決策は、微粒子が含まれている場合物質とは、ステップ1.5を繰り返して、フィルタを通過することはできません。 </li><li>高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、陰イオン交換カラム（Varian、PL-SAX千オングストロームは8μm、150ミリメートル×4.6ミリメートル）とヘモグロビン（Hb）を浄化する。移動相Bは、10mMトリス-HCl（pH8.0）+0.5 M NaClで10mMのトリス-HCl（pH8.0）および移動相である。溶媒Bの0％-100％の勾配は2.0ミリリットル/分の流量で2分間にわたって実行されます。 （：410 nmと280 nmλ）の溶出が吸収に基づいて監視されています。鮮やかな赤い色と著名な吸収ピーク（ 図1）によって特徴付け一部のみを収集します。 </li><li>に対する溶出を透析するリン酸緩衝再び生理食塩水（PBS）で一晩してから数時間。 0.22μmのシリンジフィルターを通過することにより滅菌する。 </li><li> Hb濃度を測定するために、PBS中の既知濃度の標準ヘモグロビン溶液を調製する。標準溶液を混合することにより、試料中のヘモグロビンの濃度を測定（試薬達とテーブルを参照してください。ed）または1:1の比率で2倍Drabkin試薬（粉末から調製）と試料溶液。例えば、96ウェルプレートに100μlの2倍Drabkinの試薬を用いて、100μlのHb溶液を混ぜる。 540nmで15分間測定吸光度インキュベートする。標準曲線をプロットし、試料中のヘモグロビン濃度を測定します。 5〜15 mg / mlの収率は典型的なものである。 </li><li>重複の15％SDS-PAGE上で15から20μgの精製ヘモグロビンを実行します。ゲルの1を汚し、ヘモグロビンのニトロセルロース膜とイムノブロット（ 図2）の上に別のゲルからタンパク質を転送します。 </li><li>凍結し、液体窒素中でヘモグロビンの1mlのアリコートを格納します。 </li></ol> 2。鉄枯渇増殖培地の調製<ol><li>メーカーと1％cassamino酸（CA）（w / v）のが推奨するように重炭酸ナトリウムを加える、水にRPMI粉末を溶解することによりロズウェルパーク記念研究所（RPMI）ブロスを準備します。 0.2μmフィルターや店舗冷媒を通過させることにより殺菌erated。 </li><li> Chelex 100 7％（w / v）を追加し、撹拌プレート上で一晩混合することにより、金属が枯渇RPMI（NRPMI）を準備します。 0.2μmフィルターや店舗冷蔵を通過することによりChelex 100を削除します。 、25μMZnCl 2を 、無菌の1,000×溶液として予め用意し、25μMのMnCl 2、100 mM CaCl 2および1mMのMgCl 2：本質的な非鉄金属とメディアを補足するものです。再利用可能な電源からの鉄汚染を避けるために、このステップのための使い捨てのプラスチック容器を使用しています。 </li></ol>ソレ鉄源としてヘモグロビンを用いた3。 黄色ブドウ球菌の成長<ol><li>ストリークS.凍結ストックからトリプシン大豆寒天（TSA）は上の分離のための黄色ブドウ球菌 。 20〜24時間37℃でインキュベートする。 </li><li> 100mmに無水エタノールに再懸濁し、エチレンジアミン-N、N&#39;-ビス（2 - ヒドロキシフェニル酢酸）（EDDHA）。 EDDHAは解決策にはなりませんが、エタノールで滅菌される。 </li><li>最終濃度0.5mMにRPMIにEDDHAを追加します。許すEDDHAは、次のステップに進む前に、少なくとも30分間溶解する。バッチ間のばらつきにより、最終EDDHA濃度は、細菌の増殖を可能にする0.25 mMまで低下させることが必要になることがあります。 </li><li> Sの単一コロニーを植菌15ミリリットルのスクリューキャップコニカルチューブでRPMI含むEDDHAの5ミリリットルに黄色ブドウ球菌 。 37℃で16から20時間、毎分180回転（rpm）で振盪しながらCを。 </li><li> 7500×gで5分間、一晩培養を遠心NRPMIが0.5mMのEDDHAを含有するペレットを再懸濁します。 〜3のOD 600を正規化します 。 </li><li> NRPMIはミリリットルHbおよび0.1から1.0 mMのEDDHAあたり2.5μgを含む準備します。バッチ間のばらつきによる、NRPMI内遊離鉄をキレートするために必要なEDDHA濃度は変わる場合があります。 </li><li> 15ミリリットルのスクリューキャップコニカルチューブに1ミリリットルNRPMI EDDHA + + HBにステップ3.5からの細菌懸濁液10μlをサブカルチャー。 </li><li> 180rpmでまたはローリングドラムに振とうしながら、最大48時間まで37℃で培養する。 </li><li&gt;は6月12日すべての時間は、96ウェルプレートで培養液50μlを除去し、PBSを150μlと混合することにより、OD 600測定値を取る。 </li></ol>

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<li>Shen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unmodified+human+adult+hemoglobin+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).</li>
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<li>Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+envelope+proteins+related+to+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial envelope proteins related to iron.</a> Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).</li>
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</ol>

我々は、開示することは何もない。

鉄は人生15のすべての国からの生物が必要とする必須栄養素である。脊椎動物では、鉄は、この要素によって引き起こされる毒性を避けるために隔離されている。この隔離はまた、栄養免疫16として知られている過程で微生物が侵入してくるから鉄を隠蔽する。応答では、病原体が栄養免疫を回避する戦略を進化させてきた。そのようなメカニズムの1つは、ホスト17内の鉄の最も豊富な源であるヘモグロビンに依存しています。ヘモグロビンは赤血球の中に含まれている。損傷した赤血球から放出されたヘモグロビンはマクロファージ18によりハプトグロビン-ヘモグロビン複合体の迅速な除去を通知ホストハプトグロビン、バインドされています。ヘモグロビンへのアクセスを得るために、S.ブドウ球菌は 19赤血球を溶解ヘモリジンを表現しています。ハプトグロビン誘起ヘモグロビン除去することによって発現される細胞表面受容体によってヘモグロビンの高親和性結合によって対抗さ<em&gt; S.黄色ブドウ球菌。黄色ブドウ球菌は、膜タンパク質を細胞壁タンパク質からそれを渡すことによっ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> HPLCによる陰イオン交換カラム</td><td>バリアン</td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> Drabkinの試薬</td><td>シグマ</td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td>ヘモグロビン標準</td><td>ポワント·サイエンティフィック</td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Hyclone社</td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> Chelex 100ナトリウム型</td><td>シグマ</td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC規格社</td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td>ヘモグロビン抗体</td><td> Santa Cruz Biotechnology社株式会社</td><td> SC-21005 </td><td> &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td>トリプシン大豆寒天</td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

鉄源としてヒトヘモグロビンを用いた黄色ブドウ球菌の成長

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

黄色ブドウ球菌は、鉄が重要な代謝機能と原因疾患を遂行する必要があり、病原性細菌である。人間のホスト内の鉄の最も豊富な貯水池はヘモグロビンのヘム補因子である。ヘモグロビンから鉄を獲得するには、S.黄色ブドウ球菌は、鉄調節表面決定因子（ISD）システム1として知られている精巧なシステムを採用しています。 ISDシステム最初のバインド、ホスト·ヘモグロビンの構成要素は、次に抽出し、ヘムをインポートして、最終的に細菌の細胞質2,3にヘムから鉄を遊離する。この経路は、in vitro試験4-9 の数多く通って解剖されています。さらに、感染症へのISDシステムの寄与を繰り返しマウスモデル8,10-14で実証されている。ヘモグロビン由来の鉄獲得にISDシステムの寄与を確立し、成長がより困難であることが証明された。唯一の鉄源としてヘモグロビンを用いた増殖アッセイは、b複雑なものyの市販のヘモグロビンの不安定、フリー増殖培地中の鉄、鉄キレート剤に関連する毒性を汚染。ここでは、これらの制限を克服する方法を提案する。高品質のヘモグロビンは、新鮮な血液から調製されており、液体窒素中で保存されています。精製されたヘモグロビンは脊椎動物宿主病原体内部で発生した鉄 - 劣悪な環境を模倣した鉄枯渇培地に補充される。 Sを飢えによって遊離鉄の黄色ブドウ球菌 、我々は、ヘモグロビンを結合するヘムを抽出し、細菌の細胞エンベロープを通ってヘムを通過して細胞質内でヘムを分解する能力に完全に依存した方法で成長を誘発するヘモグロビンの低侵襲操作形で補う。このアッセイは、Sのhemoglobin-/heme-derived鉄獲得のメカニズムを解明しようとしている研究者にとって有用であろうブドウ球菌およびおそらく他の細菌性病原体。

我々は、HPLC（プロトコルステップ1.7）で溶血からヒトヘモグロビンを精製した。 図1は、280および410 nmの波長での溶出液の吸光度を記録した。フラクション5を回収し、他の画分を廃棄した。溶出液のミリリットル当たりのヘモグロビンの五から十五ミリグラムの収量は、一般的に取得される。精製されたヘモグロビンは、重複でSDS-PAGEで分析したところ、ゲルをどちらかのタンパク質を染色またはニトロセルロースおよびイムノブロット（プロトコールステップ1.10、 図2）に転写した。 我々は、野生型の成長をサポートするためにヒトヘモグロビンの精製能力を評価したS. aureusおよびS. ISDシステム（ΔISDB）のISDBコンポーネントを欠いているブドウ球菌 。 ISDBは、ヘモグロビン由来の鉄獲得12に必要とされるヘモグロビン受容体である。野生型およびΔISDBは人間hemogを補充鉄欠乏培地中で増殖させた...

ここでは、のための増殖アッセイを記述<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;利用可能な栄養素鉄の唯一の供給源としてヘモグロビンを用いた。このアッセイは、ヘモグロビン由来の鉄獲得に関わる細菌因子の役割を確立します。

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

この実験では、黄色ブドウ球菌がヒトヘモグロビンを唯一の鉄源として利用する能力をテストします。まず、新鮮な人間の血液から赤血球を分離します。高速液体クロマトグラフィーでヘモグロビンを精製し、ヘモグロビンの完全性を確保します。次に、ヘモグロビンをヘモグロビンネクストカルチャーの形で鉄を供給するために、鉄が枯渇した培地にヘモグロビンを加えます。S reus.ヘモグロビンの存在下で、鉄源としてヘモグロビンを利用する能力を測定します。結果は、レウスが唯一の鉄源としてヘモグロビンの存在下で増殖することを示しています。この方法は、病原体が鉄の供給源として宿主タンパク質を利用できるかどうか、このプロセスを使用して鉄を利用するために必要なメカニズムなど、微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。したがって、この方法は、ヘモグロビンからのブドウ球菌の鉄獲得に関する洞察を提供することができます。また、他の細菌の研究や、他の細菌が宿主からの鉄含有タンパク質をどのように使用するかの研究にも適用できます。このテクニックを実演するのは、私の研究室のGLA AniとCatherine Haleyです。まず、新たに分離された人間の血液を取得し、抗凝固剤を補給し、浄化全体の摂氏4度で維持し、15、000 Gs.Carefully 吸引スナットを吸引し、氷冷、0.9%塩化ナトリウム溶液でペレットを穏やかに再懸濁します 3回の洗浄後、蘇生し、氷冷10ミリモルトリスの1つのボリュームでペレットを懸濁します。 浸透圧によってRBCsをlyするためのHCL。次に、トルエンを最終容量の20%まで加え、ローテーターで摂氏4度で一晩インキュベートします。次の遠心分離機。ライセートは1時間あたり20, 000Gです。中間の溶血液画分を採取し、上部のトルエン層とペレットを邪魔しないようにします。溶血液を0.44マイクロメートルのシリンジフィルターに通します。溶液に粒子状物質が含まれており、フィルターを通過できない場合は、高速遠心分離を繰り返してください。次に、高速液体クロマトグラフィー陰イオン交換カラムでヘモグロビンを精製します。移動相 A は 10 ミリモルトリス、HCL、移動相 B は 10 ミリモルトリス、HCL と 0.5 モル塩化ナトリウムを使用します。溶媒Bの0%から100%のグラジエントを、毎分2ミリリットルの流速で2分間にわたって実行します。410ナノメートルと280ナノメートルでの吸収に基づいて溶出を監視します。鮮やかな赤色と顕著な吸収ピークを特徴とする画分を収集します。リン酸緩衝生理食塩水に対する溶出を約16時間透析します。サンプルを滅菌するには、ヘモグロビン濃度を測定するための0.22マイクロメートルシリンジフィルターにサンプルを通します。HP標準溶液をPBSで調製します。次に

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

に焦点を当てて細菌の病原体による宿主細胞の浸潤の研究のための一般的なプロトコル、...

細菌性病原体によるヒト細胞の浸潤

出典: Gupta、S.、 et al。鉄制限性抗酸菌により産生される細胞外小胞の単離と特性化 J. Vis. 経験。 (2019年)このビデオでは、結 核菌...

鉄制限条件下での結核菌の培養

出典: Maurakis、S.、 et al。金属応答性遺伝子の特性化と宿主配位子からの金属獲得のための淋 菌 の金属制限増殖 J. Vis.

金属応答性遺伝子の役割を研究するための金属制限細菌増殖アッセイ

出典: Behera, R.K. ほか、 感染組織における細菌遺伝子調節を研究するための蛍光ベース手法。 J. Vis. Exp. (2019年)このビデオでは、溶血性 黄色ブドウ球...

宿主-病原体相互作用研究のための溶血性 黄色ブドウ球 菌培養の準備

このビデオでは、フローサイトメトリーを使用して、食作用後のヒト好中球に対する毒性のある黄色ブドウ球菌および毒性の低い黄色ブドウ球菌株の細胞毒性を検出するアッセイを実演しています。...

食作用後の好中球に対する黄色ブドウ球菌株の細胞毒性アッセイ

ここでは、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を介して、 黄色ブドウ球菌およびそれらのその後の分析からの代謝産物を抽出するためのプロトコルを記載します。...

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。...

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

ここでは、金属取り込み用遺伝子の発現を促進するために、金属制限液体培地中の淋菌のナイセリアの増殖方法について説明する。また、これらの条件で増殖したゴノコッカスの表現型を特徴付けるための下流実験についても概説する。これらの方法は、他の細菌における金属応答性遺伝子の特性評価に適するように適合され得る。...

ホストリガンドからの金属応答遺伝子の特性評価と金属獲得のためのナイセリア淋菌の金属有限成長

このプロトコルは、 黄色ブドウ球菌...

黄色 ブドウ球菌 内在化と抗菌性化合物の細胞内有効性を研究するための酵素保護アッセイの改善

この原稿では、 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌の抗生物質の生存を評価するための包括的なプロトコルを提供し、プラスミドを 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌...

緑 膿菌 および 黄色ブドウ球 菌の不均一な表現型のタイムラプス落射蛍光顕微鏡イメージング

学ぼう、ヒトヘモグロビンを鉄源として利用する黄色ブドウ球菌の成長アッセイ法。HPLCによるヘモグロビン精製と鉄欠乏培地を用い、細菌の鉄獲得メカニズムを解明する。

鉄源としてヒトヘモグロビンを用いた黄色ブドウ球菌の成長

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