Name: 細胞生物学の勾配を生むマイクロ流体デバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学ぶ勾配生成マイクロ流体デバイスの作製法。PDMSとガラス基板を用いた微細加工技術により、細胞移動や発生、創傷治癒、がん転移などの生物学的プロセスを制御された環境で研究できます。

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勾配を発生するマイクロ流体デバイスのA.の微細加工<ol><li> Siウェハは、活性酸素プラズマ（30W、Harrick科学、NYで5分）で処理される。 </li><li>ネガ型フォトレジスト（SU - 8 50、マイクロケム、MA）は、Siウエハ上に1分間1000 rpmでスピンコートです。 </li><li>ウェハは、65℃焼きソフトです95℃、その後10分、°ホットプレート上で30分間のためのC。 </li><li>ウェハは30μmの最小機能サイズは透明マスクを介して3分間UVライト（200W）に公開されます。 </li><li>ウェハは65で焼成した後で1分間及び95℃C℃で10分間。です。 </li><li>厚さ100μmのチャネルを有するSiマスターモールドは、SU - 8フォトレジストの現像剤を使用して開発されています。 </li><li>マイクロチャネルを含むウェハは、ペトリ皿に配置されます。 </li><li>ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）（Sylgard 184）金型は、混合シリコーンエラストマーと硬化剤（10:1比）によって製造される。 </li><li> PDMSの混合物はSiマスターモールドの上に注がれています。 </li><li> Siのマスターモールドを10分間気泡を除去するため真空デシケーターに配置されます。 </li><li> PDMSは、1〜2時間、70℃で硬化させる。 </li><li> PDMSモールドはSiマスターモールドから剥離されています。 </li></ol> B.実験セットアップ<ol><li> PDMSベースのマイクロ流体デバイスの細胞の入口、出口、および注入口は鋭いパンチャーを使用してパンチされています。 </li><li>デバイスとスライドガラスは（2 × 3インチ）不可逆的に活性酸素をプラズマ（30W、Harrick科学、NYで5分）によって接合される。 </li><li>ポリエチレンチューブ（PE 20、ベクトンDickinon、MD）は、マイクロ流体デバイスの注入注入口に挿入し、その後、シリンジポンプに接続されています。 </li><li>フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストラン（MW = 10kD、10μM、シグマ）とバッファが（PBS、Invitrogen社、カリフォルニア州）流体デバイス内部の安定勾配を確認するためのマイクロ流体デバイスに注入されています。 </li><li>細胞外マトリックス（ECM）（すなわち、フィブロネクチンは）インキュベーターで1時間（37℃）のためにマイクロ流体デバイスの内部にコーティングされています。 </li><li> NIH 3T3繊維芽細胞はトリプシン処理し、解離する。 </li><li>解離細胞は、2の細胞密度でのマイクロ流体デバイス（800μm幅）× 10 6細胞/ mlにロードされます。 </li><li> 2 mlの培地と50 ng / mlの上皮増殖因子（EGF）は、シリンジポンプ（0.05μL/ min）を用いて水溶性勾配を発生させるためのマイクロ流体デバイスに注入される。 </li><li>細胞は、リアルタイム倒立顕微鏡（ニコンTE 2000）を使用して5分​​ごとに監視されています。 </li></ol>

<ol><li>Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).</li>
<li>Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+neutrophil+chemotaxis+is+strongly+influenced+by+mean+IL-8+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).</li>
<li>Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+growth+and+differentiation+in+a+gradient-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device.</a> Lab Chip. 5, 401-406 (2005).</li>
<li>Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parallel-gradient+microfluidic+chamber+for+quantitative+analysis+of+breast+cancer+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis.</a> Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).</li>
<li>Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+microfluidic-vacuum+device+for+interfacing+with+conventional+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform.</a> BMC Biotechnol. 7, (2007).</li>
</ol>

細胞が高濃度に向かって移行したマイクロ流体デバイスにおけるEGFの安定した濃度勾配にさらされる。細胞遊走、走化インデックス、遊走細胞の運動性の指向方向はセルのトラッキング分析により調べた。したがって、この勾配を発生するマイクロ流体プラットフォームは、癌転移、胚形成、軸索のガイダンスを研究するために有用である可能性があります。

<table><tbody><tr><td>Dextran-FITC</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td>フルオレセインイソチシアネート (FITC) 結合デキストラン (10kD)</td></tr><tr><td>hr-EGF</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td>ヒト組み換え上皮成長因子</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td>K.R. Anderson Co.</td><td>2065622</td><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)</td></tr><tr><td>ネガ型フォトレジスト</td><td></td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 50</td><td></td></tr><tr><td>Siウェハー</td><td></td><td></td><td></td><td>シリコンウェハー, 4 インチ</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>PE 20</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>細胞株</td><td></td><td></td><td>線維芽細胞</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>TE 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞生物学の勾配を生むマイクロ流体デバイス

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

細胞挙動を研究するための勾配を生み出すマイクロ流体デバイスの作製と動作について説明する。それは正確に、流体の流れを操作するハイスループット実験を可能にし、安定した水溶性の濃度勾配を生成することがあるため、マイクロ流体プラットフォームは、可能にする実験的なツールです。 、従来の勾配の発電機に比べ、ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）ベースのマイクロ流体デバイスは、明確に定義されたプロファイルを持つ成長因子の安定した濃度勾配を生成することができます。ここで、我々は3つの別々の入口で、単純な勾配を発生するマイクロ流体デバイスを開発した。三マイクロチャネルは、濃度勾配を生成するマイクロチャネルつに結合。成長因子の勾配の安定性と形状は、上皮成長因子（EGF）と同様の分子量とフルオレセインisothyiocyanate（FITC）-デキストランによって確認された。このマイクロ流体デバイスを用いて、我々は、線維芽細胞が高濃度に向かって移行したEGFの濃度勾配にさらされることを示した。細胞の遊走および遊走細胞の運動性の指向方向を定量的に細胞トラッキング解析により評価した。従って、この勾配を発生するマイクロ流体デバイスは、遊走細胞の挙動を研究し、分析するための役に立つかもしれません。

我々は明確に定義された微小環境における空間的および時間的勾配を生成することができる勾配を発生するマイクロ流体デバイスの微細加工のためのプロトコルについて説明します。このアプローチでは、勾配を発生するマイクロ流体デバイスは、指示細胞の遊走、胚形成、創傷治癒、癌の転移を研究するために使用することができます。

細胞挙動を研究するための勾配生成マイクロ流体デバイスの作製および操作について記述する。マイクロ流体プラットフォームは、...

私の名前はJiangです。ハーバード大学およびMITのHealth, Science and Technologyのポスターフェローを務めています。そして、私はAmir Manchiです。ハーバード大学およびMITのHealth Sciences and Technology部門にあるProfessor Ha Saneの研究室の学部生です。このスライドはデバイスの作製工程の概略を示しています。まず、シリコンウェハー上にSU-8 50をスピンコートし、次にシリコンウェハーの上にマスクを配置して、UV露光および現像を行います。これにより、シリコンウェハー上にこれらのパッドを得ることができます。その後、PDMSをキャストし、キュアリングとベーキングを行い、小さな穴を開けます。そして最後に、酸素プラズマを用いて、PDMSデバイスとガラス基板の間でボンディングを行います。それでは、研究室内のマイクロファブリケーションルームにて、PDMSレイヤーの作製から始めていきましょう。PDMSとは、正式な学術名称でポリジメチルシロキサン（polymethyl siloxane）と呼ばれる有機ポリマーのことです。これは、最も広く利用されているシリコンベースの有機ポリマーです。これは実際には2つの異なる物質の混合物であり、シリコンエラストマー主剤とシリコンエラストマー硬化剤の混合物です。比率は主剤10に対して硬化剤1です。主剤が約10 g必要であるため、それに応じてエラストマー硬化剤が約1 g必要となり、これら主剤と硬化剤を互いに均一に混合します。ピペットを使用します。混合液の準備ができたので、これをシリコンウェハーの上に注ぎます。これらのシリコンウェハーの表面には、いくつかのパターンが形成されています。これらは、このPDMSポリマーにパターンを形成させるのに役立ちます。これらのパターンを用いて、ポリマー上にチャネルや溝、または必要とされるその他のパターンを作成します。次に、この混合物の中には多くの気泡が含まれているため、ポリマー内部の気泡を取り除くために真空状態で処理します。真空チャンバー内のシリコンウェハー上にPDMSゲルを配置します。チャンバーを閉じて、真空引きを行います。数分後、気泡が消えたら、これをオーバーナイトで約70 °Cのオーブンに入れ、凝固させます。注目していただきたいパターンは、勾配を作成するためのこれら3つの異なるリザーバーです。これにより、一方の端を濃度0とし、もう一方の端を特定の濃度に設定し、そこから均一に移行させることができます。また、反対側の端に小さな穴を開け、ここを今回の流出口とします。次のステップは、これらのパターンの1つを切り出し、パターン表面を上にしてペトリ皿に移すことです。このパターンにある、先ほど説明した3つの入口と1つの出口が見えるかと思います。入口にはポリエチレンチューブを使用するため小型のパンチを用い、出口にはリザーバーを設置するため大型のパンチを使用します。まず、1つ目の入口から開始します。ここにパンチ穴を開け、2つ目も同様に行います。また、3つ目には別の小さなパンチ穴を開けます。最後の工程として、出口に大きなパンチ穴を開けます。これで、最上層となるAPDMS層と、最下層として使用する別のガラス層が準備できました。これらのマイクロスライドが、マイクロ流体デバイスの底面となります。現在、マイクロファブリケーション室におり、1枚のガラスと1枚のPDMS層を互いに接合させます。次に使用するのは、プラズマクリーナーと呼ばれる装置です。チャンバー内では、プラズマが表面の弱い結合を切断して反応性の高い化学基に置き換え、表面を親水性に変化させます。それでは、内部にチャネルを持つ上層のPDMSモールドを取り出し、モールドへのホコリの付着を防ぐためにあらかじめ貼っておいたテープを剥がします。これをチャンバーの中に設置します。次に、顕微鏡スライドガラスを用意します。これがデバイス内部の最下層になります。したがって、これもチャンバーの中に設置します。チャンバーを完全に閉じ、まず電源を入れ、次にポンプを起動します。約5分後に再びこの装置に戻ります。装置を停止させる際は、まずポンプを切り、次に電源を切ってから、チャンバーを開けます。この音は、実際にはチャンバー内でプロセス中に印加された負圧によるものです。それでは、各レイヤーを取り出し、それらを接合させます。ガラスが最下層となるため、左手で固定し、PDMSレイヤーをガラスレイヤーの上に配置します。現在、パターンが上を向いているため、PDMS層を反転させます。その後、ガラスの上に置いて押し付けます。これにより非常に簡単に接着されます。このプラズマ処理プロセスの利点の一つは、その接着強度と永続性にあります。最終的な外観はこのような形になります。改めて、こちらが入口で、こちらが出口です。これで次のステップに進む準備が整いました。デバイス内部でファイバーを固定し、1時間インキュベーターに入れます。1時間後、インキュベーターからサンプルを取り出し、魚類培養液を加えて溶液を作成します。EGF溶液を調製するために、2 mLの培養液に15 ng/mLのEGFと10 µMのDextranを添加します。この溶液を用いて、チャネル全体にEGF濃度勾配を可視化させます。次に、2 mLの培養液（仮想的な培地）を準備し、さらに別の2 mLの培養液を用意します。これら2つの設定では、デバイス内に通常の培養液のみを注入します。気泡を取り除いてから再度接続しますが、ここでもまた気泡が降りてきてしまいます。そこで、15 ngのEGFと10 µMのフィコデキストラン、そして2 mLの培地を用いてサンプル2を調製し、シリンジをセットして気泡を除去します。その後、溶液の切り替えを行い、元の状態に戻します。溶液をガスフィルター付きシリンジに吸い込み、気泡を除去するためにプッシュボタンを数回押します。まずすべてのシリンジ溶液をここに集め、その後、3方コックを切り替えて溶液を3方コックとチューブ経由で流し、チューブから溶液が出てくるようにします。混合後、溶液が出てきたら、チューブをMy Predictデバイスに挿入します。3つの溶液はすべて同一であるため、注入チャネルのインレットに慎重に接続してください。最終的に、2つの条件を用意します。1つは通常の培養培地、もう1つはEGFを含む培養培地であり、これによりEGFの濃度勾配プロファイルを検証します。こちらがセルネット（cell in net）です。これは細胞の流出口となります。3つのハブチャネルを用いて勾配を生成し、細胞領域内に勾配を作成します。通常の手順としては、まず細胞懸濁液を流出口から播種します。その後、ネットを用いて緩やかに吸引すると、細胞が細胞領域に自動的に流れ込み、コーティング面に沈降します。そして、細胞が完全に展展したことを確認します。細胞の完全な展展を確認した後、注入を開始し、勾配生成装置を用いて細胞遊走を観察します。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

このプロトコルは、chemoeffectorsの安定した濃度勾配で細菌の走化性を調べるためのマイクロ流体デバイスの開発を説明します。...

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

私たちは、クリーンルームやソフトリソグラフィーを必要とせずに、複数の異なる株に類似した、動的な条件を適用することができるマイクロ流体デバイスを製造するための簡単​​な方法を提示する。...

複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

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蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

組織工学用セルの配置を調整する同心円状細胞を含んだハイドロゲルの非連続的なグラデーション静的系統を提供する単純なアプローチを紹介します。...

細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

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マイクロ流体がんオンチップモデル「エボリューションアクセラレータ」技術を提示し、単一細胞における明確な環境条件下でがんダイナミクスを長期リアルタイムで定量的に研究するための制御可能なプラットフォームを提供します。レベル。この技術は、基礎研究や前臨床薬開発のためのインビトロモデルとしての働きが期待されます。...

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発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。...

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微小管ポリマーメカニクス研究のためのマイクロ流体工学に基づくアプローチの開発

学ぶ勾配生成マイクロ流体デバイスの作製法。PDMSとガラス基板を用いた微細加工技術により、細胞移動や発生、創傷治癒、がん転移などの生物学的プロセスを制御された環境で研究できます。

細胞生物学の勾配を生むマイクロ流体デバイス

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