細胞生物学の勾配を生むマイクロ流体デバイス

私の名前はJiangです。ハーバード大学およびMITのHealth, Science and Technologyのポスターフェローを務めています。そして、私はAmir Manchiです。ハーバード大学およびMITのHealth Sciences and Technology部門にあるProfessor Ha Saneの研究室の学部生です。

このスライドはデバイスの作製工程の概略を示しています。まず、シリコンウェハー上にSU-8 50をスピンコートし、次にシリコンウェハーの上にマスクを配置して、UV露光および現像を行います。これにより、シリコンウェハー上にこれらのパッドを得ることができます。その後、PDMSをキャストし、キュアリングとベーキングを行い、小さな穴を開けます。そして最後に、酸素プラズマを用いて、PDMSデバイスとガラス基板の間でボンディングを行います。

それでは、研究室内のマイクロファブリケーションルームにて、PDMSレイヤーの作製から始めていきましょう。PDMSとは、正式な学術名称でポリジメチルシロキサン（polymethyl siloxane）と呼ばれる有機ポリマーのことです。これは、最も広く利用されているシリコンベースの有機ポリマーです。

これは実際には2つの異なる物質の混合物であり、シリコンエラストマー主剤とシリコンエラストマー硬化剤の混合物です。比率は主剤10に対して硬化剤1です。主剤が約10 g必要であるため、それに応じてエラストマー硬化剤が約1 g必要となり、これら主剤と硬化剤を互いに均一に混合します。

ピペットを使用します。混合液の準備ができたので、これをシリコンウェハーの上に注ぎます。これらのシリコンウェハーの表面には、いくつかのパターンが形成されています。

これらは、このPDMSポリマーにパターンを形成させるのに役立ちます。これらのパターンを用いて、ポリマー上にチャネルや溝、または必要とされるその他のパターンを作成します。次に、この混合物の中には多くの気泡が含まれているため、ポリマー内部の気泡を取り除くために真空状態で処理します。真空チャンバー内のシリコンウェハー上にPDMSゲルを配置します。

チャンバーを閉じて、真空引きを行います。数分後、気泡が消えたら、これをオーバーナイトで約70 °Cのオーブンに入れ、凝固させます。注目していただきたいパターンは、勾配を作成するためのこれら3つの異なるリザーバーです。これにより、一方の端を濃度0とし、もう一方の端を特定の濃度に設定し、そこから均一に移行させることができます。また、反対側の端に小さな穴を開け、ここを今回の流出口とします。

次のステップは、これらのパターンの1つを切り出し、パターン表面を上にしてペトリ皿に移すことです。このパターンにある、先ほど説明した3つの入口と1つの出口が見えるかと思います。入口にはポリエチレンチューブを使用するため小型のパンチを用い、出口にはリザーバーを設置するため大型のパンチを使用します。

まず、1つ目の入口から開始します。ここにパンチ穴を開け、2つ目も同様に行います。また、3つ目には別の小さなパンチ穴を開けます。最後の工程として、出口に大きなパンチ穴を開けます。

これで、最上層となるAPDMS層と、最下層として使用する別のガラス層が準備できました。これらのマイクロスライドが、マイクロ流体デバイスの底面となります。現在、マイクロファブリケーション室におり、1枚のガラスと1枚のPDMS層を互いに接合させます。

次に使用するのは、プラズマクリーナーと呼ばれる装置です。チャンバー内では、プラズマが表面の弱い結合を切断して反応性の高い化学基に置き換え、表面を親水性に変化させます。それでは、内部にチャネルを持つ上層のPDMSモールドを取り出し、モールドへのホコリの付着を防ぐためにあらかじめ貼っておいたテープを剥がします。

これをチャンバーの中に設置します。次に、顕微鏡スライドガラスを用意します。これがデバイス内部の最下層になります。したがって、これもチャンバーの中に設置します。

チャンバーを完全に閉じ、まず電源を入れ、次にポンプを起動します。約5分後に再びこの装置に戻ります。装置を停止させる際は、まずポンプを切り、次に電源を切ってから、チャンバーを開けます。

この音は、実際にはチャンバー内でプロセス中に印加された負圧によるものです。それでは、各レイヤーを取り出し、それらを接合させます。ガラスが最下層となるため、左手で固定し、PDMSレイヤーをガラスレイヤーの上に配置します。

現在、パターンが上を向いているため、PDMS層を反転させます。その後、ガラスの上に置いて押し付けます。これにより非常に簡単に接着されます。このプラズマ処理プロセスの利点の一つは、その接着強度と永続性にあります。

最終的な外観はこのような形になります。改めて、こちらが入口で、こちらが出口です。これで次のステップに進む準備が整いました。デバイス内部でファイバーを固定し、1時間インキュベーターに入れます。1時間後、インキュベーターからサンプルを取り出し、魚類培養液を加えて溶液を作成します。

EGF溶液を調製するために、2 mLの培養液に15 ng/mLのEGFと10 µMのDextranを添加します。この溶液を用いて、チャネル全体にEGF濃度勾配を可視化させます。次に、2 mLの培養液（仮想的な培地）を準備し、さらに別の2 mLの培養液を用意します。これら2つの設定では、デバイス内に通常の培養液のみを注入します。

気泡を取り除いてから再度接続しますが、ここでもまた気泡が降りてきてしまいます。そこで、15 ngのEGFと10 µMのフィコデキストラン、そして2 mLの培地を用いてサンプル2を調製し、シリンジをセットして気泡を除去します。その後、溶液の切り替えを行い、元の状態に戻します。

溶液をガスフィルター付きシリンジに吸い込み、気泡を除去するためにプッシュボタンを数回押します。まずすべてのシリンジ溶液をここに集め、その後、3方コックを切り替えて溶液を3方コックとチューブ経由で流し、チューブから溶液が出てくるようにします。混合後、溶液が出てきたら、チューブをMy Predictデバイスに挿入します。3つの溶液はすべて同一であるため、注入チャネルのインレットに慎重に接続してください。

最終的に、2つの条件を用意します。1つは通常の培養培地、もう1つはEGFを含む培養培地であり、これによりEGFの濃度勾配プロファイルを検証します。こちらがセルネット（cell in net）です。

これは細胞の流出口となります。3つのハブチャネルを用いて勾配を生成し、細胞領域内に勾配を作成します。通常の手順としては、まず細胞懸濁液を流出口から播種します。その後、ネットを用いて緩やかに吸引すると、細胞が細胞領域に自動的に流れ込み、コーティング面に沈降します。そして、細胞が完全に展展したことを確認します。細胞の完全な展展を確認した後、注入を開始し、勾配生成装置を用いて細胞遊走を観察します。