Name: 粒状ハイドロゲル生体材料内および粒状ハイドロゲル生体材料内への三次元細胞移動の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶ粒状ハイドロゲルを用いた三次元細胞移動の定量的評価法。共焦点顕微鏡とImarisソフトウェアで細胞浸潤と創傷治癒段階の追跡を行い、組織再生メカニズムの理解に貢献する。

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>ThermoFisher</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>VWR International</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDS Dye, 1 mg</td><td>ThermoFisher</td><td>C2925</td><td>20 x 50 ug units, 492/517 nm</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>75016085</td><td>ST Plus Series</td></tr><tr><td>Clear 96 well plate</td><td>MilliPore Sigma</td><td>CLS3997-50EA</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT-25950CQC</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>線維芽細胞基礎培地</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-030</td><td>480 mL、フェノールレッドフリー</td></tr><tr><td>線維芽細胞増殖キット - 低血清</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-041</td><td>7.5 mM L-glut、5 ng/mL rh FGF 塩基性、5 ug/mL rh インスリン、1 ug/mL ヒドロコルチゾン、50 ug/mL アスコルビン酸、2% FBS</td></tr><tr><td>フィジー (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Publicアクセス ダウンロード</td></tr><tr><td>ヒト皮膚線維芽細胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>成人ヒト皮膚線維芽細胞</td></tr><tr><td>ImageXpress マイクロ共焦点</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>スピニングディスク共焦点顕微鏡 4倍、10倍の倍率</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>オックスフォードインスツルメンツ</td><td></td><td>3/4D 画像化されたビジュアリゼーションおよび分析ソフトウェア、独自の</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>フィンピペット F2 可変容量ピペット</td><td>HeraCell Vios 160i CO2 インキュベーター、165L</td></tr><tr><td>M-20 マイクロプレート スイングバケット ローター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>9004-67-5</td><td>ラボグレード、粉末状</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>05-408-129</td><td>1.5 mL マイクロ遠心チューブ</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (4%)</td> <td>アルファ・アエザー</td><td>AAJ19943K2</td><td>固定用&nbsp;</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>08-757-100A</td><td>蓋付き細菌学ペトリ皿 35 x 10 mm</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4642080</td><td>フィンピペット F2 可変容量ピペット</td></tr><tr><td>滅菌 PBS</td><td>ギブコ</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

粒状ハイドロゲル生体材料内および粒状ハイドロゲル生体材料内への三次元細胞移動の定量化

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

このプロトコルは、2つの新しい粒状足場移動アッセイに必要なステップを詳述することを目的としています。MAMA法は、組織界面での細胞浸潤を評価するために利用できます。粒状ハイドロゲルは、バルクハイドロゲルよりも複雑なシステムであるため、移動のための処理が本質的に複雑である9,20。図 1 で概説した段階的なプロセスを理解することが重要です。各ステップは次のステップに基づいて構築され、このプロトコルで最適化されています。120,000細胞/cm2の密度でHDFを播種すると、一晩で少なくとも80%のコンフルエントが得られ(図1A)、これらの非蛍光細胞は、イメージングの可能性を最大化するために、実験当日に細胞追跡色素でタグ付けするのが最適です(図1B)。このプロトコールは、細胞の生存率を維持するためにHDF継代で使用される低い遠心力と一致します。1回の遠心分離ステップで生じる角度のため、プレートを180°反転させてゲルがシフトし、ウェルの底面を完全に覆うようにする必要があります(図1C)。アニーリング後30分間インキュベーター内で細胞を回復させると(図1D)、細胞の生存率が維持され、最適な遊走が得られます(図1E)。96ウェルプレートの広い領域を4倍対物レンズでイメージングし、0〜24時間の時点から一致させることができます(図2A、B)細胞の挙動を広く評価できます。結果のZスタック画像を解析ソフトウェアで処理すると、使いやすいインターフェースで複数の大規模データセットの高度な解析が可能になります。このプロトコルは、図 2B、C の代表的な画像で視覚化された各時点におけるセルの高さまたは位置 Z のデータセットを作成する手順をまとめたものです。処理されたデータの分析は、図3Aに見られ、中央値の高さの平均と各時点のそれらの標準偏差を使用して視覚化され、t = 0時間での非移動セルからの折り畳み変化高さが図3Bに示されています。この方法の基礎となるデータは通常、非正規分布であるため、中央値は比較のためのより堅牢な尺度であり、したがってデータの要約に使用されます。
同様に、PLOSMA法は、3D顆粒状ハイドロゲル足場内の送達細胞の運動性を評価するために利用することができます。 図4A は、PLOSMA法の手順を概説しており、ウェルの中央にスフェロイドを播種することが特に重要です。スフェロイドを視野の中央に配置することをお勧めしますが、顕微鏡の能力によります。 図4B は、FITCチャネル(488nm)で10倍の倍率で撮影された、t = 0時間およびt = 24時間のスフェロイドの広がりの代表的な画像を示しています。ソフトウェアでは、原点参照フレームを作成し、各zスタックに合わせて調整できます(図5A、B)。ソフトウェアは、その原点参照フレームからの半径方向の距離を追跡し、目的のデータセットとしてエクスポートできます(図5C)。 図6A はt = 24h回転楕円体の3Dレンダリングの代表的な画像を示し、 図6B はソフトウェアのスポット機能を示しています。処理されたデータの例を 図 7 に示します。 図 7A は、中心から移動した平均距離を Day 0 の距離に正規化したものを表しています。 図7B は、PLOSMA法が研究しようとしている方向であるため、z平面だけで移動した距離を分離しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig01.jpg"> 
図1:単層ベースのAscending Migration Assay細胞培養とイメージング。 MAMAの細胞およびゲルプロセッシングにおける主要なステップの概略図。(A)細胞を一晩でコンフルエントするまで増殖させ、(B)細胞追跡色素を顆粒状ゲルを添加する直前に添加します。足場は、(C)プレート遠心分離によって組み立てられ、(D)光架橋で安定化されます。複数の時点でのイメージングにより、(E)上向きの細胞移動を視覚化できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig02.jpg"> 
図2:MAMA画像処理。 画像処理の代表的な画像です。FITCチャンネルの(A)t = 0および(B)t = 24hの生の共焦点画像を4倍倍で上面図と側面図で比較。(B)処理されたセル位置Zの高さを(C)t = 0および(D)t = 24時間で上面図と側面図で比較。24 時間の処理には、移動しない Z 高さの中央値の減算が含まれます。スケールバー = 500 μm。略語:MAMA = MonolayerベースのAscending Migration Assay。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig03v2.jpg"> 
図3:MAMA細胞遊走出力解析。 (A)各反復における細胞高さの中央値Zおよび標準偏差(n = 6)t=0(27.0μm±1.4μm)およびt=24時間(46.6μm±10.8μm)における。(B)24時間での細胞の移動を0時間に正規化し、倍率変化(1.8 ± 0.4)として報告しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig04.jpg"> 
図4:Parallel Layer Outward Spheroid Migration Assay(PLOSMA)細胞培養とイメージング(A)スキャフォールドレイヤリングの手順を説明する概略図。(B)0時間および24時間で撮影された回転楕円体の最大強度投影。画像は、FITCチャネル(488 nm)の共焦点蛍光顕微鏡法で10倍の倍率で撮影しました。スケールバー = 200 μm。略語:PLOSMA = Parallel Layer Outward Spheroid Migration Assay。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig05.jpg"> 
図5:新しい原点参照フレームの作成。 (A)赤いボックスで囲まれた新しい原点参照フレームボタン。(B) 新しい原点は、3次元すべてで回転楕円体の中心に設定されます。(C)表示される出力メトリックは、原点参照フレームからのセル表面の距離であり、セルが中心からどれだけ移動したかを示します。スケールバー = 120 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig06.jpg"> 
図6:24時間後の埋め込み回転楕円体の3Dレンダリング(A)3D空間で処理された回転楕円体。(B)IMARISの原点参照系機能を用いて同一スフェロイドの中心を決定し、原点からの距離により細胞の広がりを色分けしています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig07.jpg"> 
図7:PLOSMAの出力例 (A) 移動距離をμmで示すPLOSMAの結果の例。平均移動距離は240.8μm±36.87μmであった。平均フォールドチェンジは3.82±1.495でした。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...

quantifying-three-dimensional-cell-migration-within-into-granular

Research

JoVE Journal

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ここでは、ヒトグリオーマ細胞(hGC)移行をリアルタイムで研究するためのex-vivo混合単層培養システムを提示する。このモデルは、区画化されたチャンバー内のhGCと骨髄化した軸索と非骨髄化軸の間の相互作用を観察する能力を提供する。...

後根神経節軸軸索-オリゴデンドロサイト共培養におけるヒトグリオーマ細胞移動のリアルタイムモニタリング

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。...

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。...

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

学ぶ粒状ハイドロゲルを用いた三次元細胞移動の定量的評価法。共焦点顕微鏡とImarisソフトウェアで細胞浸潤と創傷治癒段階の追跡を行い、組織再生メカニズムの理解に貢献する。

粒状ハイドロゲル生体材料内および粒状ハイドロゲル生体材料内への三次元細胞移動の定量化

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