Name: マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぶマウス脊髄へのウイルスベクター定位注射法。腰椎背角への正確な遺伝子導入により、感覚神経回路の機能解析や疼痛研究に応用可能な条件遺伝子操作技術を習得できます。

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我々は、技術的な支援をBakhos A. Tannous、博士のrAAV-EGFPベクターを用いて私たちを提供するためのマサチューセッツ総合病院、チャールスタウン、マサチューセッツ州の神経科学センターのベクター開発·生産担当ディレクター、ジョン·むちで打つことに感謝します。この作品は、神経疾患や脳卒中の国立研究所からの助成金によってR01 NS050408を（JS）にサポートされていました。

記載外科手術はコロンビア大学の施設内動物のケアと使用委員会（IACUC）によって承認されています。 1。機器およびウイルス粒子懸濁液の調製<ol><li>装置を清掃し、消毒、手術器具と椎骨L1を固定するために使用されるVノッチスパイクを滅菌します。 </li><li>プルとベベルガラスピペット。我々は、40μmの先端径を持ち、20°の角度で傾斜がついていピペットを使用しています。ガラスピペットを滅菌する。 </li><li>定位フレームを設定し、マニピュレータ上にマイクロシリンジインジェクタを取り付けるとコントローラにインジェクタを接続します。 </li><li>コンプレッションフィッティングキットを使用してマイクロシリンジにガラスピペットのいずれかを添付してください。 </li><li>マイクロシリンジからプランジャを取り外し、ミネラルオイルを注射器を埋める。オイルレッドO（1 - （2,5 - ジメチル-4 - （2,5 - dimethylphenylazo）フェニルアゾ）-2 - ナフトール）が、そのvを高めるために鉱物油に添加してもよいisibility。プランジ​​ャーを挿入し、先端に至るまで押し込みます。慎重に気泡を作成することは避けてください。 </li><li>バイオセーフティキャビネット内でウイルス粒子の懸濁液を準備します。氷の上で冷凍ウイルスを解凍し、使用直前に、滅菌した所望の粒子濃度にリン酸緩衝生理食塩水で希釈。 </li><li>インジェクタ上のホルダーにマイクロシリンジを挿入します。 </li><li>小さ ​​なプラスチック製のシート上にウイルス懸濁液のピペットを5μl、 例えばパラフィルム。ドロップにガラスピペットの先端を下げ、マイクロシリンジを埋めるためにプランジャーを引く。目詰まりを防ぐためのピペット先端に小さな気泡を作成します。 </li></ol> 2。椎弓切除術<ol><li>ベンチや消毒剤で加熱パッドを拭くことによって手術領域を準備します。 </li><li>マウスを麻酔。我々は、（誘導中に3％、メンテナンス時の2〜3％）とイソフルラン吸入麻酔を使用します。 </li><li>時の乾燥から目を保護するために、それぞれの目の上に置いて潤滑剤操作。 </li><li>腰痛からのマウスの首にファーを剃ると、クロルヘキシジンまたはポビドンヨード、70％エタノールなどの局所消毒のワイプを交互に皮膚の消毒。外科用ドレープで無菌的に調製現場を隔離し、ブピバカイン（0.25％、生理食塩水で1:10に希釈）を用いて切開部位に浸潤する。 </li><li>正中線に沿って肋骨の尾側（2-3 cm）で皮膚を切開し、背骨を覆う筋膜を分離します。 </li><li>脊髄は脊柱より生後発育中に、以前の成長が止まるので、脊髄分節L4は第1腰椎（L1）の下に位置しています。椎骨L1はリブの最後のペアを保持している椎骨尾に位置しています。その背面に付いている小さな脊髄筋肉と靭帯を除去することによって椎骨L1を識別し、公開します。 </li><li>少しアドソン鉗子と椎骨L1を持ち上げたままにします。背portioを削除するには、専用の椎弓切除鉗子を使用n個の椎骨（背骨やラミナ）と脊髄を露出するの。脊髄の損傷を防ぐ。 </li><li>定位フレーム内の加熱プレート上にマウスを移す。その後の動作中にマウスの温度を監視します。 </li></ol> 3。注射<ol><li> Vノッチスパイクで椎骨L1を固定してください。椎骨は、呼吸中に動かないようにスパイクが脊椎を安定させなければなりません。 </li><li>近いので、ピペットの先端が椎弓切除部位を超えていることをマイクロシリンジを持参してください。あなたはピペットを出るウイルス懸濁液が表示されるまでプランジャーを押し下げます。滅菌綿棒で液滴を削除します。 </li><li>露出した脊髄の吻側、最も部分にピペットチップを置きます。センター後正中溝上記ピペット、その後500μmで横方向に先端を移動。コー​​ドの表面にチップと穿刺硬膜を下げるか、あなたはunbeveledガラスピペットを使って作業しているときは、dは穿刺に面取りされたスチール製のカニューレを使用浦。脊髄にガラスピペット300μmの先端を下げます。 </li><li> 200 NL / minの速度でウイルス懸濁液の1μlを注入します。 </li><li>注射の終了時に、ゆっくりと後退させるピペット前に少なくとも2分待ってください。 </li><li>脊髄分節L4にウイルスベクターの完全な分配を達成するために露出した脊髄の尾最部でステップ3.3から3.5を繰り返します。 2注射部位は、対象地域の組織の損傷を回避するために吻側およびL4セグメントの尾側に位置しています。 </li></ol> 4。創縫合<ol><li> Vノッチクランプから椎骨L1を離すと定位フレームからマウスを削除します。 </li><li> 5.0ビクリルと筋膜を縫合。閉鎖筋膜は椎弓切除部位のためのカバーを提供しています。 </li><li>ナイロン縫合糸または外科用ステープルで皮膚を閉じます。 </li></ol> 5。術後処置<ol><li>柔らかい、nonparticularな寝具を使用して回復ケージにマウスを移す。トンの上に置きます快適な呼吸のために彼がサイド。それは通院、完全に警戒され、飲酒を開始するまで、動物を監視します。 </li><li>我々は、カルプロフェンの毎日の皮下注射（5.0 mg / kg）を使って72時間術後の鎮痛を提供します。 </li><li>実験が完了するまで、最初の3日間毎日検査で術後の回復、隔日または週3日を監視します。 </li><li>創傷治癒が完了したときに、7〜10日間運転後の皮膚の縫合糸またはステープルを外します。 </li><li>実験終了後の動物を安楽死させる。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

定位ベクターの注入は、神経変性11の予防または治療のために傷害9,10、または遺伝子治療から再生中に6,7またはoptogenetic郭清8、軸索ガイダンスを広げる経シナプスウイルスに基づいて、このような神経ネットワークのマッピングなどのアプリケーションに脊髄ニューロンを標的にできます12。ウイルスベクターは、体性感覚、運動と自律神経経路9,10,13-15を研究するために脊髄に遺伝子操作のために使用されている。マウスが最も広く、脳や脊髄へのウイルスベクターの定位注入を含む研究に使用されるモデル生物であるが、技術はヒト以外の霊長類16を含む他の種で採用されてきた。 マウス脊髄に定位ベクターの注入は安全であり、動物はinstabiliせずに回復しているので、ここで説明する外科手術は、注射部位の単椎弓切除術を必要とするその背骨の動きのTY。注射やカニューレの遅い除去は10分以内に完了している、皮膚の準備及び創傷閉...

マウスにおける条件遺伝子操作の高度な技術は、中枢神経系におけるシナプス経路と機能の接続の探査への多面的なアプローチを可能にします。導入遺伝子は、エストロゲン受容体1の変異型リガンド結合ドメインを認識するリプレッサーまたは遺伝子の転写活性化因子、またはタモキシフェンとして機能するように設計することができるテトラサイクリン制御トランスに作用するようドキシサイクリンなどの小分子エフェクターによって調節することができる。不可逆的な導入遺伝子の改変は、一般的デオキシリボ核酸（DNA）リコンビナーゼによって達成される。 CRE（原因組換え）とFLP（フリッパーゼ組換え酵素）が切除、反転またはそれぞれ1のloxP（クロスxの軌跡上、P1）またはFRT（フリッパーゼ認識対象）サイトが隣接してDNA断片の転移を触媒する。アプリケーションでは、遺伝子の活性化またはサイレンシングおよび誘導リボ核酸（RNA）干渉を含む<sup&gt; 2。例えば、β-ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの蛍光または酵素レポーターの条件式は、ニューロンにラベルを付け、それらの局所組織と接続3を調べるために使用することができます。北米（の大規模な変異導入プロジェクト<a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ）、ヨーロッパ（ <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucommは</a> ）で、マウス胚性幹細胞クローンのライブラリーを製造しています最終的には全体のマウスゲノムをカバーする条件付き遺伝子標的とトラップ。これらのクローンから生成されたマウスは、選択的な遺伝子操作（たとえば、ニューロンの特定の集団へ特異的プロモーターまたは遺伝子座の下でのDNAリコンビナーゼを発現するマウス系統の拡大数と交配することができる<a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index 。PHP</a> ）。 <p class= &quot;jove_content&quot;&gt;興味のあるニューロン集団に特異的なプロモーターが知られていないか、領域内のすべてのニューロンによって表現されていない場合には、神経細胞や関心のある特定の領域の異なる集団に遺伝子操作を制限することは、単独で標的遺伝子によって達成されない場合があります興味のある。脊髄では、実験的なデザインは、1つまたは2つの頭尾方向のセグメントへの遺伝子操作の空間的制約が必要な場合があります。 CreまたはFLPを発現するウイルスベクターの定位注入フロックス化またはflrted対立、いわゆるDNA断片がloxPまたはFRT部位に隣接されているマウスの脊髄の領域に遺伝子組換えを制限することができます。マウスを表現リコンビナーゼで動物を交配に起因する構成的DNA再構成とは異なり、この戦略はまた、遺伝子の活性化やサイレン以上時間的な制御を提供します。コー​​ドするウイルスベクターは、フロックス化または導入遺伝子はcorrespoを発現するマウスで遺伝子操作の逆のオプションを提供しています浮気ニューロン特異的プロモーターの下流にリコンビナーゼをnding。ニューロンへの親和性を持ついくつかの組換えベクターは、4利用可能です。大容量（ガット）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスやレンチウイルスは、一般的に神経親和性のベクトルを使用されています。研究課題に適したウイルスを選択すると、実験デザインの重要な部分です。導入遺伝子のサイズ、配送ルート、グリア細胞とは対照的に、神経細胞への感染の特異性、感染症の効能は、炎症性および毒性の副作用が4を考慮する必要があります。 ここでは、脊髄後角へのウイルスベクターを、私たちは痛みの神経生物学上の我々の研究での条件付き遺伝子調節のために採用している手法の定位注射について説明します。後角には侵害受容性ニューロンを含む一次体性感覚ニューロンからの求心性入力を受け取る。投射ニューロンからそれを伝える前に、ローカルの介在ニューロンは情報を処理する脳5〜背角。我々は、構成的に活性サイトメガロウイルスプロモーター下に強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現する神経向性組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）と脊髄分節レベルL4で後角ニューロンの感染を示しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td></td></tr><tr><td>脊髄ベースプレート</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td>小動物の定位器</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td>マウスガス麻酔ヘッドホルダー</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td>調整可能なベース·マウント</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> Vノッチスパイク</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td>小動物温度制御システム</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td>アドソン鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11006から12 </td><td></td></tr><tr><td>椎弓切除鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11223から20 </td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4コントローラとUltraMicroPump（1） </td><td>ワールド·精密機器</td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロシリンジ、65RN </td><td>ハミルトン</td><td> 7633から01 </td><td></td></tr><tr><td> RNコンプレッションフィッティング、1ミリメートル</td><td>ハミルトン</td><td> 55750から01 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>ワールド·精密機器</td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td>ナリシゲ</td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

ウイルスベクターの実質内注射は、神経細胞や中枢神経系の特定領域の異なる集団の中の条件遺伝子操作を可能にします。我々は、マウスの脊髄後角における標的遺伝子発現またはサイレンシングを可能に定位注入技術を実証する。手術は短時間です。それは動物と脊椎の健常運動性の迅速なリカバリを提供する、単一の椎骨の椎弓切除術を必要とします。傾斜のガラスカニューレとシリンジの低速および使用に小さなベクター懸濁液量の制御された注射は組織病変を最小限に抑えます。ベクトルの局所免疫応答は、採用ウイルス固有の性質に依存し、我々の経験では、組換えアデノ随伴ウイルスを使用した場合、マイナーと短命です。このような強化された緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子は、ベクターの監視空間分布を容易にし、有効性や携帯仕様トランスフェクションのficity。

反対側、腹角および後根神経節の背角を温存注入後角（ 図1）の神経細胞で成功したトランスフェクションの利回り堅牢な遺伝子発現を、。 <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。後角ニューロンのトランスフェクション。L4脊髄の左後角における蛍光レポーターEGFP（緑色）の（）式は、2週間のrAAV-EGFPの定位注入後（血清型AAV2 / 8、10 9ゲノムコピー/ μL）。ニューロンは神経核タンパク質（NeuN、赤）の免疫染色した。矢印は、脊柱に散在トランスフェクトされたグリア細胞にポイントを率いている。スケールバーは、150μmである（B）内側背角ニューロンの約80％が感染していた。スケールバーは20μm。 NeuN（EMDミリポア）に対するモノクローナル抗体は1:2,0の希釈で使用した免疫染色のために00。

ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

本手順の全体的な目的は、腰髄後角にウイルスベクターを定位的に注入することにより、マウス脊髄における空間的に制限された遺伝子発現を実現することです。手順の最初のステップは、腰椎を特定し、露出させることです。次のステップでは、脊髄を露出させるために椎骨の背側部分を除去します。椎弓切除術と呼ばれる手順です。次に、マイクロシリンジポンプに接続されたガラスピペットを後角の上に配置し、脊髄内に挿入します。最後のステップは、ベクター懸濁液をゆっくりと注入することです。2週間後、緑色蛍光タンパク質の発現によって後角ニューロンへのトランスフェクションが確認され、これによりウイルスの分布を追跡することが可能になります。この手法は、感覚経路の一部におけるニューロンの機能を解明するのに役立ちます。私たちは、特に炎症性疼痛や神経因性疼痛の発症に焦点を当てた研究にこの手法を用いています。マウスをステレオタキシックフレーム内に配置する方法を習得するには、視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。椎弓切除術は非常に繊細な手技であるため、処置を成功させるには脊椎を適切に固定することが不可欠です。私の研究室の大学院生であるMartin Moleが、この手順を実演します。リサーチアシスタントのJohn Wangが、処置の1〜2日前に彼を補助します。手術当日に、ガラスピペットを延伸して先端径を40 micrometersにし、先端を20 degreesの角度で面取りします。まず手術器具を消毒し、滅菌済みの手術用ツールを準備して、脳定位固定装置をセットアップすることから処置を開始します。マイクロシリンジインジェクターをマニピュレーターに取り付け、デバイスの電源を入れます。コンプレッションフィッティングを使用して、ガラスピペットの1本をマイクロシリンジに取り付けます。次に、マイクロシリンジからプランジャーを取り出します。シリンジにミネラルオイルを満たし、プランジャーを再び挿入して先端まで完全に押し込みます。気泡が入らないように注意してください。その後、マイクロシリンジをインジェクターのホルダーに装着します。次に、冷凍庫からウイルスを取り出し、滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水で目的の粒子濃度まで希釈し、使用直前にウイルス粒子懸濁液を調製します。ウイルス懸濁液5 µLをパラフィルムの小さな断片上にピペッティングします。その後、ガラスピペットのチップを液滴の中に浸し、プランジャーを引いてマイクロシリンジに充填します。最後に、ピペットのチップが詰まるのを防ぐため、チップ先端に小さな気泡を作ります。このステップでは、ヒーティングパッド上のベンチを消毒剤で拭き、手術領域を準備します。次に、イソフルランの吸入によりマウスを麻酔します。続いて、手術中の乾燥を防ぐため、両目に潤滑剤を塗布します。その後、マウスの腰から首

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Porlan, E., et al.神経幹細胞の自律的および非自律的効果の解析のための成体マウスV‐SVZの細胞の安定的で効率的な遺伝子改変。J. Vis.

マウスモデルにおける安定した遺伝子組み換えのためのウイルスの定位注射

出典: Chen, S., et al., Stereotacic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。...

マウスの子犬線条体における遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

出典: Tadokoro, T., et al.成体マウスにおける軟膜下アデノ随伴ウイルス9(AAV9)ベクター送達J. Vis. 経験。(2017年)このビデオは、マウスの脊髄への遺伝子送達のための軟膜下注射技術を示しています。この手順には、硬膜を露出させ、軟膜に穿刺し、蛍光タンパク質発現遺伝子を運ぶ組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV)...

遺伝子発現を評価するためのマウス脊髄における軟膜下遺伝子送達

出典: Pereira, M. et al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Gial Cells into Interneurons by Intentrebral Injection of Viral Vectors.J. Vis.

マウスモデルにおけるグリア細胞リプログラミングのためのウイルスベクターの定位注射

出典: Fricano-Kugler, CJ, et al.定位注射による高力価CRISPR Retroおよびレンチウイルスの設計,パッケージングおよび送達J. Vis. 経験。(2016年)このビデオは、マウス脳における正確なニューロン遺伝子編集のための定位固定性ウイルス注射を示しています。このプロトコルは、歯状回への正確なウイルス送達を保証し、蛍光標識とCRISPRを介した遺伝子ノックアウトを可能にして、in...

マウス脳における標的ニューロン遺伝子編集のための定位固定性ウイルス注射

出典: Li, D., et al.成体マウスにおける組換アデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注射J. Vis. 経験。 (2019年)このビデオは、覚醒マウスの脳脊髄液(CSF)にアデノ随伴ウイルス(AAV)を髄腔内注射する手順を示し、注射器の準備、脊椎のアライメント、および正確な針の挿入をカバーしています。この方法は標的遺伝子送達を検証し、CNS...

中枢神経系疾患を治療するためのマウスモデルにおけるウイルスのくも膜下腔内送達

CRISPR / Cas9システムは、科学界にターゲットを絞ったゲノム編集がアクセス可能で、手頃な価格にする可能性を提供しています。このプロトコルは、CRISPR / Cas9システムを使用して、目的の遺伝子をノックアウトしてから、成体マウスの脳に定位的にそれらを注入するウイルスを作成する方法を実証することを意図しています。...

デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

シュプリンガー依存組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) の脊柱の注入は、脊髄内の任意の遺伝子組み換えラベル セル型を操作する使用できます。ここで我々...

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

このプロトコルは、ラット脊髄組織への逆行性可搬型ウイルスのベクトルの注入を示します。ベクトルはシナプスでとらし、ターゲット...

レンチ ウイルスのベクトルの直噴ハイライト ラット脊髄における複数の運動経路

このプロトコルは、順行性化学遺伝修飾剤を体性運動皮質に注入し、逆行性に輸送可能なCreリコンビナーゼを頸髄に注射することにより、生後5〜10日の新生児ラットの細胞の亜集団に遺伝子治療を適用するための新しい方法を示しています。...

脳と脊椎を組み合わせた手術を用いた二重ウイルスベクターによる新生児ラットの皮質脊髄路の標的化

腰椎髄腔内注射は、中枢神経系に遺伝子治療を実施するための翻訳的に関連する投与経路を表しています。新生児、若年、成体のマウスおよびラットにおける腰椎髄腔内注射のためのこの包括的な標準化されたプロトコルは、研究者がこの技術を前臨床遺伝子治療研究に採用する際の指針となることを目的としています。...

マウスおよびラットにおける中枢神経系を標的とした遺伝子治療ベクターの腰椎髄腔内注射

学ぶマウス脊髄へのウイルスベクター定位注射法。腰椎背角への正確な遺伝子導入により、感覚神経回路の機能解析や疼痛研究に応用可能な条件遺伝子操作技術を習得できます。

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

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