マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射
2013年3月18日
ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。
この手順の全体的な目標は、ウイルスベクターを腰椎背角に定位的に注入することにより、マウス脊髄で空間的に制限された遺伝子発現を達成することです。手順の最初のステップは、腰椎を見つけて露出させることです。2番目のステップは、脊髄を明らかにするために椎骨の背側部分を取り除くことです。
椎弓切除術と呼ばれる手順。次に、マイクロシリンジポンプに接続されたガラスピペットを背角の上に配置し、脊髄に降ろします。最後のステップは、ベクターサスペンションをゆっくりと注入することです。
2週間後、後角ニューロンのトランスフェクションは、ウイルスの分布を追跡することを可能にする緑色蛍光タンパク質の発現によって実証されました。この方法は、一部の感覚経路におけるニューロンの機能を解明するのに役立ちます。私たちは、特に炎症性または神経因性疼痛の発症に焦点を当てた研究でこれを使用しています。
視覚的なデモンストレーションは、マウスを定位フレームに配置する方法を学習するために重要です。椎弓切除術は非常に繊細な技術であるため、脊椎が適切に固定されることが手順の成功に不可欠です。私の研究室の大学院生であるMartin Moleが手順を実演します。
研究助手のジョン・ワンは、手術の1日か2日前に彼を助けます。Pulガラスピペットは、手術当日に先端径40マイクロメートルを取得し、先端を20度の角度で面取りします。手術器具を消毒し、定位固定装置フレームをセットアップするための滅菌手術器具を準備することから手順を開始します。
マイクロシリンジインジェクターをマニピュレーターに取り付け、デバイスを差し込みます。ガラス製ピペットの1つを、圧縮フィッティングを使用してマイクロシリンジに取り付けます。次に、マイクロシリンジからプランジャーを取り外します。
シリンジにミネラルオイルを充填し、プランジャーを再度挿入して先端まで押し込みます。気泡が発生しないように注意してください。次に、マイクロシリンジをインジェクターのホルダーに挿入します。
次に、ウイルスを冷凍庫から取り出し、使用直前にウイルス粒子懸濁液を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で目的の粒子濃度に希釈して調製します。5マイクロリットルのウイルス懸濁液を小さなパラムにピペットで移します。次に、ガラスピペットの先端をドロップに下げ、プランジャーを引いてマイクロシリンジを充填します。
結局。ピペットの先端に小さな気泡を作り、目詰まりを防ぎます。このステップでは、加熱パッドのベンチを消毒剤で拭いて手術エリアを準備します。
次に、isofフッ素吸入によりマウスに麻酔をかけます。次に、手術中の乾燥を防ぐために各目に潤滑剤を塗布します その後、マウスの背中の下部から首までの毛皮を剃ります。クロルヘキシジンやポビドンヨードなどの局所消毒剤と70%エタノールを交互にワイプして皮膚を消毒します。.
次に、生理食塩水で1〜10に希釈した0.25%ブピバカインを切開部位に浸潤します。その後、胸郭の蝶先、正中線に沿って2〜3センチメートルの皮膚を切開し、脊椎を覆う筋膜を分離します。椎骨L1は、椎骨に寄り添って位置し、最後の肋骨のペアを保持し、その背側表面に付着した小さな脊髄の筋肉と靭帯を取り除くことによってそれを露出させます。
次に、椎骨Lを少し持ち上げて保持し、一対の添加剤と鉗子で保持します。次に、専用の椎弓切除鉗子を使用して、棘突起と脊髄を露出させるための椎弓板を含む椎骨の背側部分を切除します。この手順中に硬膜や脊髄を損傷しないようにしてください。
次に、マウスを脳定位固定装置フレームの加熱プレートに移し、その後の操作中にマウスの温度を監視します。次に、vノッチスパイクを使用して脊椎を安定させ、呼吸中に椎骨が動かないようにします。次に、マイクロシリンジを近づけて、ピペットの先端が椎弓切除部位の上にくるようにします。
ウイルス懸濁液がピペットから出るのが見えるまで、プランジャーを下げます。滅菌ガーゼで液滴を取り除きます。次に、ピペットの先端を露出した脊髄の吻側の最も部分に配置します。
ピペットを後正中溝の中央に配置し、先端を横方向に500マイクロメートル動かします。その後、先端をコードの表面まで下げ、硬膜に穴を開けます。続いて、ガラスの先端を下げ、脊髄に300マイクロメートルピペットで入れます。
1マイクロリットルのウイルス懸濁液を毎分200ナノリットルの速度で注入します。注入が終了したら、少なくとも2分待ってから、ピペットをゆっくりと引っ込めます。露出した脊髄のコドルのほとんどの部分で注入手順を繰り返して、脊椎セグメントL 4にウイルスベクターを完全に分布させます。
2つの注射部位は吻側にあり、L4セグメントに寄り添っています。注射放出後の標的領域の組織損傷を避けるために、Vノッチから椎骨Lをクランプし、マウスを脳定位固定装置フレームから取り外します。次に、5つのoh Vicrylで筋膜を縫合します。
閉じた筋膜は、椎弓切除部位のカバーを提供します。次に、ナイロン縫合糸または外科用ステープルで皮膚を閉じます。術後鎮痛を 72 時間提供し、毎日 5 ミリグラム/キログラムのカルプロフェンを皮下注射します。
マウスを、特定のものではない柔らかい寝具を備えたリカバリーケージに移します。マウスを横に置いて、呼吸を楽にします。次に、動物が完全に警戒するまで動物を監視します。
救急車が運ばれ、飲酒を開始します。最初の3日間は毎日の検査により、術後の回復を監視します。その後、実験が完了するまで、隔日または週に3日おきに。
手術後7〜10日後、創傷治癒が完了します。皮膚の縫合糸またはステープルを取り外します。この図は、L型4脊髄の左後角における増強緑色蛍光レポータータンパク質またはEGFPの発現を示しています。
R-A-A-V-E-G-F-Pニューロンの定位固定注射の2週間後、ニューロン核タンパク質の免疫染色が行われました(赤い矢印の頭)。背柱に散在するトランスフェクトされたグリア細胞をポイントします。内側背角のニューロンの約80%が感染していました。
施術は30分から40分で完了しますので、施術中は無菌状態を維持することを忘れないでください。このビデオを見た後、マウスの脊髄の用量に松内キマル注射を行う方法をよく理解しているはずです。この技術は遺伝子操作に使用されていますが、脊髄内薬物の適用など、他の目的にも適応させることができます。
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概要
本研究では、腰髄後角へのウイルスベクターの定位注入により、マウス脊髄における空間的に制限された遺伝子発現を実現する方法を提示します。この手法により、特に一次体性感覚求心性神経と中枢神経系ニューロンとのシナプス接合部位において、標的を絞った遺伝子操作が可能となります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 遺伝子治療
- 脊髄研究
背景
- 遺伝子操作にはウイルスベクターが使用されます。
- 腰髄後角は、シナプス相互作用の重要な部位です。
- 条件付き遺伝子発現は、神経メカニズムの理解に役立ちます。
- 脳定位注入法は、特定の脳領域を標的とするための精密な手法です。
研究の目的
- 脊髄における標的遺伝子発現を実現すること。
- 遺伝子操作が脊髄機能に及ぼす影響を検討すること。
- 今後の研究に向けた手法的な枠組みを提供すること。
使用された手法
- 腰椎の特定と露出。
- 脊髄に到達するための椎弓切除術の施行。
- マイクロシリンジポンプに接続したガラスピペットの使用。
- 後角へのウイルスベクター懸濁液の注入。
主な結果
- 腰髄後角へのウイルスベクターの注入に成功した。
- 標的ニューロンにおいて条件付き遺伝子発現が観察された。
- 空間的に制限された操作に対する本手法の有効性が実証された。
- 脊髄関連疾患の研究における応用の可能性がある。
結論
- この手法により、脊髄における精密な遺伝子操作が可能になります。
- 神経機能における特定の遺伝子の役割を調査するために利用できます。
- このアプローチは、脊髄の生理学的理解を深める可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
定立定位的なウイルスベクター導入により、感覚処理および疼痛経路研究の重要領域であるマウス脊髄後角において、空間的に限定された精密な遺伝子操作が可能になります。この手法は、定義された神経細胞集団における条件付きの遺伝子発現またはサイレンシングを可能にすることで、神経科学における発見過程でのターゲット検証およびメカニズムの低リスク化を支援します。本法は、前臨床疼痛モデルにおいて遺伝的ターゲットと機能的表現型を関連付けるための再現性のあるプラットフォームを提供し、ターゲット選択におけるゴー/ノーゴー判断の根拠となります。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 特定の脊髄ニューロン集団において条件付き遺伝子発現を可能にすることで、治療仮説の検証を行う。
- 運用の価値： 研究間で腰髄後角を一貫して標的とするための、標準化された外科的手法を提供する。
- 予測的価値： 痛みの経路における遺伝子機能の表現型スクリーニングをサポートし、標的の信頼性評価に寄与する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：定量可能なトランスフェクション指標（例：EGFP発現）を生成し、ベクター導入効率および細胞特異性を評価できる。
- 運用上の価値：疼痛モデルにおける下流の化合物またはモジュレータースクリーニングに向けて、検証済みの生物学的系の調製を可能にする。
- 拡張性：簡便な手順（30～40分）と迅速な動物の回復により、創薬ワークフローにおけるスループットの向上が支持される。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：炎症性および神経性疼痛のメカニズムを直接的にモデル化しており、治療領域の優先事項と一致している。
- トランスレーショナルな連続性：脊髄標的の変調を疼痛の行動表現型に関連付け、前臨床試験での検証をサポートする。
- リスク調整後の進展：疾患に関連する回路において遺伝子特異的な効果を単離することで、メカニズム的なリスク低減を可能にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、標的仮説の検証からリード化合物の同定、さらには前臨床検証に至る創薬のプロセスに適合しており、特に感覚処理に関与する中枢神経系（CNS）標的に対して有効です。
- 探索生物学： 脊髄の限定された領域において空間的に制御された遺伝子操作を可能にし、仮説検証を支援します。
- スクリーニング： ベクターの性能および生物学的効果を評価するための定量的データ（例：蛍光強度、細胞特異的トランスフェクション率）を提供します。
- 分析： トランスフェクション効率と機能的アウトカムとの相関を可能にし、用量反応およびターゲットエンゲージメントの評価に情報を供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 脊髄の遺伝子操作を疼痛関連の表現型に結びつけ、バイオマーカーに基づいた前臨床研究を支援します。
- エンタープライズ再利用： 複数のプロジェクトにわたり、さまざまなウイルスベクター、プロモーター、または導入遺伝子に適応可能な、再利用可能な外科的プラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： オフターゲット効果を軽減し、遺伝子操作研究における解剖学的精度を高めることで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用の価値： 標準化された定位座標、注入パラメータ、および術後ケアを通じて、再現性を促進します。
- 戦略的価値： 疼痛経路における標的機能のメカニズムを明確にすることで、go/no-go判断の質を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みの脊髄表現型に基づき、リスク調整後の標的優先順位付けを容易にします。
実施上の留意点
- げっ歯類の定位固定手術、マイクロサージェリー技術、および無菌操作の実行に関する専門知識が必要です。
- 定位固定装置、マイクロシリンジポンプ、面取りガラスピペットなどの専用器具に依存します。
- 実験間での投与量を一定にするため、標準化されたウイルスベクターの調製とタイターの確認が必要です。
- 異なる脊髄セグメント、ウイルスセロタイプ、または導入遺伝子のペイロードに応じた適応上の検討事項が含まれます。
- 実用上の制限として、手術のばらつきや組織反応が挙げられ、これらは操作者のトレーニングとプロトコルの標準化によって制御する必要があります。
