マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

この手順の全体的な目標は、ウイルスベクターを腰椎背角に定位的に注入することにより、マウス脊髄で空間的に制限された遺伝子発現を達成することです。手順の最初のステップは、腰椎を見つけて露出させることです。2番目のステップは、脊髄を明らかにするために椎骨の背側部分を取り除くことです。

椎弓切除術と呼ばれる手順。次に、マイクロシリンジポンプに接続されたガラスピペットを背角の上に配置し、脊髄に降ろします。最後のステップは、ベクターサスペンションをゆっくりと注入することです。

2週間後、後角ニューロンのトランスフェクションは、ウイルスの分布を追跡することを可能にする緑色蛍光タンパク質の発現によって実証されました。この方法は、一部の感覚経路におけるニューロンの機能を解明するのに役立ちます。私たちは、特に炎症性または神経因性疼痛の発症に焦点を当てた研究でこれを使用しています。

視覚的なデモンストレーションは、マウスを定位フレームに配置する方法を学習するために重要です。椎弓切除術は非常に繊細な技術であるため、脊椎が適切に固定されることが手順の成功に不可欠です。私の研究室の大学院生であるMartin Moleが手順を実演します。

研究助手のジョン・ワンは、手術の1日か2日前に彼を助けます。Pulガラスピペットは、手術当日に先端径40マイクロメートルを取得し、先端を20度の角度で面取りします。手術器具を消毒し、定位固定装置フレームをセットアップするための滅菌手術器具を準備することから手順を開始します。

マイクロシリンジインジェクターをマニピュレーターに取り付け、デバイスを差し込みます。ガラス製ピペットの1つを、圧縮フィッティングを使用してマイクロシリンジに取り付けます。次に、マイクロシリンジからプランジャーを取り外します。

シリンジにミネラルオイルを充填し、プランジャーを再度挿入して先端まで押し込みます。気泡が発生しないように注意してください。次に、マイクロシリンジをインジェクターのホルダーに挿入します。

次に、ウイルスを冷凍庫から取り出し、使用直前にウイルス粒子懸濁液を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で目的の粒子濃度に希釈して調製します。5マイクロリットルのウイルス懸濁液を小さなパラムにピペットで移します。次に、ガラスピペットの先端をドロップに下げ、プランジャーを引いてマイクロシリンジを充填します。

結局。ピペットの先端に小さな気泡を作り、目詰まりを防ぎます。このステップでは、加熱パッドのベンチを消毒剤で拭いて手術エリアを準備します。

次に、isofフッ素吸入によりマウスに麻酔をかけます。次に、手術中の乾燥を防ぐために各目に潤滑剤を塗布します その後、マウスの背中の下部から首までの毛皮を剃ります。クロルヘキシジンやポビドンヨードなどの局所消毒剤と70%エタノールを交互にワイプして皮膚を消毒します。.

次に、生理食塩水で1〜10に希釈した0.25%ブピバカインを切開部位に浸潤します。その後、胸郭の蝶先、正中線に沿って2〜3センチメートルの皮膚を切開し、脊椎を覆う筋膜を分離します。椎骨L1は、椎骨に寄り添って位置し、最後の肋骨のペアを保持し、その背側表面に付着した小さな脊髄の筋肉と靭帯を取り除くことによってそれを露出させます。

次に、椎骨Lを少し持ち上げて保持し、一対の添加剤と鉗子で保持します。次に、専用の椎弓切除鉗子を使用して、棘突起と脊髄を露出させるための椎弓板を含む椎骨の背側部分を切除します。この手順中に硬膜や脊髄を損傷しないようにしてください。

次に、マウスを脳定位固定装置フレームの加熱プレートに移し、その後の操作中にマウスの温度を監視します。次に、vノッチスパイクを使用して脊椎を安定させ、呼吸中に椎骨が動かないようにします。次に、マイクロシリンジを近づけて、ピペットの先端が椎弓切除部位の上にくるようにします。

ウイルス懸濁液がピペットから出るのが見えるまで、プランジャーを下げます。滅菌ガーゼで液滴を取り除きます。次に、ピペットの先端を露出した脊髄の吻側の最も部分に配置します。

ピペットを後正中溝の中央に配置し、先端を横方向に500マイクロメートル動かします。その後、先端をコードの表面まで下げ、硬膜に穴を開けます。続いて、ガラスの先端を下げ、脊髄に300マイクロメートルピペットで入れます。

1マイクロリットルのウイルス懸濁液を毎分200ナノリットルの速度で注入します。注入が終了したら、少なくとも2分待ってから、ピペットをゆっくりと引っ込めます。露出した脊髄のコドルのほとんどの部分で注入手順を繰り返して、脊椎セグメントL 4にウイルスベクターを完全に分布させます。

2つの注射部位は吻側にあり、L4セグメントに寄り添っています。注射放出後の標的領域の組織損傷を避けるために、Vノッチから椎骨Lをクランプし、マウスを脳定位固定装置フレームから取り外します。次に、5つのoh Vicrylで筋膜を縫合します。

閉じた筋膜は、椎弓切除部位のカバーを提供します。次に、ナイロン縫合糸または外科用ステープルで皮膚を閉じます。術後鎮痛を 72 時間提供し、毎日 5 ミリグラム/キログラムのカルプロフェンを皮下注射します。

マウスを、特定のものではない柔らかい寝具を備えたリカバリーケージに移します。マウスを横に置いて、呼吸を楽にします。次に、動物が完全に警戒するまで動物を監視します。

救急車が運ばれ、飲酒を開始します。最初の3日間は毎日の検査により、術後の回復を監視します。その後、実験が完了するまで、隔日または週に3日おきに。

手術後7〜10日後、創傷治癒が完了します。皮膚の縫合糸またはステープルを取り外します。この図は、L型4脊髄の左後角における増強緑色蛍光レポータータンパク質またはEGFPの発現を示しています。

R-A-A-V-E-G-F-Pニューロンの定位固定注射の2週間後、ニューロン核タンパク質の免疫染色が行われました(赤い矢印の頭)。背柱に散在するトランスフェクトされたグリア細胞をポイントします。内側背角のニューロンの約80%が感染していました。

施術は30分から40分で完了しますので、施術中は無菌状態を維持することを忘れないでください。このビデオを見た後、マウスの脊髄の用量に松内キマル注射を行う方法をよく理解しているはずです。この技術は遺伝子操作に使用されていますが、脊髄内薬物の適用など、他の目的にも適応させることができます。