培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

本プロトコルの全体的な目的は、複数の細胞内リードアウトを同時にモニタリングすることで、ゲノムスケールでの遺伝子機能の解析を可能にすることです。本デモンストレーションでは、Firefly RANおよびCipro Dinaルシフェラーゼベースのリポーターを用いて、それぞれP 53 WINTおよびKRASパスウェイの活性をモニタリングします。これら3つのリポーターを、標的遺伝子をターゲットとするirnaと共に、大腸がん細胞株であるHCT one 16細胞に共導入します。

続いて、細胞溶解液中のホタルルシフェラーゼおよびバニラルシフェラーゼの活性を測定し、同時に、分泌酵素であるCipro DEAルシフェラーゼの活性を培養液中で測定します。得られた培地の結果から、本アッセイシステムの再現性と、これら3つの癌関連経路における遺伝子の共通および固有の作用を明らかにできることが示されます。

本手法のマイクロアレイやマルチカラープローブなどの既存手法に対する主な利点は、細胞の転写出力を観察するための安価で汎用的かつ費用対効果の高い方法であることです。この手法は、分子標的治療戦略の開発など、がん研究における疑問の解決に役立ちます。我々の一過性トランスフェクションプロトコルは、ILおよびスクリーニングセットアップへの事前の時間的拘束を最小限に抑えていますが、ウェル間のシグナル変動が増大する可能性があります。これについては、ウェルからの絶対的な値ではなく、レポーター比を確認することで対処可能です。本手順を開始するには、80〜90%にコンフルエントとなったHCT 116細胞が入った10 cm²プレート5枚をPBSで洗浄し、その後、各プレートの細胞をトリプシン処理により回収します。

1 mLのトリプシン溶液を用い、続いて2% FBSおよび1% ペニシリン・ストレプトマイシンを含む10 mLのDMEMで中和します。懸濁した細胞を50 mLのコニカルチューブに移し、約130 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを10 mLの培地で再懸濁します。

セルカウンターを用いて細胞数を計測し、1 mLあたり10⁵個の細胞溶液を調製します。マルチドロップ自動液体分注機を用いて、次のステップ用に150 mLの細胞懸濁液を用意します。96ウェル培養プレートの各ウェルに、100 µL（または10⁴個の細胞）を分注します。

この場合の細胞懸濁液は、1296ウェルのプレートに播種するのに十分な量である必要があります。トランスフェクション混合液を調製している間、細胞が入ったプレートを5%二酸化炭素含有のインキュベーター内にて37°Cでインキュベートします。ここで使用した高品質のリポーター構築用DNAは、標準的なMIDI prepキットを用いて単離し、最終濃度が1 mg/mLになるように希釈したものを使用しました。

各レポーターについて、以下の30 µLのP 53, FL、30 µLのeight X-T-C-F-R-L、30 µLのelk one G、46 µLのU-A-S-C-L、および4 µLのH₂Oを混合し、100 µLのレポーターコンストラクトストック溶液を調製します。これにより、レポーターの最終比率が1:1:1:0.2で、最終DNA濃度が0.3 mg/mLのDNA混合物が得られます。次に、1296個をトランスフェクションするのに十分な量のI-R-N-A-D-N-Aトランスフェクション混合物を調製します。

ウェルプレートを用い、QIAGENエフェクティングキットのECバッファー8 mLに、レポーター構築物ストック溶液80 µLを希釈し、最終濃度3 µg/mLのDNA溶液を調製します。このDNA溶液を、96ウェルPCRプレートの各ウェルに20 µLずつ分注します。使用する96ウェルプレートの枚数は、テストするirnaプールの数によって異なります。

例えば、このケースでは、評価に4枚の96ウェルプレートが必要になります。Biome社製自動液体分注機を用い、384種類のsiRNAプールから、希釈したDNAストックを含むPCRプレートの対応するウェルに、5 µMのsiRNAを2 µLずつ分注します。次に、DNAおよびsiRNAを含むプレートの各ウェルに、エンハンサー溶液を1 µLずつ加えます。

室温で5分間、エンハンサー反応を進行させます。その後、各ウェルに3 µLのトランスフェクション効率化試薬を加え、さらに室温で10分間インキュベートします。トランスフェクション複合体の形成を停止させるため、PCRプレートの各ウェルに2% FBSおよび1% ペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEMを10 µL加えます。

HCT 116細胞を含む1296ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。各トランスフェクションを3連（triplicate）で行うため、細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに、トランスフェクション混合液を10 µLずつ分注します。同様の混合液を、細胞を含むさらに2枚の96ウェルプレートにも適用します。

細胞をトランスフェクション混合物とともに、37 °C、5%二酸化炭素含有の加湿環境下で36時間インキュベートします。細胞へのトランスフェクションから36時間後、ルシフェラーゼ活性の測定が可能です。

本研究では、培養液中に分泌されるレポーター1種と、細胞質内で発現するレポーター2種の計3種のレポーターを組み込んでいます。培養液中のCipro DinaルシフェラーゼまたはCL活性を検出するため、培養液と細胞溶解液の両方から測定を行います。培地レプリカプレート。

20 µLの培地を白色不透明96ウェルプレートに分注します。マルチドロップを用いて、各ウェルに20 µLのCLアッセイバッファーを加えます。次に、10 µLのCipro Dina Luciferおよび基質を各ウェルに加え、ルミノメーターを用いてホタルルシフェラーゼおよびバニラルシフェラーゼの活性を測定し、CL活性を検出します。なお、あらかじめ細胞溶解液を作製しておく必要があります。

各プレートを逆さまにして培地をシンクに捨てることで、細胞から培養液を除去します。逆さまにしたプレートをペーパータオルで軽く叩き、残った培地を取り除きます。各ウェルの細胞に、1xパッシブライシスバッファーを30 µL加えます。

プレートを中速に設定したプラットフォームロッカーに置き、室温で5分間振盪させます。5分後、細胞が入った各ウェルにluciferase assay reagentを20 µL加え、直ちにルミノメーターを用いてホタルルシフェラーゼ活性を測定します。次に、stop and glow reagentを加えてホタルルシフェラーゼ活性を消光させ、ルシフェラーゼ活性を測定します。

マルチプレックス化に先立ち、3つの異なるスクリーニングプラットフォームの堅牢性を個別に評価しました。指定した大腸がん細胞株に、8種類のXTCF PP 53 ta LukeまたはALK one Firefly Luciferaseをコードするレポーター構築物と、それぞれWINT beta-Catenin、P 53、またはKASを標的とするsiRNAプールをトランスフェクションしました。各細胞株のパスウェイに関連する遺伝子型を記載しています。

各スクリーニングプラットフォームの有用性は、関連するシグナル伝達経路におけるこれらの誘導効果の再現性によって評価されました。これらの代表的な結果に示されているように、ベタインおよびsiRNAは、RKO細胞における8つのXTCFレポーター活性に影響を与えませんでした。これは、それぞれAPC経路が欠損しているDLD-1細胞や、サプレッサープロテインが欠損し活性化型β-カテニンを発現しているHCT116細胞とは対照的です。

続いて、これらのレポーターを併用することで、グラフに示したsiRNAプールを用いて、Wnt β-catenin、p53、およびKRASシグナル伝達経路の遺伝子活性を同時に測定できることが示されました。Y軸に相対的なルシフェラーゼ活性を、X軸に標的とする目的遺伝子のsiRNAを示しています。例えば、β-cateninを標的とするsiRNAプールは、Wnt β-catenin経路の活性を低下させますが、p53およびKRAS経路には有意な影響を与えません。

マルチプレックスリポーターシステムの構築にあたっては、目的の細胞株を、トランスフェクション効率およびリポーター信号の強度に応じて最適化することが重要です。