Name: アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学ぶアレイ化RNAiライブラリスクリーニングとデュアルルシファーゼアッセイを用いた転写因子レギュレーター同定法。がん細胞における遺伝子発現制御メカニズム解明に有用で、中スループットかつ低コストな手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

エミリー・ノートンとミカエラン・クッチャレ・ストゥリグロスがshRNAベクターの調製を支援してくれたことに感謝します。この作品の一部は、J.M.L.(#CCR17477184)に授与されたスーザン・G・コーメンキャリア触媒助成金によって支えられました。

注 : このプロトコルの概略的な概要を図 1に示します。
1. レンチウイルスベクターライブラリー調製
注:実証済みの画面では、96ウェルプレートでグリセロールストックとして購入した配列付きshRNAライブラリを使用していましたが、ライブラリは候補のリストに基づいて手動で組み立てることもできます。適切なコントロールを考慮し、ライブラリに含める必要があります。これには、非標的対照shRNA(shNTC)、調査中の転写因子を標的とするコントロールshRNA、および可能であれば、ホタルルシファーゼを標的とするshRNAが含まれる。
<ol><li>100 μg/mL のアンピシリンを含むルリアブロス(LB)(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH 7.5)を96ウェル深いウェルプレートの各ウェルに加えます。グリセロールストック2 μLで各ウェルウェルを接種し、225 rpmで一定の撹拌で一晩37°Cで成長させます。</li>
	<li>各細菌培養物を1.5mL遠心分離チューブに移し、4°Cで21,000xgで10分間遠g心分離して細菌をペレット化します。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って、細菌のミニプレップキットを使用して各ベクターを精製します。</li>
	<li>分光光度計を用いて各ベクターの濃度を決定する。</li>
	<li>プラスミドは-20°Cで保管してください。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>2. 配列レンチウイルスライブラリのパッケージング
注:レンチウイルスに関するすべての作業は、感染細胞の包装、感染、およびその後の培養を含め、制度上のバイオセーフティ規則および規制に厳密に従う必要があります。
<ol><li>完全な成長培地(ダルベックの改変イーグル培地(DMEM)4 mM L-グルタミン、4,500mg/Lグルコース、ピルビン酸ナトリウム、10%のウシ胎児血清(FBS)、100μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレピシン、LM.抗生物質を含む293FT細胞を拡大します。</li>
	<li>ステップ 1.4 からライブラリ内の各ベクターに対して、1 x 105 293FT セルを 1 つの 24 ウェルにシードします。 注:コントロールウイルスベクターのいくつかの余分な井戸をパッケージ化し、ステップ3に進む前にウイルスのタイターをテストするために使用することをお勧めします(下記参照)。</li>
	<li>37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。 注:14の前に説明したレンチウイルスをパッケージ化するための一般的なプロトコルは、このプロトコルの 24 ウェルに縮小されました。レンチウイルス包装にはpsPAX2を、コートタンパク質としてVSVGを使用します。エトロピックウイルスが望ましい場合は、VSVGの代わりにEcoを送達するベクターを使用することができます。このプロトコルは、標的細胞の30%〜70%の感染効率を与えるウイルス力を達成するために最適化されることを強くお勧めします(議論参照)。使用されるすべてのベクトルのリストについては、補足表 1を参照してください。</li>
	<li>以下に説明するステップ1.4から各ウイルスベクターにトランスフェクション混合物を設定する。各トランスフェクションには、250 ngのウイルスベクター、125 ngのpsPAX2、125 ngのVSVG、1.25 μLのトランスフェクション試薬1、および23.75 μLのトランスフェクションバッファーが含まれている必要があります(材料表を参照)。<ol>
<li>レンチウイルスベクターをヌクレアーゼを含まない水で50 ng/μLに希釈し、5 μL(250 ng)を96ウェルPCRプレートのウェルに移します。</li>
		<li>トランスフェクション試薬1と23.75 μLのトランスフェクション試薬1と23.75 μL*Xを混合してトランスフェクションスーパーミックスを行い、そこで「X」はトランスフェクションの総数とピペット処理中の体積損失を考慮する追加のトランスフェクション数です。</li>
		<li>トランスフェクションスーパーミックスを室温で5分間インキュベートします。</li>
		<li>ステップ2.4.3からトランスフェクションスーパーミックスのチューブにpsPAX2と125 ng * XのpsPAX2と125 ng * Xを追加し、ミックスするために上下に穏やかにピペット。ステップ 2.4.5 に迅速に進みます。</li>
		<li>直ちにステップ2.4.4からPCRストリップの各チューブに混合物をアリコートし、マルチチャンネルピペットを使用して、ステップ2.4.1からウイルスベクターを含む各ウェルに25μLの混合物を転送します。</li>
		<li>室温で20分間インキュベートします。</li>
		<li>ステップ2.4.6の各96ウェルから、ステップ2.3から293 FTセルを含む293個のウェルのウェルに30μLすべてを転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°Cで24時間5%CO2で細胞2をインキュベートし、24ウェルプレートのすべてのウェルの培地を500μLの新鮮な完全成長培地に置き換えます。37°Cで細胞を5%CO2でインキュ2ベートし、さらに24時間培養します。</li>
	<li>マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルとアリコート220 μL(ステップ3の1感染と余分な体積に十分)からウイルス上清を2つの96ウェルに集めます。これらは配列されたウイルス上清の版である。</li>
	<li>配列されたウイルス上清プレートを-80°Cに保存してください。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。また、ステップ 3 に進む前に、感染する細胞にパッケージ化されたコントロール ウイルス (上記を参照) の一部をテストすることをお勧めします。これは、力価が少なくとも30%の感染効率を達成するのに十分であることを保証するためである。</li>
</ol>3. 画面の細胞の感染
注:ヒト黒色腫細胞(A375)は、このアプローチを実証するために使用されましたが、この方法はレンチウイルスに感染する任意の付着細胞に適用することができます。ただし、細胞培養とめっき条件は、細胞株ごとに最適化する必要があります(説明を参照)。
<ol><li>完全な増殖培地で感染する細胞を展開します。</li>
	<li>1 x 10 5細胞を1x105細胞でシード24ウェルプレートに0.5 mlの完全な成長培地で使用します。シード1は、各ウイルスベクター(コントロールを含む)をテストし、ステップ3.7で薬物選択のための制御として機能する感染しない余分な井戸を含む。</li>
	<li>37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。</li>
	<li>ステップ3.2の各ウェルに、凍結配列されたレンチウイルス上清とは異なるウイルス上清を次のように感染させる。<ol>
<li>20 μg/mL ポリブレンを含む完全な成長培地を準備します。</li>
		<li>ステップ2.7から室温まで配列レンチウイルスライブラリー上清を解凍します。</li>
		<li>ステップ3.2から24ウェルプレートから成長培地を吸引し、すぐに各ウェルに200μLのポリブレン含有成長培地を加えます。</li>
		<li>マルチチャンネルピペットを使用して、ステップ3.4.2からステップ3.4.3から24ウェルに各96ウェルからウイルス上清の200 μLを移します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>24〜48時間の5%CO2で37°Cで細胞をインキュベートする。 注:一部の細胞株は、shRNAを発現し、ピューロマイシン耐性になるために24時間より長く必要な場合があります。ここで使用されるウイルスベクターは、3'UTRのmiR30ベースのshRNAを持つターボGFP-IRES-puroRを提供する(図1)。プロマイシン耐性遺伝子及びshRNAの感染効率及び発現を緑色蛍光タンパク質によりモニタリングした。</li>
	<li>2.5 μg/mL のピューロマイシンを含む完全な成長培地を準備します。 注:ピューロマイシンの選択濃度は細胞株によって異なります。スクリーンの前にアッセイされる細胞株ごとに抗生物質殺し曲線を実行することが推奨される。</li>
	<li>各ウェルから培地を吸引し、500 μLのピューロマイシン含有完全成長培地に交換します。 注:また、ピューロマイシンの選択が完了したことを確認するために、後続の手順で使用することができるコントロール非感染井戸にピューロマイシンを追加してください。</li>
	<li>37°Cで細胞を5%CO2で482時間インキュベートする。 注:48時間選択するのが最善なので、細胞が48時間より前に過剰にコンペラしないように、メッキ密度とウイルス性の強化剤を最適化する必要があります。</li>
	<li>感染した細胞が蛍光顕微鏡下で緑色であり、プロロマイシンで処理されたコントロール上の細胞がすべて死んでいることを確認してから、ステップ4に進みます。</li>
</ol>4. 二重ルシファーゼレポータートランスフェクション用の細胞の播種
注: テストトランスフェクションは、各新しいセルラインの最適な播種密度を決定するために行う必要があります。
<ol><li>ステップ3.9から各ウェルをトリプシン化し、次のように新しい24ウェルプレート上の対応する位置でウェルに約1 x 105細胞を転送します。 注: このプロトコルは、数百の shRNA を持つライブラリのスクリーニング用に設計されているので、感染した細胞のすべてのウェルをカウントすることは不可能です。したがって、以下のステップを使用して、各ウェルのセル数を推定し、ほぼ等しいめっき密度を確保しました。<ol>
<li>ステップ3.9から3-4グループにウェルをグループ化し、グループ内のすべてのウェルが同様の細胞密度を有する。</li>
		<li>トリプシンEDTAの200 μL(1x PBSは0.5 mM EDTAと0.1%トリプシンで補う)を37°Cで5分間、各グループから1代表ウェルにトリプシンします。その後、完全な成長培地を含む400 μLのピューロマイシンを添加してトリプシン-EDTAを中和します。</li>
		<li>各代表ウェルをカウントして総細胞数を決定し、完全な増殖培地を使用して各代表ウェルから細胞懸濁液を2 x 105細胞/mLに希釈します。</li>
		<li>ステップ4.1.3から新しい24ウェルプレートの対応する位置に各ウェルの各ウェルのシード0.5 mL(1 x 105細胞)を新しい24ウェルプレートの対応する位置に、この新しい24ウェルプレートを37°Cで24時間5%CO2でインキュベートします。2</li>
		<li>ステップ 4.1.1 のグループごとに、ステップ 4.1.3 で決定した合計セル数を使用してトリプシン EDTA の量を計算し、結果として得られるセル懸濁液が 1 x 106セル/mL になるように各ウェルに加算します。</li>
		<li>各ウェルに適切な量のトリプシン-EDTAを加え、37°Cで5分間インキュベートします。 注:大きな画面では、細胞の生存率を確保するために、24ウェルプレートをトリプシン化し、一度にではなくグループに再入れすることをお勧めします。</li>
		<li>上記のインキュベーション中に、マルチチャンネルピペットを使用して、400 μLのピューロマイシン含有完全成長培地を、新しい24ウェルプレートの対応するウェルに添加します。</li>
		<li>ステップ4.1.7で調製した新しい24ウェルプレート上の対応する位置に、各ウェルから100 μLの細胞懸濁液(約1 x 105細胞)を移します。</li>
		<li>ステップ 4.1.1.1 からグループ化されたウェルのすべてのプレートに対して、ステップ 4.1.6 ~ 4.1.8 を繰り返します(一度に 1 つのプレート)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。</li>
</ol>5. 二重ルシファーゼレポーターのトランスフェクション
<ol><li>ステップ4.2から各井戸を、次のようにデュアルルシファーゼレポーターを構築してトランスフェクトします。 注:レニラルシファーゼベクターを制御するホタルルシファーゼレポーターベクターのDNAの総量と最適比は、このアッセイを開始する前に決定する必要があります。ここでは、20部ホタルルシファーゼレポーターと1部制御レニラルシメラーゼを含むDNA混合物の400ngが使用された。<ol>
<li>トランスフェクション希釈混合物(チューブA)とレポーター希釈混合物(チューブB)を各試薬の示された量(表1)にトランスフェクションの総数(プラス数個)を掛けたものにして作ります。 注: このプロトコルはトランスフェクション試薬 2 用に最適化されています(資料表を参照)。別のトランスフェクション試薬を使用する場合、トランスフェクションは、このステップの前に最適化する必要があります。</li>
		<li>トランスフェクション希釈混合物(チューブA)をレポーター希釈混合物(チューブB)と混合し、室温で15分間インキュベートしてトランスフェクション混合物を製造する。</li>
		<li>上記のインキュベーション中に、ステップ4.2の各24ウェルを0.25 mLのリン酸緩衝塩(PBS)でリンスし、各ウェルに447μLの完全な成長培地を加えます。</li>
		<li>15分インキュベーションの後、マルチチャンネルピペットを使用して、24ウェルプレートの各ウェルに53 μLのトランスフェクションミックスを分配します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°Cで細胞を5%CO2で242時間インキュベートする。</li>
</ol>6. 二重ルシファーゼ活性の定量化
<ol><li>プレートリーダーと、以下に説明するデュアルルシファーゼレポーターアッセイキットを用いてルシファーゼ活性を測定します。 注:このプロトコルは、示されたレポーターアッセイキット(資料表を参照)に最適化されており、メーカーの推奨プロトコルに従います。<ol>
<li>5x受動溶菌バッファー(キットに用意)1~5を脱イオン水で希釈して、すべてのウェルに加えていくつかの余分な(ウェルあたり75 μLが必要)十分な1x受動溶精バッファーを準備します。また、試薬Aおよび試薬Bバッファ(キットに設けられており、各ウェルにそれぞれ100μLずつ必要です)。</li>
		<li>ステップ5.2から24ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引する。</li>
		<li>1x受動リシスバッファーの 75 μL を各ウェルに加え、時折揺れで 30 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>50x試薬B基板(キットに設けられている)を解凍した試薬Bバッファーで1:50希釈して試薬Bを調製した。</li>
		<li>1x受動リシスバッファーの 30 μL をブランキング用の 4 ウェルに追加します (補足表 2を参照)。</li>
		<li>ステップ6.1.3から30 μLのライセートを96ウェルの平底白色アッセイプレートの重複ウェルに移します。</li>
		<li>マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50 μLの試薬Aを加え、プレートリーダーでホタルルシファーゼ信号を読み取ります。</li>
		<li>マルチチャンネルピペットを使用して、ステップ6.1.4から50μLの試薬Bを各ウェルに加え、プレートリーダーでレニラルシファーゼ信号を読み取ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>生データを次のように処理します (詳細については補足表2を参照)。<ol>
<li>低い値として非常に低いレニラルシファーゼシグナルを有するサンプルを除外するウイルス構築物が有毒であったか、またはあまりにも少数のトランスフェクト細胞がアッセイされたことを示す。 注:議論で説明したように、大幅に「低い」レニラルシファーゼ信号は異常な結果をもたらすことができます。ここで、レニラルシファーゼシグナルが平均より1標準偏差を超えていたウェルは除外した(補足表2参照)。これは、これらの細胞14においてこのレポーターシステムを用いて行われた以前の研究に基づいていたが、他の細胞株では異なる場合がある。</li>
		<li>各ウェルの生ホタルルシファーゼ値を同じウェルの生のレニラルシファーゼ値に正規化し、ホタル/レニラ比を得る。</li>
		<li>すべての複製制御井戸のホタル/レニラ比を平均し、その後、折り目の変化を得るために、その他のすべてのウェルのホタル/レニラ比を除算します。</li>
		<li>コントロールサンプルを割り当て、ホタル/レニラ比の値を1に設定します。</li>
		<li>重複する井戸のホタル/レニラ比を平均し、標準偏差でプロットします。 注: 標準偏差は統計分析には使用されず、複製が大きく異なるウェルを識別する手段として使用されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本研究では、転写因子の新規調節因子を同定し、試験するために使用できるデュアルルシファーゼベースの転写レポーターアッセイと組み合わせて、アレイドウイルスライブラリの中スループットスクリーニングのアプローチを実証する。どの画面の前にも、各セル行に対してレポーター システムを特徴付けて最適化することが重要です。調査対象の転写因子の活動の変化にレポーターが反応し、活動の変化の大きさを制御ベクターに対して比較してテストする必要があることを確認する実験を行う必要があります。レポーターコンストラクトと共にPRL-TKコンストラクトのコトランスフェクションは、レポーターにトランスフェクトされた細胞の数とレポーターコンストラクトのコピー数を制御するのに役立ち、どちらもルシファーゼ信号の大きさを変化させることができるため重要です。最適化実験では、結果の解釈が複雑になる可能性があるため、転写因子が構成的なレニラ構築物または最小限のプロモーター構築物の活性に影響を与えないことを確認する必要があります。ライブラリに含めるコントロールも慎重に検討する必要があります。このプロトコルは、shRNA の数百のライブラリの「ブラインド スクリーン」のため...

このアッセイの目的は、ウイルスライブラリーを使用して、比較的迅速かつ安価な方法で転写因子の調節因子を同定することにある。異常な転写活性は癌と,転移1、2、3、4、5、62,3に関連しているので、癌細胞における転写因子を標的化することは有望な治療アプローチである。1,4,56しかし、転写因子は、多くの場合、薬理学的に標的化することは困難である7、多くは、成体組織8、9、109,10の正常な細胞機能に必要とされる。8異常に転写因子を活性化して病気を引き起こす癌関連経路を標的にすることは、より重篤な副作用を有する可能性を有するより実現可能なアプローチである。配列レンチウイルスおよびレトロウイルスRNAi、CRISPR/CAS9、cDNA、またはORFライブラリの商業的利用により、研究者は単一の実験で多数の遺伝子の重要性をテストすることができます。しかし、転写活性の変化に対する信頼性の高い読み出しが必要です。
ここでは、がん細胞の転写因子を調節するタンパク質を同定するための、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイおよびアレイ化レンチウイルスライブラリーの使用について述べた。本アッセイでは、がん関連遺伝子を標的とするshRNAがレンチウイルス導入を介して哺乳動物癌細胞に送達され、細胞はプロマイシンを用いて安定な集積のために選択される。細胞は、次に、調査中の転写因子に特異的なプロモーターによって駆動されるホタルルシメラーゼを発現するレポーター構築物と、調査中の転写因子に反応しない構成的に活性なプロモーターからレニラルシメラーゼを発現する対照構造を発現させるレポーター構築物にトランスフェクトされる。我々は、YAPおよびTAZの調節因子,、カバ経路8、10、1110の重要な下流エフェクターのための概8念実証画面でこのアプローチを実証する。11YAPおよびTAZの異常な活性は、転移性カスケード11のいくつかのステップを促進し、多くの癌11、12、1312,13で観察される。11しかし、いくつかの癌細胞においてYAPおよびTAZがどのように異常に活性化されるのかはまだ完全には理解されていない。YAPとTAZはDNAを結合せず、代わりに他の転写因子によってプロモーターにリクルートされる。転写因子のTEAドメイン(TEAD)ファミリーのメンバーは、YAPおよびTAZの主要な結合パートナーであり、ほとんどのYAPおよびTAZ依存的な機能にとって重要である。我々のレポーター構築物は、YAP/TAZ-TEAD応答性プロモーターからのホタルルシメラーゼを発現しており、以前の研究では、YAP-TEADおよびTAZ-TEAD転写活性22、14、1514,15の変化を忠実に検出することを実証した。
当社のアプローチは、高速で中規模のスループットであり、スクリーニング施設、自動ロボット、またはプールされたライブラリの深いシーケンスを必要としません。コストは比較的低く、選択する多くの市販のライブラリがあります。必要な装置および試薬はほとんどの実験室で比較的標準的である。ルシファーゼベースのレポーターが存在するか、生成された場合、事実上任意の転写因子の調節因子をスクリーニングするために使用することができます。このアプローチを使用してがん細胞のshRNAをスクリーニングしますが、合理的な効率でトランスフェクトできる細胞株は、あらゆるタイプのアレイ化されたライブラリで使用できます。

<table><tbody><tr><td>2.0 ml 96 ウェル ディープ ウェル ポリプロピレン プレート</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td>細菌のミニプレップ用</td></tr><tr><td>トリプシン - 2.50%</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>トリプシン EDTA</td></tr><tr><td>96 ウェル平底の白いアッセイ プレート</td><td>の成分 コーニング</td><td>3922</td><td>デュアル ルシフェラーゼ アッセイ</td></tr><tr><td>アンピシリン - 100 mg/ml</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>45-10835242001-EA</td><td>細菌のミニプレップ用</td></tr><tr><td>バクトトリプトン - 粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td>LBブロス</td></tr><tr><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムの成分、LAR II試薬(試薬A)、ストップ&インタレスを含むGlo基質(試薬B基質)とStop &Glo緩衝液(試薬B緩衝液) - キット</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>デュアルルシフェラーゼアッセイ用</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水 カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし - 9.6 g/L</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>PBS</td></tr><tr><td>EDTA用 - 0.5 M</td><td>VWR</td><td>97061-406</td><td>トリプシン-EDTA</td></tr><tr><td>エタノールの成分 - 100%</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td>細菌のミニプレップ</td></tr><tr><td>胎児用ウシ血清 - 100%</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>完全増殖培地の成分</td></tr><tr><td>臭化ヘキサジメトリン(ポリブレン) - 8 mg/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-H9268</td><td>ウイルス感染用</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/高グルコース - 4 mM L-グルタミン; 4500 mg/L グルコース; ピルビン酸ナトリウム</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>SH30243.01</td><td>完全増殖培地</td></tr><tr><td>I3-P/i3 マルチモード マイクロプレート/EA</td> <td>の成分分子デバイス</td><td></td><td>デュアルルシフェラーゼアッセイ用</td></tr><tr><td>L-グルタミン - 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>完全増殖培地の成分</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 3000 (トランスフェクション試薬 2) - 100%</td><td>ライフテクノロジー</td><td>L3000008</td><td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>分子生物学 水 - 100%</td><td>VWR</td><td>02-0201-0500</td><td>ウイルス包装用shRNAベクターの希釈用</td></tr><tr><td>NaCl - 粉末</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td>LBブロスの成分</td></tr><tr><td>NanoDrop One 微量紫外可視分光光度計</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td>ベクターDNA濃度の測定用</td></tr><tr><td>Opti-MEM (トランスフェクションバッファー) - 100%</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン - 10,000 単位/ml (ペニシリン); 10,000 & マイクロ;g/ml (ストレプトマイシン)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>完全増殖培地の成分</td></tr><tr><td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>K210010</td><td>細菌ミニプレップ</td></tr><tr><td>用 ピューロマイシン - 2.5 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>感染後の抗生物質選択用</td></tr><tr><td>TC20 全自動セルカウンター</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>細胞計数用</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNAトランスフェクション試薬 (Transfection Reagent 1) - 100%</td><td>ロシュ</td><td>6365787001</td><td>ウイルス包装用</td></tr><tr><td>酵母抽出物 - 粉末</td><td>VWR</td><td>J850</td><td>LBブロス</td></tr><tr><td>P3000の成分 (トランスフェクション試薬3) - 100%</td><td>Life technologies</td><td>L3000008</td><td>トランスフェクション用</td></tr></tbody></table>

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

転写因子は、さまざまな下流プロセスに影響を与える多数の標的遺伝子の発現を変化させ、抗癌療法の良い標的となる可能性があります。しかし、転写因子を直接標的化することはしばしば困難であり、転写因子が1つ以上の成人組織で必要な場合には副作用を引き起こす可能性がある。がん細胞の転写因子を異常に活性化する上流の調節因子を特定することは、特にこれらのタンパク質が薬物に対して容易である場合、より実現可能な代替手段を提供する。ここでは、配列中規模レンチウイルスライブラリーと、がん細胞における転写因子の新しい調節因子を同定するための二重ルシファーゼベースの転写レポーターアッセイを組み合わせることができるプロトコルについて説明する。当社のアプローチは、1回の実験で何百もの遺伝子をテストするための迅速で簡単で安価な方法を提供します。このアプローチの使用を実証するために、カバ経路の下流のエフェクターである2つの転写共活性化剤であるYes-関連タンパク質(YAP)およびPDZ結合モチーフ(TAZ)と転写共活性化剤のいくつかの調節因子を含む配列レンチウイルスRNAiライブラリのスクリーンを行った。しかし、このアプローチは、実質的に任意の転写因子または共因子のレギュレータをスクリーニングするように変更することができ、CRISPR /CAS9、cDNA、またはORFライブラリをスクリーニングするためにも使用できます。

当社のYAP/TAZ-TEADレポーターコンストラクト(pGL3-5xMCAT(SV)-492,14,15)14,15には、ホタルルシファラーゼ遺伝子を駆動する正規TEAD結合元素(MCAT)15の5つの反復を伴う最小SV-49プロモーターが含まれています(215図1)。PRL-TK制御ベクター(プロメガ)と共に細胞に共入反応され、構成活性HSV TKプロモーターからレニラルシファーゼを発現する(図1)。YAP/TAZ-TEAD レポーターコンストラクトが、テスト対象のセルラインで期待どおりに動作していることを確認することが重要です。そこで、まず、コントロールベクター、YAP(YAP2SA)</...

転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

このプロトコルは、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスアッセイライブラリをスクリーニングして、癌細胞における転写因子の新しい調節因子を同定するために使用することができる。この技術の主な利点は、高速、中規模のスループット、および安価であり、ほとんどの研究者が一般的にアクセスできる機器や試薬を使用することです。ライブラリ内の各レンチウイルスベクターを拡大して精製するには、まず96ウェル深井戸プレートの各ウェルにアンピシリン1ミリリットル当たり100マイクログラムを添加したルリアスープ1.3ミリリットルを加えます。37°Cで一晩インキュベーションし、毎分225回転のためにグリセロールストックの2マイクロリットルで各井戸を接種します。翌日、各細菌培養物を個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離を行う。メーカーの指示に従って適切な細菌のminiprepキットで各ベクターを精製します。準備されたライブラリ内の各ベクターについて、24ウェルプレートの井戸を10〜5番目の293FT細胞で種付けし、摂氏37度で、24時間の二酸化炭素を5%でインキュベートします。ライブラリー内の各ベクターに対して設定されるトランスフェクション混合物を調製するために、まずレンチウイルスベクターをヌクレアーゼを含まない水でマイクロリットル当たり50ナノグラムの最終濃度に溶出する。各希釈液の5マイクロリットルを96ウェルPCRプレートの個々のウェルに移します。トランスフェクション・リザーク1の1.25マイクロリットルxを、23.75マイクロリットルx倍前に加温したトランスフェクションバッファーと混合してトランスフェクションスーパーミックスを作ります。トランスフェクションスーパーミックスを室温で5分間インキュベートします。その後、穏やかなピペットでスーパーミックスにpsPAX2の125ナノグラム倍xとVSVGの125ナノグラム倍xを追加します。すぐにPCRストリップの各チューブにスーパーミックスをアリコートし、希釈されたウイルスベクターの各ウェルに混合物の25マイクロリットルを転送するためにマルチチャネルピペットを使用しています。室温で20分間のインキュベーションの後、マルチチャネルピペットを使用して、各ウェルから各トランスフェクション混合物の30マイクロリットルを、以前に調製した24ウェルプレート内の293FT細胞の対応するウェルに移します。細胞培養インキュベーター内のさらに24時間インキュベーションのために、各ウェルの培地を500マイクロリットルの新鮮な完全な成長培地に置き換える前に、24時間培養します。翌日、マルチチャンネルピペットを使用して、各上澄みのウイルス上清とアリコート220マイクロリットルの各上澄み物を新しい96ウェルプレートの2つのウェルに集め、アレイ化されたウイルス上清プレートを生成します。A375細胞を感染に備えるために、24ウェルプレートに10回10~5番目の細胞を、ライブラリー内のウイルスベクターごとに完全増殖培地1個あたり0.5ミリリットルで播種する。薬物選択のコントロールとして機能するように感染しない余分な井戸を含める.細胞培養インキュベーターで24時間培養した後、調製した細胞培養プレートの各ウェルからの成長培地をポリブレンの1ミリリットル当たり20マイクログラムで補う200マイクロリットルの成長培地に置き換える前に、凍結アレイレンチウイルス上清を室温に設定して解凍する。マルチチャンネルピペットを使用して、各96ウェルから24ウェルプレートの各ウェルにウイルス上清の200マイクロリットルを転送します。細胞を24〜48時間培養インキュベーターに戻す。インキュベーションの終了時に、各ウェルの培地を、ピューロマイシンを添加した500マイクロリットルの増殖培地に交換し、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに48時間戻します。48時間のピューロマイシン選択に続いて、単一のグループのすべてのウェルが同様の細胞密度を有するように細胞を3つまたは4つのグループに分類し、37°Cで5分間の各グループから1つの代表井戸に200マイクロリットルのトリプシン-EDTAを加える。細胞が剥離したら、ピューロマイシンを添加した400マイクロリットルの成長培地でトリプシンを中和し、トリプシン化した各トリプシンから細胞の数を数える。各細胞懸濁液を、ピューロマイシンと種子500マイクロリットルの細胞を各ウェルから新しい24ウェルプレートの同じウェル位置に補充して、1ミリリットル当たり5番目の細胞に2倍に希釈します。各代表ウェルからのカウントを使用して各グループに残っている各ウェルの細胞数を推定した後、各ウェルにトリプシン-EDTAの適切な量を加え、ミリリットル濃度当たり6番目の細胞に10倍を達成する。トリプシンの間に、新しい24ウェルプレートの適切な対応する井戸にピューロマイシンを添加した成長培地の400マイクロリットルを加えるためにマルチチャネルピペットを使用する。細胞が剥離したら、各ウェルの内容物を穏やかに混合し、各細胞懸濁液の100マイクロリットルを新しい24ウェルプレートの適切な対応ウェルに移します。その後、細胞を細胞培養インキュベーターに24時間戻す。デュアルルシファーゼレポーターコンストラクトで細胞をトランスフェクトするには、表に示すようにトランスフェクション希釈混合物を調製します。レポーター希釈混合物を調製するには、トランスフェクションの合計数といくつかの余分なボリュームを掛けた各試薬の量を混合します。次に、トランスフェクション希釈混合物をレポーター希釈混合物と混合し、得られた溶液を室温で15分間インキュベートし、トランスフェクション混合物を製造する。インキュベーション中に、250マイクロリットルのPBSで細胞培養プレートの各ウェルをすすい、各ウェルに447マイクロリットルの新鮮な完全な成長培地を加えます。次いで、マルチチャネルピペットを使用して、53マイクロリットルのトランスフェクションミックスを細胞培養プレートの各ウェルに分配する。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%を24時間置きます。ルシファーゼ活性を測定するために、ルシファーゼ活性キットから5X受動溶解バッファーを脱イオン水で1~5回希釈し、キットから必要な量の試薬Aおよび試薬Bバッファーを解凍します。試薬の準備ができたら、各ウェルの上澄み液を受動リシスバッファーの75マイクロリットルに交換し、時折揺れで室温で30分間プレートをインキュベートします。インキュベーション中に、キットから50X試薬B基板を解凍した試薬Bバッファーで1~50濃度に希釈します。インキュベーションの最後に、4つのブランクコントロールウェルに30マイクロリットルの受動的なライシスバッファーを加え、各ウェルから30マイクロリットルのライセートを96ウェルフラットボトムホワイトアッセイプレートの重複ウェルに移します。すべてのライセートがメッキされたら、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに50マイクロリットルの試薬Aを加え、プレートリーダーでホタルルシファーゼ信号を読み取ります。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50マイクロリットルの試薬Bを加え、プレートリーダーでレニラルシファーゼ信号を読み取ります。予想通り、YAP2SAは、コントロールベクターと比較して、ホタルルシファーゼ活性を増加させるが、レニラルシファーゼ活性を増加させる。これに対し、YAP2SA S94Aはホタルルシファーゼ活性を増加しません。重要なことに、YAP2SAはMCAT TEAD結合要素を欠く最小限のプロモーター構築物の活性を変化させるものではない。YAP-TAZ-TEADレポーターコンストラクトにトランスフェクトされた細胞では、タンデムYAPおよびTAZショートヘアピンはホタルルシファーゼラーゼレベルを有意に低下させたが、コントロールショートヘアピン非ターゲティングコントロールはそうではない。対照的に、最小レポーターコンストラクトにトランスフェクトされた細胞において、YAP-TAZショートヘアピンRNAはホタルルシファーゼのレベルを有意に変化させるわけではない。各ウェルのレニラシグナルは、短いヘアピン非ターゲティングコントロールまたはYAP-TAZショートヘアピンRNAによっても有意に変化しない。予想通り、YAPおよびTAZ、SARCまたはPI3キナーゼを標的とする短いヘアピンRNAは、YAP-TAZ-TEAD活性を有意に低下させる。ATM、CDH1、CSK、ERBB2、およびゲルソリンを標的とする短いヘアピンRNAは、それぞれ正規化ホタルルシメラーゼレベルを増加させ、これらのタンパク質がYAPおよび/またはTAZであることを示す公表された研究と一致した。ATR、CCNE2、ERBB4の役割は他の細胞タイプでも確立されているにもかかわらず、これらの遺伝子を標的とする短いヘアピンRNAは、A375細胞における正規化ホタルルシフラーゼレベルを有意に変化させない。この画面に続いて、レギュレータの識別は、転写因子活性のための他の読み出しを使用して検証する必要があります。アッセイによって同定されたレギュレータの有効なノックダウンも確認されるべきである。感染性レンチウイルスを扱う際には注意して安全ガイドラインに従うことを忘れないでください, ウイルスが人間の感染性である場合は特に.

identification-transcription-factor-regulators-using-medium

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たすことが示されている。より良いmiRNAの- UTRの相互作用を理解するために、我々は新たなルシフェラーゼ遺伝子およびアッセイ試薬、LightSwitchのシステムと対になって3...

3&#39;UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック

我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。...

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

このプロトコルは、同族のGFPレポーターおよびフローサイトメトリーを経由してGFPの発現を刺激するATFS能力を定量化した人工転写因子（ATFS）を迅速に構築するための実験的な手順を説明します。...

迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

ここでは、低酸素にHIF1A媒介細胞応答の新規ユビキチンおよびユビキチン様レギュレータを識別するための画面」ubiquitome」を標的としたsiRNAを実行するための方法論を説明します。これはレポーター活性のうち、堅牢な読み取りが可能な任意の生物学的経路に適合させることができる。...

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

ここでは、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを、3'...

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

ここでは、関心のある転写因子を標的とする小さなヘアピン(sh)RNAで細胞をトランスフェクションした後、公開されているデータ、計算リソース、およびマイクロRNAアレイからのハイスループットデータを使用して、目的の転写因子がマイクロRNAトランスクリプトームに及ぼす影響を研究する戦略を提案します。...

マイクロRNAトランスクリプトームの転写因子依存性調節を記述する

強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーニング興味の人間 DNA 領域にバインドできる転写因子 (TFs) を識別するためにプロトコルを紹介します。このメソッドのバインディングを問い合わせたりすることができます高速スクリーニング パイプラインを使用して &gt; 単一の実験で 1,000...

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

当初、スライド上に固定されていた乳腺組織を、全体のマウントとして、組織病理学的評価のために首尾よく除去、加工、切片化および染色する方法を開発した。この方法は、生殖および発育試験ガイドライン研究における乳腺全体マウントの採取および評価を促進し得る。...

病変同定のための乳腺全体マウントの分割

神経膠芽腫幹細胞 (GSCs) のグリア分化を促進する小さい分子の同定の効率的なスクリーニングのプロトコルが表示されます。アッセイは、人間の GFAP プロモーターによって強化された GFP (eGFP)...

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

学ぶアレイ化RNAiライブラリスクリーニングとデュアルルシファーゼアッセイを用いた転写因子レギュレーター同定法。がん細胞における遺伝子発現制御メカニズム解明に有用で、中スループットかつ低コストな手法です。

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

さらに動画を探す