アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定
2020年3月27日
転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。
このプロトコルは、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスアッセイライブラリをスクリーニングして、癌細胞における転写因子の新しい調節因子を同定するために使用することができる。この技術の主な利点は、高速、中規模のスループット、および安価であり、ほとんどの研究者が一般的にアクセスできる機器や試薬を使用することです。ライブラリ内の各レンチウイルスベクターを拡大して精製するには、まず96ウェル深井戸プレートの各ウェルにアンピシリン1ミリリットル当たり100マイクログラムを添加したルリアスープ1.3ミリリットルを加えます。
37°Cで一晩インキュベーションし、毎分225回転のためにグリセロールストックの2マイクロリットルで各井戸を接種します。翌日、各細菌培養物を個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離を行う。メーカーの指示に従って適切な細菌のminiprepキットで各ベクターを精製します。
準備されたライブラリ内の各ベクターについて、24ウェルプレートの井戸を10〜5番目の293FT細胞で種付けし、摂氏37度で、24時間の二酸化炭素を5%でインキュベートします。ライブラリー内の各ベクターに対して設定されるトランスフェクション混合物を調製するために、まずレンチウイルスベクターをヌクレアーゼを含まない水でマイクロリットル当たり50ナノグラムの最終濃度に溶出する。各希釈液の5マイクロリットルを96ウェルPCRプレートの個々のウェルに移します。
トランスフェクション・リザーク1の1.25マイクロリットルxを、23.75マイクロリットルx倍前に加温したトランスフェクションバッファーと混合してトランスフェクションスーパーミックスを作ります。トランスフェクションスーパーミックスを室温で5分間インキュベートします。その後、穏やかなピペットでスーパーミックスにpsPAX2の125ナノグラム倍xとVSVGの125ナノグラム倍xを追加します。
すぐにPCRストリップの各チューブにスーパーミックスをアリコートし、希釈されたウイルスベクターの各ウェルに混合物の25マイクロリットルを転送するためにマルチチャネルピペットを使用しています。室温で20分間のインキュベーションの後、マルチチャネルピペットを使用して、各ウェルから各トランスフェクション混合物の30マイクロリットルを、以前に調製した24ウェルプレート内の293FT細胞の対応するウェルに移します。細胞培養インキュベーター内のさらに24時間インキュベーションのために、各ウェルの培地を500マイクロリットルの新鮮な完全な成長培地に置き換える前に、24時間培養します。
翌日、マルチチャンネルピペットを使用して、各上澄みのウイルス上清とアリコート220マイクロリットルの各上澄み物を新しい96ウェルプレートの2つのウェルに集め、アレイ化されたウイルス上清プレートを生成します。A375細胞を感染に備えるために、24ウェルプレートに10回10~5番目の細胞を、ライブラリー内のウイルスベクターごとに完全増殖培地1個あたり0.5ミリリットルで播種する。薬物選択のコントロールとして機能するように感染しない余分な井戸を含める.
細胞培養インキュベーターで24時間培養した後、調製した細胞培養プレートの各ウェルからの成長培地をポリブレンの1ミリリットル当たり20マイクログラムで補う200マイクロリットルの成長培地に置き換える前に、凍結アレイレンチウイルス上清を室温に設定して解凍する。マルチチャンネルピペットを使用して、各96ウェルから24ウェルプレートの各ウェルにウイルス上清の200マイクロリットルを転送します。細胞を24〜48時間培養インキュベーターに戻す。
インキュベーションの終了時に、各ウェルの培地を、ピューロマイシンを添加した500マイクロリットルの増殖培地に交換し、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに48時間戻します。48時間のピューロマイシン選択に続いて、単一のグループのすべてのウェルが同様の細胞密度を有するように細胞を3つまたは4つのグループに分類し、37°Cで5分間の各グループから1つの代表井戸に200マイクロリットルのトリプシン-EDTAを加える。細胞が剥離したら、ピューロマイシンを添加した400マイクロリットルの成長培地でトリプシンを中和し、トリプシン化した各トリプシンから細胞の数を数える。
各細胞懸濁液を、ピューロマイシンと種子500マイクロリットルの細胞を各ウェルから新しい24ウェルプレートの同じウェル位置に補充して、1ミリリットル当たり5番目の細胞に2倍に希釈します。各代表ウェルからのカウントを使用して各グループに残っている各ウェルの細胞数を推定した後、各ウェルにトリプシン-EDTAの適切な量を加え、ミリリットル濃度当たり6番目の細胞に10倍を達成する。トリプシンの間に、新しい24ウェルプレートの適切な対応する井戸にピューロマイシンを添加した成長培地の400マイクロリットルを加えるためにマルチチャネルピペットを使用する。
細胞が剥離したら、各ウェルの内容物を穏やかに混合し、各細胞懸濁液の100マイクロリットルを新しい24ウェルプレートの適切な対応ウェルに移します。その後、細胞を細胞培養インキュベーターに24時間戻す。デュアルルシファーゼレポーターコンストラクトで細胞をトランスフェクトするには、表に示すようにトランスフェクション希釈混合物を調製します。
レポーター希釈混合物を調製するには、トランスフェクションの合計数といくつかの余分なボリュームを掛けた各試薬の量を混合します。次に、トランスフェクション希釈混合物をレポーター希釈混合物と混合し、得られた溶液を室温で15分間インキュベートし、トランスフェクション混合物を製造する。インキュベーション中に、250マイクロリットルのPBSで細胞培養プレートの各ウェルをすすい、各ウェルに447マイクロリットルの新鮮な完全な成長培地を加えます。
次いで、マルチチャネルピペットを使用して、53マイクロリットルのトランスフェクションミックスを細胞培養プレートの各ウェルに分配する。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%を24時間置きます。ルシファーゼ活性を測定するために、ルシファーゼ活性キットから5X受動溶解バッファーを脱イオン水で1~5回希釈し、キットから必要な量の試薬Aおよび試薬Bバッファーを解凍します。
試薬の準備ができたら、各ウェルの上澄み液を受動リシスバッファーの75マイクロリットルに交換し、時折揺れで室温で30分間プレートをインキュベートします。インキュベーション中に、キットから50X試薬B基板を解凍した試薬Bバッファーで1~50濃度に希釈します。インキュベーションの最後に、4つのブランクコントロールウェルに30マイクロリットルの受動的なライシスバッファーを加え、各ウェルから30マイクロリットルのライセートを96ウェルフラットボトムホワイトアッセイプレートの重複ウェルに移します。
すべてのライセートがメッキされたら、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに50マイクロリットルの試薬Aを加え、プレートリーダーでホタルルシファーゼ信号を読み取ります。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50マイクロリットルの試薬Bを加え、プレートリーダーでレニラルシファーゼ信号を読み取ります。予想通り、YAP2SAは、コントロールベクターと比較して、ホタルルシファーゼ活性を増加させるが、レニラルシファーゼ活性を増加させる。
これに対し、YAP2SA S94Aはホタルルシファーゼ活性を増加しません。重要なことに、YAP2SAはMCAT TEAD結合要素を欠く最小限のプロモーター構築物の活性を変化させるものではない。YAP-TAZ-TEADレポーターコンストラクトにトランスフェクトされた細胞では、タンデムYAPおよびTAZショートヘアピンはホタルルシファーゼラーゼレベルを有意に低下させたが、コントロールショートヘアピン非ターゲティングコントロールはそうではない。
対照的に、最小レポーターコンストラクトにトランスフェクトされた細胞において、YAP-TAZショートヘアピンRNAはホタルルシファーゼのレベルを有意に変化させるわけではない。各ウェルのレニラシグナルは、短いヘアピン非ターゲティングコントロールまたはYAP-TAZショートヘアピンRNAによっても有意に変化しない。予想通り、YAPおよびTAZ、SARCまたはPI3キナーゼを標的とする短いヘアピンRNAは、YAP-TAZ-TEAD活性を有意に低下させる。
ATM、CDH1、CSK、ERBB2、およびゲルソリンを標的とする短いヘアピンRNAは、それぞれ正規化ホタルルシメラーゼレベルを増加させ、これらのタンパク質がYAPおよび/またはTAZであることを示す公表された研究と一致した。ATR、CCNE2、ERBB4の役割は他の細胞タイプでも確立されているにもかかわらず、これらの遺伝子を標的とする短いヘアピンRNAは、A375細胞における正規化ホタルルシフラーゼレベルを有意に変化させない。この画面に続いて、レギュレータの識別は、転写因子活性のための他の読み出しを使用して検証する必要があります。
アッセイによって同定されたレギュレータの有効なノックダウンも確認されるべきである。感染性レンチウイルスを扱う際には注意して安全ガイドラインに従うことを忘れないでください, ウイルスが人間の感染性である場合は特に.
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概要
このプロトコルは、がん細胞における転写因子の新規調節因子をスクリーニングするための、配列化されたレンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリの方法を説明しています。これは、一般的に入手可能な機器や試薬を利用した、迅速で中規模スループット、そしてコスト効率の高い技術です。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 転写制御
背景
- 転写因子は遺伝子発現において重要な役割を果たします。
- その調節因子を特定することで、がん生物学への洞察が得られます。
- RNA干渉（RNAi）は遺伝子サイレンシングの強力なツールです。
- 大規模なライブラリのスクリーニングは新規調節因子の発見を加速させます。
研究目的
- 転写因子調節因子を同定するためのスクリーニング方法を開発すること。
- 二重ルシフェラーゼベースの転写レポーターアッセイを利用すること。
- 研究者向けのコスト効率の良いソリューションを提供すること。
使用された方法
- レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリの調製。
- スクリーニングのための二重ルシフェラーゼレポーターアッセイの使用。
- ベクター精製のための細菌培養の接種。
- ベクター抽出のための細菌ミニプレップキットの適用。
主要な結果
- 転写因子の新規調節因子の成功的な同定。
- この方法の効率性とコスト効率性の実証。
- スクリーニング目的のための二重ルシフェラーゼアッセイの検証。
- ほとんどの研究者にとってのこの技術のアクセシビリティ。
結論
- 開発された方法は、転写因子研究の価値あるツールです。
- これは複数の候補の迅速なスクリーニングを可能にします。
- このアプローチは、がん生物学におけるさらなる研究を促進する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Identifying upstream regulators of transcription factors offers a more druggable alternative to direct targeting in oncology, reducing the risk of adverse effects in normal tissues. This medium-throughput screening approach enables rapid interrogation of hundreds of genes to de-risk target hypotheses and prioritize candidates with predictive confidence. The method supports early discovery workflows by providing quantitative, reproducible outputs that inform go/no-go decisions in target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory networks to clarify pathway dependencies and validate functional targets in cancer models.
- Operational Value: Uses arrayed lentiviral libraries and dual-luciferase reporters to generate quantitative, normalized readouts for hit identification.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing direct regulators from indirect effects through orthogonal reporter constructs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces arrayed viral supernatants compatible with standardized infection workflows in 24-well formats.
- Quantitative Output: Dual-luciferase readout provides internal normalization via Renilla control to minimize well-to-well variability.
- Scalability: Medium-throughput design accommodates hundreds of genes per experiment using standard liquid handling and plate readers.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated in melanoma (A375) cells to identify regulators of YAP/TAZ, key effectors in Hippo pathway-driven tumorigenesis.
- Translational Continuity: Hits can be validated using orthogonal assays for transcription factor activity, supporting progression to preclinical models.
- Mechanistic Insight: Enables discrimination between transcriptional co-activator dependence and minimal promoter artifacts via TEAD-binding element reliance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis screening to lead identification, providing assay-ready biological systems and quantitative data for downstream chemistry and validation efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking genetic perturbations to transcriptional output via luciferase reporters.
- Screening: Generates reproducible, normalized luciferase signals enabling comparison across library members.
- Analytics: Delivers firefly/Renilla ratios that quantify pathway-specific activity, facilitating hit selection and prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through confirmation of regulator knockdown and transcriptional impact.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to CRISPR, cDNA, or ORF libraries for sustained use across multiple transcription factor programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in transcriptional regulation by identifying upstream modulators with functional validation.
- Operational Value: Employs accessible reagents (bacterial miniprep kits, standard transfection reagents) and common instrumentation (plate readers, multichannel pipettes).
- Strategic Value: Improves target selection confidence, reducing late-stage failure risk from inadequate biological de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of transcription factor-modulating strategies over direct targeting approaches.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise for library preparation and viral vector handling.
- Dependent on lentiviral production infrastructure and biosafety containment for infectious material.
- Necessitates standardization of transfection efficiency and puromycin selection across arrayed conditions.
- Adaptable to various cancer cell lines provided they support lentiviral transduction and reporter expression.
- Limited to transcriptional readouts; functional phenotypes require secondary validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Lentiviral Vector Library Preparation
1:24
Packaging of the Arrayed Lentiviral Library
3:35
Cell Infection for Screening
4:48
Cell Seeding for Transfection of Dual-Luciferase Reporter
6:27
Dual-Luciferase Reporter Transfection
7:35
Dual-Luciferase Activity Quantification
9:02
Results: Representative Arrayed Library Screening
10:47
Conclusion
