細胞生物発光ベースのアッセイ:コンビナトリアル薬物スクリーニングのためのハイスループット法

細胞生物発光は、抗がん剤の大規模なスクリーニングのための高感度かつ迅速なアプローチです。

この技術では、光を生成する化学反応を触媒し、宿主細胞を暗闇で光らせる酵素であるルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞を使用します。放出される発光の強度は、生細胞密度に正比例します。

まず、ルシフェラーゼ発現細胞を細胞外マトリックスまたはECMでコーティングした光学的に透明な培養プレートに播種し、インキュベートします。

インキュベーション中、ECMは培養物への細胞の付着を促進します。

次に、薬物の組み合わせの濃縮ストックを取り、異なる容量の培地を加えて、薬物混合物の連続希釈を調製します。

次に、接着した細胞から培地を取り除きます。薬物の組み合わせの異なる希釈液を加えてインキュベートします。

インキュベーション中、薬物の組み合わせは細胞標的に相乗的に作用します。

次に、薬物含有培地を取り除き、ルシフェリンを含む新鮮な培地を加えます。

ルシフェリンは膜を越えて拡散し、細胞に入ります。細胞によって発現されるルシフェラーゼは、細胞ATPを使用してルシフェリンを酸化し、光信号を放出します。

イメージングシステム下での細胞生物発光の定量

薬物濃度の増加に伴う発光の減少は、細胞生存率の低下を示します。これは、標的細胞に対する薬物の抗増殖効果と相関しています。

96ウェル光学底板をマトリゲルなどの細胞外マトリックス混合物でコーティングし、摂氏37度で1時間インキュベートします。余分な混合物を取り除き、PBSでプレートを一度優しくすすいでください。

次に、XG387-Luc細胞を100マイクロリットルの培地に1,000細胞の密度でコーティングされたプレートの各ウェルに播種し、一晩培養します。翌日、細胞を顕微鏡で観察し、プレートへの付着を確認します。

次に、200マイクロモルのテモゾロミド溶液と標的薬剤の2マイクロモル溶液を培地中で調製します。併用薬スクリーニングでは、ブランク培地を取り除き、200マイクロモルのテモゾロミドまたは2マイクロモルの標的薬剤、またはその両方の組み合わせを含む培地を各ウェルに添加し、処理ごとに3回の技術的複製を行います。

プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で3日間インキュベートします。IVISスペクトルイメージングシステムを使用して、プレート内の細胞生物発光の画像を撮影します。内蔵ソフトウェアを使用して、関心領域の複数の円形領域を作成し、細胞生物発光を定量化します。