二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

この手順の全体的な目標は、ACAP LBC と PDE 4、D 3 との相互作用のサイトをマッピングすることです。フローサイトメトリーを使用して、生体分子、蛍光、相補、またはBCの平均蛍光強度を測定することにより。これを行うために、細胞にACAP LBCおよびPDE 4 D 3フラグメントをトランスフェクションし、蛍光レポータータンパク質のNまたはC末端部分に融合させます。

次に、Venus Flow サイトメトリーを実行して、タンパク質断片が相互作用し、Venus が完成すると蛍光が発せられるかどうかの蛍光を評価します。タンパク質断片が相互作用しない場合、蛍光は検出されません。補完的なウェスタン血液分析を実施して、相対的なタンパク質発現レベルを決定します。

次に、タンパク質タンパク質相互作用の強度は、YFP平均蛍光強度をタンパク質発現レベルで正規化することによって計算されます。得られたデータは、PDE 43のACAP LBCへの結合が、PDE 43内の複数の領域、主に上流の保存領域1またはUCR領域を介して媒介されることを示している。この技術の主な利点は、顕微鏡を使用した共免疫沈降法やBP Cなどの既存の方法と比較すること、または比較的単純で、感度が高く、多数の細胞の迅速なスクリーニングを容易にすることです。

この手法は、タンパク質間相互作用に関する洞察を提供するだけでなく、創薬のためにタンパク質間相互作用を調節する因子のスクリーニングにも使用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、線形B応答を決定する必要があるため、苦労します。コンストラクトの発現は、異なるタンパク質断片を使用した結果を互いに比較できるように、類似している必要があります。

ここで述べる実験では、YFP誘導体のN末端フラグメントを細胞にコットトランスフェクションし、Venusを完全長ACAP LBCに融合させ、VenusのC末端フラグメントを以下のいずれかに融合させ、完全長PDE E43、上流保存領域1 UCR1、PDE E43のいずれかまたは上流保存領域2プラス触媒領域UCR R2プラスCATをトランスフェクション前日にトランスフェクションする6。さて、組織培養プレートは、1ウェルあたり1.2倍10〜5番目のHEC2 9 3T細胞を2ミリリットルで完全に増殖させます。ミディアムシード、3つのコントロールウェルと各テストの3つのウェル。

Cotranは、摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。翌日、BC 血漿 DNA コンストラクトと BS C コンストラクトをマーカーとしてトランスフェクションした CFP ベクターのトランスフェクションを準備します。各条件について、250マイクロリットルのOptum M1無血清培地に適切な量のDNAを追加します。

滅菌チューブでは、1本のチューブで3つのウェルをトランスフェクションするのに十分です。次に、希釈したDNA混合物に3マイクロリットルのトランジットLT1マイクログラムごとに1試薬を加え、ピペットで静かに混合し、室温で30分間インキュベートします。250マイクロリットルのトランスフェクション混合物でインキュベートした後、細胞に滴下し、次いで5%二酸化炭素で37°Cで24時間インキュベートする。

トランスフェクションチェック後、エピ蛍光顕微鏡で蛍光を発現すると、細胞はBCシグナルに対して黄色蛍光を発現し、トランスフェクション効率を報告するためにCFP蛍光を発現する必要があります。フローサイトメトリー分析のために細胞を準備するには、まず2ミリリットルの氷冷PBSで細胞を洗浄し、次に0.05%トリプシンの250マイクロリットルを追加して細胞を剥離し、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。次に、顕微鏡を使用して細胞の剥離を確認します。

細胞が分離したら、1ミリリットルのDMEMでトリプシンを中和します。次に、1ミリリットルの細胞を1本のマイクロ遠心チューブに移し、次に0.25ミリリットルの細胞を2本目のマイクロ遠心チューブに移します。チューブを500個のチーズで5分間回転させます。

250マイクロリットルのサンプルは、フローサイトメトリー用にさらに処理されます。1ミリリットルのサンプルを氷上に置き、ウェスタン血液分析を行い、Resusのスピン後に並行して行う必要があります。ファックス緩衝液の250マイクロリットルで細胞を懸濁し、氷上に置く細胞もPBSの1%パラホルムアルデヒドに固定することができますフローサイトメトリー分析がここですぐに行われない場合、フローサイトメトリーは、ベックマン・コールターのシアンを使用して実行されます488ナノメートル、405ナノメートルおよび642ナノメートルの固体レーザーサミットソフトウェアを装備したDPは、標準ビーズを使用してフローサイトメーターを較正した後、取得と分析に使用されます。 前方散乱光またはFSCと横方向散乱SSCを線形スケールでプロットし、生細胞集団の歩行を行います。

次に、SSC と、非凝集生細胞集団の電圧パルス幅と歩行をプロットします。次に、この装置で 405 FL 6 での CFP 蛍光に対する線形スケールの FSC をプロットし、凝集していない生 CFP 陽性細胞の歩幅を対数スケールでプロットします。最後に、この装置で488ナノメートルFLの1つのYFP蛍光に対して線形スケールのFSCをプロットし、BC強度を視覚化します。

次に、Y-F-P-C-F-Pダブルネガティブサンプルを実行し、F-S-C-S-S-C FL oneおよびFL six光増倍管またはPMT電圧を調整して、各信号のしきい値を設定します。次に、将来のオフライン補償のために、YFPとCFPの両方の単一陽性サンプルを実行します。少なくとも10, 000のゲートイベントを取得するようにしてください。

最後に、データ収集に続いて実験サンプルのデータを収集します。生細胞のFS CSCドットプロットでゲート1を使用して伝播し、取得に従って解析プロトコルを設定します。FSC パルスのゲート 2 と、非凝集生細胞のゲート 1 と ccfp のゲート 3 のドットプロット FSC 非凝集 ccfp 陽性生細胞のゲート 2 のドットプロット。

YFPおよびCFP単一正セルを使用してY fp CFPドットプロットでYFPおよびCCFPシグナルを補償した後、CFPおよびYFP正セルのカットオフラインを決定します。CFP陽性細胞のYFP平均蛍光強度またはMFIをエクスポートしてデータプロットを行い、ExcelでY-F-P-M-F-IをACAP LBC PDE E 43の発現レベルに正規化し、ウェスタンブロッティングで決定されたαチューブリンの負荷制御を行い、YFP平均蛍光強度の線形範囲を決定します。CFPをVN ACAP L BBCとCHIC 2 93細胞のVC PDE E 43の異なる量で交換し、相互作用をbifフローサイトメトリーを使用して評価しましたこのビデオで説明されているように、このプロットはVC PDE E 43トランスフェクトの関数としてVC PDE E 43の発現の相対的な倍率変化を示しています。

青い四角で示されたCFP陽性細胞におけるVenusの平均蛍光強度は、VCDE 43の発現と相関しており、赤い三角形で示されているウェスタンブロットの画像解析によって決定された発現レベルと一致していました。緑色の四角で示されているように、サンプル間で同様のCFP平均蛍光強度が見られ、細胞の変動を制限するためのネガティブコントロールとして使用されました。これらの結果は、BS e の平均蛍光強度を測定すると同時に、PDE E 43 内の ACAP LBC 結合部位をマッピングするためのスクリーニングに使用される BIC コンストラクトの適切な量を決定することにより、ACAB LB C PDE 43 相互作用を定量するためのフローサイトメトリーの使用を検証します。

PDE 43のUCR 1領域とPDE 43のUCR 2およびCAT領域は、ここで見られるように、この方法を使用して評価されました。vn、ACAP、LBC、およびVC PDE 43 UCRの発現は、VC、PDE、43、FL、およびVC PDE 43 UCRと比較した場合、BCシグナルが低く、すべてのフローサンプルで同様のタンパク質発現が観察され、平均蛍光はACAP、LBC、PDE 43、およびαチューブリンの相対発現レベルに正規化されました。したがって、正規化されたB-C-M-F-Iは、ACAP LBC PDE 43 FLとACAP LBC PDE 43 UCR R 1との間に蛍光強度に差はないが、ACAP LBC PDE 43 UCR 2とCAT相互作用のシグナルははるかに低いことを示しています。

これらの結果は、PDE 43 には ACAP LBC と相互作用する複数の領域があり、PDE 43 UCR R 1 が ACAP LBC と相互作用する主要な領域であることを示唆しています。このビデオを見た後、BP C.Whileのフローサイトメトリー分析によるタンパク質、タンパク質相互作用の研究方法についてよく理解しているはずですこの手順を試みながら、同様のタンパク質発現と線形BP C応答を得るために使用されるBP Cコンストラクトの正しい量を決定することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ペプチドやリスクなどの他の方法を実行して、PDE 40 D 3内のどのアミノ酸が関与しているかを決定することができます。

そのACAP RBC相互作用。