二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

本手順の全体的な目的は、ACAP LBCとPDE4D3の相互作用部位をマッピングすることです。これは、フローサイトメトリーを用いて、生物分子蛍光相補法（Biomolecular Fluorescence Complementation; BiFC）による平均蛍光強度を測定することで行われます。具体的には、蛍光レポータータンパク質のN末端またはC末端部分に融合させたACAP LBCおよびPDE4D3フラグメントを細胞にトランスフェクションします。

その後、タンパク質断片が相互作用するかを評価するために、Venusのフローサイトメトリーを行い、蛍光を測定します。タンパク質断片が相互作用しない場合は、蛍光は検出されません。また、相対的なタンパク質発現レベルを決定するために、補完的なウェスタンブロット分析が行われます。

その後、YFPの平均蛍光強度をタンパク質発現レベルで正規化することにより、タンパク質間相互作用の強さを算出します。得られたデータは、PDE 43のACAP LBCへの結合が、主に上流保存領域1（UCR1）を中心としたPDE 43内の複数の領域によって媒介されていることを示しています。共免疫沈降や顕微鏡を用いたBPCなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、比較的簡便で感度が高く、大量の細胞を迅速にスクリーニングできることです。

この手法はタンパク質間相互作用に関する知見を提供できるだけでなく、創薬に向けたタンパク質間相互作用の調節因子のスクリーニングにも利用可能です。一般的に、この手法を初めて行う人は、線形なB応答を決定する必要があるため、困難に直面することがあります。異なるタンパク質断片を用いた結果を相互に比較できるように、コンストラクトの発現量は同等である必要があります。

ここでの実験では、YFP誘導体であるVenusのN末端断片に全長のACAP-LBCを融合させたものと、VenusのC末端断片に以下のいずれかを融合させたものを細胞に共 transfection します：全長のPDE43、PDE43の上流保存領域1（UCR1）、またはPDE43の上流保存領域2と触媒領域（UCR2+CAT）。transfection の前日に、6ウェル組織培養プレートの1ウェルあたり 1.2×10⁵ 個のHEK293T細胞を 2 mL の完全増殖培地で播種します。コントロール用の3ウェルと、各試験群につき3ウェルを播種してください。

37 °C、5% 二酸化炭素条件下で一晩共培養します。翌日、BCプラズマDNA構築物および、BS C構築物と共に共導入されるマーカーとしてのCFPベクターの導入準備を行います。各条件について、適切な量のDNAを250 µLのOptum M1無血清培地に添加します。

滅菌チューブを用意します（1本のチューブで3ウェル分をトランスフェクション可能です）。希釈したDNA混合液1 µgあたり3 µLのTransIT-LT1試薬を加え、ピペットで穏やかに混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、250 µLのトランスフェクション混合液を細胞に滴下し、37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートします。

トランスフェクション後、落射蛍光顕微鏡下で蛍光を確認します。細胞は、BCシグナルとして黄色蛍光を、トランスフェクション効率の指標としてCFP蛍光を発しているはずです。フローサイトメトリー分析に向けて細胞を準備するには、まず2 mLの氷冷PBSで洗浄し、次に250 µLの0.05% Trypsinを加えて細胞を剥離させ、37 °Cで2～5分間インキュベートします。その後、顕微鏡を用いて細胞が剥離しているかを確認してください。

細胞が剥離したら、1 mLのDMEMでトリプシンを中和します。次に、細胞懸濁液1 mLを1つのマイクロ遠心チューブに、0.25 mLを別のマイクロ遠心チューブに移します。これらのチューブを500 ×gで5分間遠心分離します。

250 µLのサンプルは、フローサイトメトリー用にさらに処理します。1 mLのサンプルは、遠心後の再懸濁に続き、並行して実施すべきウェスタンブロット解析用に氷上に置いておきます。細胞を250 µLの FACSバッファーに懸濁し、氷上に置きます。フローサイトメトリー解析を即座に行わない場合は、PBS中の1%パラホルムアルデヒドで細胞を固定することも可能です。ここでは、488 nm、405 nm、および642 nmの固体レーザーを備えたBeckman Coulter CytoFLEX DPを用いてフローサイトメトリーを実施します。標準ビーズを用いてフローサイトメーターを校正した後、データの取得と解析にはSummitソフトウェアを使用します。前方散乱光（FSC）を線形スケールで側方散乱光（SSC）に対してプロットし、生存細胞集団をゲートします。

次に、凝集していない生細胞集団において、SSCを電圧パルス幅に対してプロットし、ゲートを設定します。続いて、この装置の405 FL 6におけるCFP蛍光を対数スケールで、FSCを線形スケールでプロットし、凝集していないCFP陽性生細胞にゲートを設定します。最後に、BC強度を視覚化するため、この装置の488 nm FL 1におけるYFP蛍光を対数スケールで、FSCを線形スケールでプロットします。

次に、Y-F-P-C-F-Pダブルネガティブサンプルを流し、F-S-C-S-S-CのFL1およびFL6光電子増倍管（PMT）電圧を調整して、各信号のしきい値を設定します。続いて、後のオフライン補正のため、YFPおよびCFPのシングルポジティブサンプルの両方を流します。この際、ゲート内イベント数を少なくとも10,000イベント以上取得するようにしてください。

最後に、データ収集に従って実験サンプルのデータを収集します。解析プロトコルを、生存細胞を抽出するためにFS CSCドットプロットでゲート1を設定し、非凝集生存細胞を抽出するためにゲート1のFSCパルスドットプロットでゲート2を設定し、非凝集ccfp陽性生存細胞を抽出するためにゲート2のccfp FSCドットプロットでゲート3を設定するように、取得条件に合わせて構築します。

YFPおよびCFP単独陽性細胞を用いてYFP-CFPドットプロットにおけるYFPおよびCFPの信号を補正した後、CFP陽性細胞およびYFP陽性細胞のカットオフラインを決定します。CFP陽性細胞のYFP平均蛍光強度（MFI）をデータプロット用にExcelにエクスポートし、次にExcel内でYFP-MFIを、ウェスタンブロッティングにより決定したACAP-LBC-PDE-E43の発現レベルおよびローディングコントロールであるalpha-tubulinで標準化し、YFP平均蛍光強度の線形範囲を決定します。HEK293細胞において、CFPをVN-ACAP-LBCおよび varying amountsのVC-PDE-E43と共導入し、本ビデオで説明したバイフローサイトメトリーを用いて相互作用を評価しました。このプロットは、導入したVC-PDE-E43の量に対するVC-PDE-E43発現の相対的な倍率変化を示しています。

青色の正方形で示されるCFP陽性細胞におけるVenusの平均蛍光強度は、VCDE 43の発現と相関しており、赤色の三角形で示されるウェスタンブロットの画像解析によって決定された発現レベルと一致していました。緑色の正方形で示されるサンプル間では、同様のCFP平均蛍光強度が認められ、細胞間のばらつきを制限するためのネガティブコントロールとして使用されました。これらの結果は、BS eの平均蛍光強度を測定することでACAB LB C PDE 43の相互作用を定量化するためのフローサイトメトリーの使用を正当化し、同時に、PDE E 43内のACAP LBC結合部位をマッピングするためのスクリーニングに使用する適切なBICコンストラクト量を決定し、フルレングスのPDE E 43 flとACAP LBCの相互作用をBIC解析することを可能にします。

ここに示す方法を用いて、PDE 43のUCR 1領域、およびPDE 43のUCR 2およびCAT領域を評価しました。vn ACAP LBCとVC PDE 43 UCR 2 + CATの発現は、VC PDE 43 FLおよびVC PDE 43 UCR 1と比較して、BCシグナルが低くなります。すべてのフローサンプルで同様のタンパク質発現が観察され、平均蛍光強度はACAP LBC PDE 43およびalpha tubulinの相対的な発現レベルで正規化されました。したがって、正規化されたB-C-M-F-Iは、ACAP LBC PDE 43 FLとACAP LBC PDE 43 UCR 1の間に蛍光強度の差はないものの、ACAP LBC PDE 43 UCR 2 + CATの相互作用ではシグナルが大幅に低下していることを示しています。

これらの結果は、PDE 43の中にはACAP LBCと相互作用する領域が複数存在し、PDE 43 UCR R oneがACAP LBCとの主要な相互作用領域であることを示唆しています。このビデオを視聴することで、BP Cのフローサイトメトリー分析によるタンパク質間相互作用の研究方法について、十分に理解することができたはずです。この手順を試みる際は、同様のタンパク質発現および線形的なBP C応答を得るために、使用するBP C構築物の適切な量を決定することが重要であるということを忘れないでください。この手順の後、PDE 43内のどのアミノ酸が関与しているかを特定するために、ペプチドやリスクなどの他の手法を実施することができます。

そのACAPとRBCの相互作用。