同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

この手順の全体的な目標は、デュアルカメラ発光分割システムを使用して並列プレートフローチャンバー接着アッセイを実行し、リアルタイムの画像シーケンスを2色で同時に記録することです。これを行うには、まずイメージングセットアップ上の2台のカメラを位置合わせします。次に、細胞と反応性基質を調製し、平行プレートフローチャンバーを設置します。

その後、カメラの設定は2色画像取得用にキャリブレーションされ、必要なデジタル補正がカメラの位置合わせに行われます。次に、画像シーケンスがキャプチャされ、高い時間分解能を持つデュアルカラー画像の取得が実証されます。シングルカメラシステムに対するデュアルカメラエミッション分割システムの利点は、各カメラに異なる露光時間を割り当て、全視野を保持できることです。

この手法は、細胞表面の接着分子の局在化が細胞移動、炎症、がん転移などの動的な生物学的プロセスにどのように影響するかなど、細胞接着の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。次の手順では、倒立型落射蛍光顕微鏡が必要です。これには、ライトガイドに結合された高輝度光源、コンビネーションフィルターキューブ、およびデュアルカメラ発光分割カメラシステムを装備する必要があります。

顕微鏡のセットアップは、モノクロCCDカメラでキャプチャされた画像を収集および結合できるイメージングソフトウェアを実行しているコンピューターに接続する必要があります。ここでは、stream picks five multi-camera softwareをsimul picksモジュールとともに使用しています。まず、タスク リボンでストリーム ピック 5 を開き、ワークスペースを選択します。

次に、画面の右端にあるワークスペースマネージャーを開き、新しいワークスペースを選択します。カメラに名前を付けた後、ソフトウェアのプロンプトに従って、事前に入力されたリストから選択し、カメラモデルに一致するグラバーを選択すると、カメラフィードが受信されたことを示す小さなカメラアイコンがワークスペースに表示されます。顕微鏡で画像化された物体を画面上で見ることができます。

このプロセスを 2 番目のカメラ ワークスペースに対して繰り返し、次にマージされたワークスペースに対してもう一度このプロセスを繰り返し、すべてのカメラが使用中になります。エラーメッセージが表示されます。このメッセージは、ワークスペース 1 と 2 から、表示画面の右側にあるドッキング パネル内のマージされたワークスペースに通常割り当てられているカメラです。

ワークスペース 1 と 2 の画像は、マージされたワークスペースで 2 つの疑似カラー画像として重ね合わせられます。この手順で最も難しいのは、カメラの位置合わせです。成功を確実にするために、メーカーのスライドを使用しながら、メーカーの指示に従っています。

デュアルカメラ発光分割システムでカメラを位置合わせするには、明視野光または位相差光を顕微鏡の接眼レンズに送ります。メーカーから提供された金属コーティングされたキャリブレーショングリッドを顕微鏡ステージに置き、グリッドを顕微鏡ステージに正方形にします。ビニングや自動スケーリングなしでグリッドを表示し、焦点を合わせてから移動しますが、カメラを位置合わせするためにダイクロイックハウジングを取り外しないでください。

その後、海山ポート1のピント調整ダイヤルで、再度ピントを合わせます。次に、ダイクロイックハウジングをデュアルチャンネルアクイジションデバイスに完全に押し込み、画像がダイクロイックによって両方のカメラに分割されるようにします。3 5 60 4インチ止めネジを緩め、Cマウントポート2のフォーカス調整ダイヤルを使用して、グリッドの向きが両方の画像で同じになるまでメスCMマウントポート2の2番目のカメラを回転させ、カメラ2からの画像にピントを合わせます。

位置合わせを完了するには、DC 2の右側にあるRLノブを使用して、右が持ち上げられるまで結合された画像の位置を調整します。画像の垂直方向の境界は、マージされたワークスペースで正確に位置合わせされます。次に、UDノブを使用して、水平グリッドバーが適切に整列するまで、2番目の画像の上下の位置合わせを調整します。

アップダウンの位置合わせ中にカメラがわずかに回転する場合は、カメラ 2 の 3 5 60 4 インチネジを緩め、表示された画像が適切に位置合わせされるまで回転させて、この問題を修正します。添付文書に記載されているように、LOR5 68および4 88セカンダリーを使用して抗CD24およびTECA4 5 2で染色することにより、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイ用のBET20乳がん細胞を調製し、パラレルプレートフローチャンバーのリザーバーに細胞を染色した後、適切な単色コントロールを調製してください。2つの別々の長さのチューブをフローチャンバーの入口ポートと出口ポートに接続します。

1 本のチューブは、DPBS に懸濁された標識細胞と 0.1% PSA を含む細胞を含むリザーバーに接続します。もう一方のチューブをシリンジポンプに接続すると、指定された流量で液体が排出されます。バキュームラインをフローチャンバーに接続し、レクチンまたはcho e細胞を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞の単層を含む35mm組織培養皿の上にフローチャンバーを配置します。

フローチャンバーとフローチャンバーガスケットを調整して、適切な真空シールを確保します。リザーバーから液体を引き出し、フローチャンバーアセンブリが適切に密閉されるように監視します。最後に、フローチャンバーアセンブリを顕微鏡の電源に置き、光源と顕微鏡のセットアップを手動検査で行います。

ダイクロイックハウジングが正しい押し下げられた操作位置にあり、バイパスモードになっていないことを確認します。手動で蛍光モードに変更し、緑、赤の蛍光フィルターキューブを選択して、露光時間とゲインを別々に決定します。カメラ1で赤色の蛍光、カメラ2で緑色の蛍光を使用して細胞を画像化します。

必要に応じてダイクロイックを手動で押し下げて、画像を取得します。次に、赤色の植物相のみで染色したBT 20細胞の懸濁液を沈殿させます。リザーバー内の4つの標識抗体は、平行プレートフローチャンバーの入口ポートに接続されています。

シリンジポンプを使用して、平行プレートフローチャンバー内のチョイ単層にBT 20細胞を灌流します。イメージングソフトウェアのライブ設定で、カメラ1の露光時間を調整して、赤チャンネルの画像を取得します。カメラ 2 の露光時間をカメラ 1 の露光時間に合わせます。

画像が緑チャネルで観察される場合、にじみによるアーティファクトが存在します。これが発生した場合は、カメラ 1 とカメラ 2 で露光時間を同等に保ち、にじみのアーティファクトが緑チャンネルに表示されなくなるまで露光時間を短縮します。必要に応じて、カメラ1のゲインを調整して、赤チャンネルでの画像の視認性を向上させます。

次に、残っているBT 20セル懸濁液をリザーバーから取り外し、懸濁液をDPBSと交換します。シリンジポンプを使用して、BT 20細胞が単層に見えなくなるまで、チョイ単層に溶液を灌流します。緑色のフルオロ4標識抗体のみで染色したBT 20細胞の懸濁液をリザーバーに補充します。

緑色の単色コントロールを使用して、カメラのキャリブレーションプロセスを繰り返します。この時間は、カメラ 2 で露光時間を定義し、カメラ 1 で収集された赤チャンネルのアーティファクトをブリードせずに、緑チャンネルのセルを画像化します。イメージングソフトウェアを使用して、フローチャンバー内の2台のモノクロCCDカメラからキャプチャされた画像を同時に表示します。実験。

ストリームピックのサイマル写真モジュールを使用して、両方のカメラから収集された画像をマージします。サイマル写真または代替ソフトウェアでデジタル補正調整を使用して、結合された画像を空間的に整列させます。必要に応じて、simul PICモジュールを使用して画像を補正し、水平、垂直、回転の調整を行うことができます。

これで、2つのカラー画像を同時にキャプチャする準備が整いました。パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを使用して、このビデオで説明されているデュアルカメラ発光分割システムを実証しました。ここに示すように、システムは、赤色で示されている抗ヒトCD24と緑色で示されているSCO関連分子に結合するHECA452で蛍光標識されたBT20細胞を検出しました。

一部のローリングセルは赤信号を表示しましたが、緑信号は表示しませんでした。他のセルは緑の信号を表示し、赤の信号は表示せず、さらに他のセルは赤と緑の信号の両方を表示しました。ここは。カメラは、反応性基板上を流れの方向に転がり、転がり、端が転がる細胞上の細胞の特徴を追跡するための光学的および時間的解像度を維持し、融合した発光チャネルは、CHO e Monolayersに転がり接着するBT 20細胞の表面上のCD 24と飽和分子の分布と共局在を明らかにしました。

これらの画像は、CD 24と飽和分子が共局在し、赤と緑の疑似発光チャネルが合体すると黄色からオレンジ色の斑点として現れる単一のBT20細胞のズームを示しています。まとめると。この情報は、デュアルカメラ発光分割システムが、細胞が視野内を急速に移動するフローチャンバー接着アッセイなどのアプリケーションで細胞および分子の特徴を明らかにするために必要な空間的、時間的、光学的解像度を備えていることを示しています。

このビデオを見れば、デュアルカメラエミッションスプリッティングシステムのセットアップ方法とキャリブレーション方法、またはパラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを2色でリアルタイムにイメージングする方法を十分に理解できるはずです。この方法は、蛍光を使用して細胞の挙動を研究する他のin vitroアッセイにも適用できます。