同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

本手順の全体的な目的は、デュアルカメラ放射分割システムを用いて2色のリアルタイム画像シーケンスを同時に記録し、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを行うことです。このため、まずイメージング装置の2台のカメラをアライメントします。次に、細胞と反応性基板を調製し、パラレルプレートフローチャンバーをセットアップします。

次に、2色画像の取得に合わせてカメラ設定を校正し、カメラのアライメントに必要なデジタル補正を行います。続いて画像シーケンスを撮影し、高い時間分解能で2色画像が取得できていることを確認します。単一カメラシステムに対するデュアルカメラ放射分光システムの利点は、各カメラに異なる露光時間を設定でき、かつ視野全体を維持できる点にあります。

この手法は、細胞表面における接着分子の局在が、細胞遊走、炎症、がん転移などの動的な生物学的プロセスにどのような影響を与えるかといった、細胞接着分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。以下の手順には、倒立型エピ蛍光顕微鏡が必要です。この顕微鏡には、ライトガイドに接続された高輝度光源、フィルターキューブ、およびデュアルカメラ放射分光カメラシステムが備えられている必要があります。

顕微鏡装置は、モノクロCCDカメラで撮影された画像を収集および統合できるイメージングソフトウェアを搭載したコンピューターに接続してください。ここでは、simul picksモジュールを備えたstream picks five multi-camera softwareを使用します。まず、タスクリボンでstream picks fiveを開き、workspaceを選択してください。

次に、画面の右端にあるワークスペースマネージャーを開き、「new workspace」を選択します。カメラに名前を付けた後、ソフトウェアの指示に従い、あらかじめ用意されたリストからカメラモデルに一致するグラバーを選択します。ワークスペースに小さなカメラアイコンが表示されれば、カメラのフィードが受信されていることを示します。これで、顕微鏡で撮影した物体を画面上で確認できます。

このプロセスを2台目のカメラワークスペースでも繰り返し、その後、マージされたワークスペースでもう一度繰り返すと、すべてのカメラが使用可能な状態になります。エラーメッセージが表示されますが、これは正常な動作です。画面右側のドッキングパネルにあるマージされたワークスペースに、ワークスペース1と2から割り当てられたカメラを配置してください。

ワークスペース1と2の画像は、マージワークスペースにおいて、2つの擬似カラー画像として重ね合わせられます。この手順で最も困難なのはカメラのアライメントです。確実に成功させるため、製造元の指示に細心の注意を払いながら、製造元のスライドを使用します。

デュアルカメラ放射 splitting システムのカメラを調整するには、明視野または位相差光を顕微鏡の接眼レンズに送ります。メーカー提供の金属コーティングされたキャリブレーショングリッドを顕微鏡ステージ上に配置し、グリッドをステージ上で正方形に合わせます。ビニングおよびオートスケーリングを無効にしてグリッドを表示し、ピントを合わせた後、ダイクロイックハウジングを外さずに位置をずらしてカメラ1の調整を行います。

次に、seamountポート1のフォーカス調整ダイヤルを使用して、再度画像にピントを合わせます。続いて、ダイクロイックハウジングをデュアルチャンネル取得装置に完全に押し込み、ダイクロイックによって画像が両方のカメラに分割されるようにします。3/64インチのセットスクリューを緩め、グリッドの向きが両方の画像で同一になるまで、Cマウントポート2のメス側で2台目のカメラを回転させます。Cマウントポート2のフォーカス調整ダイヤルを使用して、2台目のカメラの画像にピントを合わせます。

アライメントを完了させるには、DC 2の右側にあるRLノブを使用して、統合ワークスペース内で画像の右側の垂直境界が正確に一致するまで、合成画像の位置を調整します。次に、UDノブを使用して、水平方向のグリッドバーが適切に一致するまで、2枚目の画像の上下のアライメントを調整します。

上下方向の調整中にカメラにわずかな回転が生じた場合は、カメラ2の3/60 4分の1インチネジを緩め、表示される画像が正しく整列するまで回転させて修正してください。付属のドキュメントに従い、anti-CD24およびTECA 4/5/2で染色し、LOR 5/68および4/88の二次抗体を用いて、パラレルプレートフローチャンバー細胞接着アッセイ用のBET 20乳がん細胞を調製します。染色の後、適切なシングルカラーコントロールを必ず調製してください。細胞をパラレルプレートフローチャンバーのリザーバーに分注します。フローチャンバーの入口ポートと出口ポートに、2本の独立したチューブを接続します。

一方のチューブを、0.1% PSAを含むDPBSに懸濁させた標識細胞が入ったリザーバーに接続します。もう一方のチューブをシリンジポンプに接続し、指定した流速で液体を吸引させます。真空ラインをフローチャンバーに接続し、レクチンを発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）の単層を含む35 mm組織培養ディッシュの上にフローチャンバーを配置します。

フローチャンバーとフローチャンバーガスケットを調整し、十分な真空シールが確保されていることを確認します。リザーバーから液体を吸引し、フローチャンバーアセンブリのシールが適切であるかを確認します。最後に、フローチャンバーアセンブリを顕微鏡に設置し、光源を点灯させ、目視で顕微鏡のセットアップを確認します。

ダイクロイックハウジングが正しく押し下げられた動作位置にあり、バイパスモードになっていないことを確認します。手動で蛍光モードに切り替え、グリーン・レッド蛍光フィルターキューブを選択して、露光時間とゲインを個別に決定します。カメラ1で赤色蛍光を、カメラ2で緑色蛍光を用いて細胞を撮像します。

画像を適切に取得するため、必要に応じてダイクロイックミラーを手動で調整した。次に、赤色蛍光色素のみで染色したBT 20細胞の懸濁液を、パラレルプレートフローチャンバーの導入ポートに接続されたリザーバーに滴下した。4つの接合抗体を用いて処理を行った。

シリンジポンプを用いて、パラレルプレートフローチャンバー内のchoi単層の上にBT 20細胞を灌流させます。イメージングソフトウェアのライブ設定で、カメラ1の露光時間を調整し、レッドチャンネルの画像を取得します。カメラ2の露光時間をカメラ1の露光時間と一致させます。

グリーンチャンネルに画像が観察される場合は、ブリードスルーアーティファクトが発生しています。この現象が起きた場合は、カメラ1とカメラ2の露光時間を同等に保ち、グリーンチャンネルでブリードスルーアーティファクトが見えなくなるまで露光時間を短縮してください。必要に応じて、レッドチャンネルの画像の視認性を向上させるためにカメラ1のゲインを調整してください。

次に、リザーバーから残りのBT 20細胞懸濁液を取り除き、DPBSに置き換えます。シリンジポンプを用いて、BT 20細胞が単層上に見えなくなるまで、溶液を単層上に灌流させます。リザーバーに、緑色フルオロ4標識抗体のみで染色したBT 20細胞懸濁液を再び満たします。

緑色の単色コントロールを用いて、カメラのキャリブレーションプロセスを繰り返します。今回は、カメラ1で収集される赤色チャンネルへのにじみ（ブリードスルー）アーティファクトが発生しないように、カメラ2の露光時間を設定して、緑色チャンネルで細胞をイメージングします。イメージングソフトウェアを使用して、フローチャンバー内の2台のモノクロCCDカメラからキャプチャされた画像を同時に確認してください。実験。

stream picsのsimul picsモジュールを使用して、両方のカメラで収集した画像を統合します。simul picまたは代替ソフトウェアのデジタル補正調整を用いて、統合された画像の空間的なアライメントを行ってください。必要に応じて、simul PICモジュールの水平、垂直、および回転調整で画像を補正することができます。

これで、2色の画像を同時にキャプチャするための準備が整いました。本ビデオで解説したデュアルカメラ蛍光分光システムのデモンストレーションには、平行平板フローチャンバー凝着アッセイを用いました。ここに示すように、本システムにより、抗ヒトCD24で赤色に蛍光標識したBT 20細胞と、SCO関連分子に結合するHECA 4 52で緑色に標識した細胞が検出されました。

一部のローリング細胞は赤色のみのシグナルを示し、別の細胞は緑色のみのシグナルを示し、さらに別の細胞は赤色と緑色の両方のシグナルを示しました。ここでは、カメラにより光学的な分解能と時間分解能が維持されており、反応性基質上で流れの方向に沿ってローリングし、回転しながら転がる細胞の特徴を追跡できました。統合された発光チャンネルにより、CHO細胞単層にローリングおよび接着するBT 20細胞の表面におけるCD 24とsated分子の分布および共局在が明らかになりました。

これらの画像は、単一のBT 20細胞を拡大したものであり、CD 24とsated分子が共局在し、赤色と緑色の擬似カラー放出チャネルを合成すると黄色からオレンジ色のスポットとして現れる様子を示しています。総合すると、これらの情報は、デュアルカメラ放出分割システムが、細胞が視野内を急速に移動するフローチャンバー接着アッセイのようなアプリケーションにおいて、細胞および分子の特徴を明らかにするために必要な空間的、時間的、および光学的な分解能を備えていることを証明しています。

このビデオを視聴することで、2色でのリアルタイム撮影によるパラレルプレートフローチャンバー接着アッセイのイメージング、またはデュアルカメラ放射分光システムのセットアップおよびキャリブレーション方法について十分に理解できるはずです。この手法は、蛍光を用いて細胞挙動を研究する他のin vitroアッセイにも適用可能です。