Name: 同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶデュアルカメラエミッション分割システムを用いた細胞接着アッセイのリアルタイム二色撮像法。この手法は高時間分解能で細胞動態を捉え、蛍光顕微鏡の品質を向上させる。

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著者は、洞察力に富んだ議論や論文審査のために博士ダグラス·ゲッツ（化学と生体分​​子工学専攻、オハイオ大学）博士ファビアンBenencia（医歯薬学総合研究科、オハイオ大学）に感謝したい。また、役立つ技術的な議論（W. Nuhsbaum社）博士クリストファーHuppenbauerに感謝します。この作品は、国立科学財団（CBET-1106118）と国立衛生研究所（1R15CA161830-01）からの補助金によって支えられている。

1。ソフトウェアのインストール<ol><li>購入StreamPix SimulPixモジュールまたはモノクロCCDカメラで撮影した画像を収集し、組み合わせることのできる他のイメージングソフトウェアを使用して5マルチカメラソフトウェア。 </li><li> StreamPix 5の最小要件は次のとおりです。2ギガバイト以上のRAMと2.4 GHz以上でのCore 2 Duoを搭載したパソコン。サポートIEEEデジタルまたはアナログのカメラと互換性のあるフレームグラバー。 Windowsは、32ビットまたは64ビットをXP/7/Vista。解像度102​​4×768以上をサポートするモニタ。優れた2D性能を備えたグラフィックアダプタ（OCUは16倍以上が推奨されて発現する）と7,200 RPMのRAID-0構成で記録するためのハードディスクドライブ。 </li></ol> 2。 2色同時リアルタイムイメージングが可能なデュアルカメラシステムの設置<ol><li> MICRのビデオポートにDC2 Cマウントアダプターをスライドさせて顕微鏡に、DC2フォトメトリック放射スプリッタ、または同様のデュアルカメラ発光分割装置を接続デバイス上の二色性の筐体がアクセス可能であることなどOSCOPE。 </li><li>女性Cマウント1に2のモノクロCCDカメラを挿入し、女性2 Cマウント。同一のカメラが好ましい。同様のカメラを用いることができるが、互換性は、CCDイメージセンサ、最も重要なのは、内部ハードウェアに依存する。 </li><li>両方のカメラからの画像を表示するには、画像処理ソフトウェアを使用してください。次の手順（2.3.1 - 2.3.4）SimulPixモジュールとStreamPix 5に適用され、他のマルチカメラ画像処理ソフトウェアに適応しなければならない。 <ol><li>オープンStreamPix 5とタスクリボンの「ワークスペース」を選択します。 </li><li>開いた「ワークスペース·マネージャ」画面の右端に位置しており、「新しいワークスペース」を選択します。 </li><li>カメラに名前を付けた後、ソフトウェアがあらかじめ入力リストからグラバーを選択するように指示に従います。カメラモデルと一致グラバーを選択し、第2のカメラワークスペースの繰り返し。マージされたワークスペースには、もう一度繰り返しますが、エラーM &quot;すべてのカメラが使用されている」essageが表示されます。このメッセージは正常です。 </li><li>マージされたワークスペースがロードされると、視聴画面の右側に配置され、ドッキングパネルでマージされたワークスペースにワークスペース1とワークスペース2からカメラを割り当てます。 </li></ol></li><li>デュアルカメラの排出分割システムでカメラの位置を合わせます。 <ol><li>明視野またはPlanApo対物レンズ40倍（またはそれ以上）を使用して、メーカーが提供するキャリブレーショングリッド位相コントラストにカメラの位置を合わせます。 </li><li>顕微鏡ステージ上で、製造業者によって提供された金属でコーティングされたキャリブレーショングリッドを配置し、顕微鏡の接眼レンズに光を送信し、顕微鏡ステージ上のグリッドを二乗。 </li><li>焦点にグリッドを持参してください。 </li><li>変位が、カメラ1（バイパスカメラ）を整列させるために、ダイクロイックハウジングを削除しないでください。ビニングなしで自動スケーリングせずにグリッドを表示します。 Cマウントポート1に焦点調整ダイヤルを使用して画像の焦点を合わせる。 </li><li>デュアルchanneにダイクロ住宅をプッシュ完全リットル取得装置、画像が両方のカメラにダイクロによって分割されるようになっている。 </li><li> 3 64分の5」のネジを設定し、グリッドの向きが両方のイメージで同じになるまで、女性のCマウント2に第2のカメラを回転させます。Cマウントポート2上で焦点調整ダイヤルで、カメラからの画像を持って緩め焦点に2。 </li><li>イメージングソフトウェアのマージされたワークスペースに合成された画像を使用して配置を完成させる。これは1キャリブレーショングリッドの二つの画像をリアルタイムで疑似カラーオーバーレイを見ることができます。 DC2の右側にのみ、R / Lのノブを使用して合成された画像位置を調整します。画像の左/右の縦の境界を正確に整列されるまで、このノブを調整します。 </li><li>水平格子棒が適切に整列されるまで、第2の画像のアップ/ダウンの配置を調整するために、U / Dノブを使用してください。 </li><li>上/下の位置合わせの際に若干のカメラの回転は3 64分の5 &quot;インチSCREを緩めて、正しいこの問題が発生した場合カメラ2のためのWSと表示された画像が適切に整列されるまで回転させます。 </li></ol></li></ol> 3。平行板フローチャンバー接着アッセイのためのがん細胞の調製<ol><li>最小必須培地（MEM）中で培養BT-20乳癌細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン、37℃で、およびCO 2は 、先2に記載5.0％で媒体を完了するために補充した。 </li><li>希薄トリプシン処理で収穫癌細胞および血球計算板を用いて細胞を数える。 </li><li>洗浄とカルシウムとマグネシウム（DPBS +）とのDPBS中ウシ血清（BSA）、0.1％のアルブミン中の10 7細胞/ mlで細胞を懸濁。 </li><li> 0.1％BSA、DPBS +での所定の最適濃度に、一次抗体、精製マウス抗ヒトCD24および精製ラットHECA-452（抗シアロフコシル化抗原）希薄。 30分9、10のために細胞をインキュベートします。 </li><li> 1,200 rpmで遠心分離細胞は、細胞ペレットを得た。 ASPI一次抗体を評価し、0.1％BSAをDBPS +で細胞を2回洗浄します。 </li><li> 0.1％BSA DPBS +で所定の最適濃度は、二次抗体、ヤギ抗マウスIgGのAlexaFluor 568（発光最大値、603ナノメートル）、およびヤギ抗ラットIgM抗体のAlexaFluor 488（発光最大519 nm）を、希釈する。 30分間、細胞をインキュベートします。 </li><li>細胞を2回洗浄し、0.1％BSA、DPBS +で10 6細胞/ mlで、0.1％のBSA、DPBS +で一時停止。 </li></ol> 4。平行板フローチャンバー接着アッセイのための反応基質の調製<ol><li> 35mm組織培養皿内に収まるパラレルプレートフローチャンバーの入口および出口ポートにチューブを2つの別々の長さを接続する。 Oneチューブを所定の流量で流体を撤退するシリンジポンプに0.1％BSA DPBS +およびその他の中に懸濁標識細胞のリザーバに接続します。 </li><li>フローチャンバー1に真空ラインを接続します。 </li><li> 35ミリメートルの組織培養ディ経由でフローチャンバーを配置するshのE-セレクチン（CHO-E）を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞の単層を含有する。 CHO-E細胞を、37℃でMEM完全培地中で増殖させ、5.0％CO 2れた。 </li><li>適切な真空シール1を確保するために、フローチャンバーおよび/ ​​またはフローチャンバーガスケットを調整します。 </li><li>適切なシール及び気泡の発生1の視覚的な証拠なしのフローチャンバアセンブリを監視する、リザーバから流体を引き出す。 </li><li>顕微鏡（ライカDMI 6000B）のフローチャンバアセンブリを配置する1。 </li></ol> 5。 2色画像を取得<ol><li>光ガイド内に高強度の光と結合する、それを生成するために電力ライカEL-6000小型の光源、又は同様の装置。所望の色/輝度の蛍光プローブを励起するため、フィルターキューブコンビネーションフィルターキューブ、 すなわち G / R（緑/赤）を介して、この光を通過させるように倒立顕微鏡を使用してください。 </li><li>ダイクロハウジング（押し下げ）が正しい動作位置にあることを確認し、バイパス·モードではありません。 </li><li>蛍光モードで顕微鏡を操作して、適切な蛍光フィルターキューブ（緑/赤）を選択します。 </li><li>カメラ1の露光時間、ゲイン決定（赤、620±60 nm）であり、カメラ2（緑; 535±40nmで）。 <ol><li>両方の赤と緑の発光チャンネルの画像を取得するために、ダイクロイックを押し下げる。赤色のみフルオロフォアで標識された細胞を用いたフローチャンバーアッセイを使用して、イメージングソフトウェアの「ライブ設定」にカメラ1の露光時間を調整することにより、赤のチャネル画像を得る。 </li><li>カメラ1の露光時間にカメラ2の露光時間と一致する。画像は緑チャネルにおいて観察された場合、ブリー​​ドスルーアーチファクトが存在し、両方のカメラの露光時間を短縮する必要がある。 </li><li>ブリードスルーアーチファクトが緑色チャネルに見えなくなるまで、露光時間を短縮せず、カメラ1とカメラ2の露光時間と同等に保つ。イメージを改善するために、カメラ1の利得を調整visibilit必要に応じて、赤チャンネルのY。 </li><li>唯一の緑の蛍光体で標識した細胞で5.4.3が、カメラ1が収集し、赤のチャンネルでのブリードスルーのアーティファクトなしに緑のチャンネルで画像セルにカメラ2で露光時間を定義する - を繰り返して、5.4.1を繰り返します。 </li><li>ブリードスルー場合アーチファクトRetitrate抗体が11を除去することができない、又は、カメラ1とカメラ2の露光時間は、マージされた画像が時間的にずれてもよいように、実質的に異なっている場合。 </li></ol></li><li>同時にフローチャンバー実験における2モノクロCCDカメラから撮影した画像を表示するには、画像処理ソフトウェアを使用してください。 </li><li> Streampix 5のSimulPixモジュールまたは代替ソフトウェアパッケージを使用して両方のカメラから収集された画像を合成。 </li><li>必要に応じて、空間的にマージされた画像を位置合わせするためにSimulPixにおけるデジタル補正の調整や別のソフトウェアを使用してください。画像は、水平、垂直のためSimulPixモジュールを補正することができる、および回転の調整。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

デュアルカメラ発光分割システムは、細胞または分子の動きが速い用途で高品質の画像をキャプチャするために必要な空間的、時間的、および光学的分解能を有する。代表的な結果を生成する際に、ソフトウェアの設定やカメラ設定を含むデュアルカメラ発光分割システム、のパラメータは、ローリングおよび接着細胞は、空間的および時間的に整列されたマージされた画像シーケンスを得るために最適化した。ミスアライメントが適切に両方の緑と赤のチャネルで展開することが観察さ例えば 、単一のセルがマージされたワークスペースで2ローリングのセルとして表示されることがあり、調査中の物理現象を伝えていないイメージになることができるように、この最適化ステップは、非常に重要です。プロトコールのステップ2.4​​で説明したようにカメラが物理的に並んでいるとき、空間的な位置合わせは、デュアルカメラエミッション分割システムのセットアップで達成されるべきである。画像CAPTの空間配置にデジタル修正カメラによるuredは、イメージングソフトウェア（工程5.7および図5）におけるデジタルアライメント設定を介して（複数の）水平、垂直、または回転オフセ...

例えば、免疫染色、細胞表面上の分子の分析のための方法、化学的標的分子の検出を可能にする、フルオロフォアにコンジュゲートされたプローブを用いる。生細胞イメージングおよび流体力学的フローベースの細胞接着アッセイは、典型的には、細胞および/ ​​または分子レベル1、2で生理学的プロセスを捕捉するように設計されたモノクロCCDカメラで記録される。これらのカメラは、高速フレームレート（1秒あたりのより大きい30フレーム）を提供し、（原因速いフレームレートと短い露光時間に）非常に優れた時間分解能を提供する、非常に敏感である。しかし、モノクロカメラは、画像のみを収集するために（シングル蛍光体を検出する）、単一の放出チャネルをキャプチャすることができます。単一のカメラ発光分割システムは、複数の放射チャネルを捕捉するために組み込まれたが、多くの場合、視野を低減し、全チャンネルを画像化するために同じ露光時間を必要とすることができる。 multipで標識した細胞から完全なカラースペクトラムをキャプチャするにはルフルオロフォア、カラーカメラは、代替として使用することができる。しかしながら、カラーカメラは、一般に、特定の用途において生細胞イメージングのために所望の時間分解能を提供することができない。別の撮像装置は、高時間分解能を維持しながら、複数の波長で画像生細胞に有利である用途のために必要とされる。プライミング実験のアプリケーションは、細胞が潜在的に反応性の基板1,3の上に生理学的に関連する条件下で灌流された平行板フローチャンバー接着アッセイである。このような接着分子または表面に吸着細胞外マトリックスタンパク4,5を発現する細胞単層のような特定の細胞表面分子を発現する細胞をフロー内の基板上に付着し、ロールよい。ローリング細胞は、第二の画分に回転および並進運動を受けることができる。このような細胞表面分子のクラスターとしてローリングおよび接着細胞上の分子の機能も、ポテンショを有する細胞表面上で活性の再編成を受けるらこれにより、撮像システムは、6,7の圧延セルのステップバイステップの進行を示す画像シーケンスを生成するために、例外的な時間分解能（秒以上と露光時間「ゼロに近い」毎秒30フレーム）を提供しなければならない。デュアルカメラ発光分割システムは、複数のフルオロフォアで標識された細胞を画像化するためのこれらの要求を満たすことができる。 デュアルカメラ発光分割システムは、全視野を維持しながら、同時に2つの空間的に同一であるが、フルオロフォア固有の画像を捕捉するつの類似のカメラに蛍光チャネルを分割し、フィルタ。この技術は、各チャネルの実時間で撮像した画像の直接比較を可能にし、ユーザが迅速に異なる撮像機能を備えたカメラモデルの間で切り替えることができる。この特徴は、より良いシステムをキャプチャすることを可能にする1つのカメラで画像キャプチャ設定を調整する場合に有用である異なる強度、寿命、および吸光係数8と蛍光団。イメージングソフトウェアと相まって、二重カメラ放出分割システムは、複数の波長の生細胞イメージングアッセイのリアルタイム記録を可能にし、細胞の挙動を研究するために蛍光を使用するin vitroアッセイを高めることができる。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬/材料</td></tr><tr><td>BT-20細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td></td></tr><tr><td>CHO-E細胞</td><td>R.サックスタイン博士(ブリガム・アンド・ウィメンズ)からの贈り物ハーバード大学医学部病院)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM </td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン / 0.1% EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30031.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>HECA-452 モノクローナル抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555946</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD24 モノクローナル抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555426</td><td></td></tr><tr><td>抗ラット IgM AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21212</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス IgGAlexaFluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>EXi 青色蛍光顕微鏡 デジタルCCDカメラ</td><td>Qイメージング</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>レティガ EXi FAST 1394 デジタルCCDカメラ</td><td>Qイメージング</td><td>RET-EXi-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>DC2 エミッションスプリッター</td><td>フォトメトリクス</td><td>DC2</td><td></td></tr><tr><td>倒立型蛍光顕微鏡</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Streampix 5 software</td><td>Norpix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

細胞膜に特異的な分子を検出するための多色免疫蛍光顕微鏡は、動的流動条件下での細胞接着を支配するメカニズムを調べるために平行プレートフローチャンバーアッセイと結合することができる。例えば、複数のフルオロフォアで標識された癌細胞は、癌転移のメカニズムをモデル化するために潜在的に反応性の基板上に灌流することができる。しかしながら、リアルタイムの生細胞分析のための画像取得におけるマルチチャネル単一カメラシステムとカラーカメラの欠点を呈する。これらの制限を克服するために、我々は同時に、フローチャンバー内の蛍光標識された細胞のリアルタイム画像シーケンスをキャプチャするために、デュアルカメラ発光分割システムを使用した。デュアルカメラ発光分割システムフィルタ定義された波長は、それによって、同時に2つの空間的に同一であるが、フルオロフォア固有の画像を取り込む2のモノクロCCDカメラ、にわたる。続いて、1チャンネルの画像を単一に統合されpsuedocoloredリアルタイムは、関心領域を横切って急速に移動する細胞上の複数の標的分子を明らかにすることができる配列をマージ。

パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイは、同時に2つの発光チャネル（ 図1）内のリアルタイム画像シーケンスをキャプチャし、デュアルカメラ放出分割システムを実証するために使用した。デュアルカメラの排出分割システムは、蛍光抗ヒトCD24およびHECA-452（シアロフコシル化抗原を検出する）モノクローナル抗体および適切な二次抗体（ 図2）で標識したBT-20細胞を検出した。赤信号（CD24）まだ検出できない緑信号（HECA-452）を表示し、いくつかのローリング細胞は、他の人は、緑信号と検出できない赤の信号を表示し、さらに他の細胞（ 図2）赤と緑の両方の信号を示した。マージされた放出チャネルは、BT-20細胞の表面上でローリングし、CHO-E単層（ 図3及び図4）に付着した上でCD24とシアロフコシル化分子の分布と共局在を明らかにした。デュアルカメラの排出SPLI準備システムは、もともとにより、カメラの位置合わせに若干の画像の位置合わせの誤差を持っていましたが、このエ...

二色蛍光顕微鏡用のデュアルカメラ発光分割システムは、優れた光学的および時間的解像度、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを含む特定の生細胞アッセイの要件にリアルタイム画像シーケンスを生成する。ソフトウェアは同時に取得放出チャネルからの画像を合成するために使用された場合、疑似色画像シーケンスが生成される。

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

本手順の全体的な目的は、デュアルカメラ放射分割システムを用いて2色のリアルタイム画像シーケンスを同時に記録し、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを行うことです。このため、まずイメージング装置の2台のカメラをアライメントします。次に、細胞と反応性基板を調製し、パラレルプレートフローチャンバーをセットアップします。次に、2色画像の取得に合わせてカメラ設定を校正し、カメラのアライメントに必要なデジタル補正を行います。続いて画像シーケンスを撮影し、高い時間分解能で2色画像が取得できていることを確認します。単一カメラシステムに対するデュアルカメラ放射分光システムの利点は、各カメラに異なる露光時間を設定でき、かつ視野全体を維持できる点にあります。この手法は、細胞表面における接着分子の局在が、細胞遊走、炎症、がん転移などの動的な生物学的プロセスにどのような影響を与えるかといった、細胞接着分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。以下の手順には、倒立型エピ蛍光顕微鏡が必要です。この顕微鏡には、ライトガイドに接続された高輝度光源、フィルターキューブ、およびデュアルカメラ放射分光カメラシステムが備えられている必要があります。顕微鏡装置は、モノクロCCDカメラで撮影された画像を収集および統合できるイメージングソフトウェアを搭載したコンピューターに接続してください。ここでは、simul picksモジュールを備えたstream picks five multi-camera softwareを使用します。まず、タスクリボンでstream picks fiveを開き、workspaceを選択してください。次に、画面の右端にあるワークスペースマネージャーを開き、「new workspace」を選択します。カメラに名前を付けた後、ソフトウェアの指示に従い、あらかじめ用意されたリストからカメラモデルに一致するグラバーを選択します。ワークスペースに小さなカメラアイコンが表示されれば、カメラのフィードが受信されていることを示します。これで、顕微鏡で撮影した物体を画面上で確認できます。このプロセスを2台目のカメラワークスペースでも繰り返し、その後、マージされたワークスペースでもう一度繰り返すと、すべてのカメラが使用可能な状態になります。エラーメッセージが表示されますが、これは正常な動作です。画面右側のドッキングパネルにあるマージされたワークスペースに、ワークスペース1と2から割り当てられたカメラを配置してください。ワークスペース1と2の画像は、マージワークスペースにおいて、2つの擬似カラー画像として重ね合わせられます。この手順で最も困難なのはカメラのアライメントです。確実に成功させるため、製造元の指示に細心の注意を払いながら、製造元のスライドを使用します。デュアルカメラ放射 splitting システムのカメラを調整するには、明視野または位相差光を顕微鏡の接眼レンズに送ります。メーカー提供の金属コーティングされたキャリブレーショングリッドを顕微鏡ステージ上に配置し、グリッドをステージ上で正方形に合わせます。ビニングおよびオートスケーリングを無効にしてグリッドを表示し、ピントを合わせた後、ダイクロイックハウジングを外さずに位置をずらしてカメラ1の調整を行います。次に、seamountポート1のフォーカス調整ダイヤルを使用して、再度画像にピントを合わせます。続いて、ダイクロイックハウジングをデュアルチャンネル取得装置に完全に押し込み、ダイクロイックによって画像が両方のカメラに分割されるようにします。3/64インチのセットスクリューを緩め、グリッドの向きが両方の画像で同一になるまで、Cマウントポート2のメス側で2台目のカメラを回転させます。Cマウントポート2のフォーカス調整ダイヤルを使用して、2台目のカメラの画像にピントを合わせます。アライメントを完了させるには、DC 2の右側にあるRLノブを使用して、統合ワークスペース内で画像の右側の垂直境界が正確に一致するまで、合成画像の位置を調整します。次に、UDノブを使用して、水平方向のグリッドバーが適切に一致するまで、2枚目の画像の上下のアライメントを調整します。上下方向の調整中にカメラにわずかな回転が生じた場合は、カメラ2の3/60 4分の1インチネジを緩め、表示される画像が正しく整列するまで回転させて修正してください。付属のドキュメントに従い、anti-CD24およびTECA 4/5/2で染色し、LOR 5/68および4/88の二次抗体を用いて、パラレルプレートフローチャンバー細胞接着アッセイ用のBET 20乳がん細胞を調製します。染色の後、適切なシングルカラーコントロールを必ず調製してください。細胞をパラレルプレートフローチャンバーのリザーバーに分注します。フローチャンバーの入口ポートと出口ポートに、2本の独立したチューブを接続します。一方のチューブを、0.1% PSAを含むDPBSに懸濁させた標識細胞が入ったリザーバーに接続します。もう一方のチューブをシリンジポンプに接続し、指定した流速で液体を吸引させます。真空ラインをフローチャンバーに接続し、レクチンを発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）の単層を含む35 mm組織培養ディッシュの上にフローチャンバーを配置します。フローチャンバーとフローチャンバーガスケットを調整し、十分な真空シールが確保されていることを確認します。リザーバーから液体を吸引し、フローチャンバーアセンブリのシールが適切であるかを確認します。最後に、フローチャンバーアセンブリを顕微鏡に設置し、光源を点灯させ、目視で顕微鏡のセットアップを確認します。ダイクロイックハウジングが正しく押し下げられた動作位置にあり、バイパスモードになっていないことを確認します。手動で蛍光モードに切り替え、グリーン・レッド蛍光フィルターキューブを選択して、露光時間とゲインを個別に決定します。カメラ1で赤色蛍光を、カメラ2で緑色蛍光を用いて細胞を撮像します。画像を適切に取得するため、必要に応じてダイクロイックミラーを手動で調整した。次に、赤色蛍光色素のみで染色したBT 20細胞の懸濁液を、パラレルプレートフローチャンバーの導入ポートに接続されたリザーバーに滴下した。4つの接合抗体を用いて処理を行った。シリンジポンプを用いて、パラレルプレートフローチャンバー内のchoi単層の上にBT 20細胞を灌流させます。イメージングソフトウェアのライブ設定で、カメラ1の露光時間を調整し、レッドチャンネルの画像を取得します。カメラ2の露光時間をカメラ1の露光時間と一致させます。グリーンチャンネルに画像が観察される場合は、ブリードスルーアーティファクトが発生しています。この現象が起きた場合は、カメラ1とカメラ2の露光時間を同等に保ち、グリーンチャンネルでブリードスルーアーティファクトが見えなくなるまで露光時間を短縮してください。必要に応じて、レッドチャンネルの画像の視認性を向上させるためにカメラ1のゲインを調整してください。次に、リザーバーから残りのBT 20細胞懸濁液を取り除き、DPBSに置き換えます。シリンジポンプを用いて、BT 20細胞が単層上に見えなくなるまで、溶液を単層上に灌流させます。リザーバーに、緑色フルオロ4標識抗体のみで染色したBT 20細胞懸濁液を再び満たします。緑色の単色コントロールを用いて、カメラのキャリブレーションプロセスを繰り返します。今回は、カメラ1で収集される赤色チャンネルへのにじみ（ブリードスルー）アーティファクトが発生しないように、カメラ2の露光時間を設定して、緑色チャンネルで細胞をイメージングします。イメージングソフトウェアを使用して、フローチャンバー内の2台のモノクロCCDカメラからキャプチャされた画像を同時に確認してください。実験。stream picsのsimul picsモジュールを使用して、両方のカメラで収集した画像を統合します。simul picまたは代替ソフトウェアのデジタル補正調整を用いて、統合された画像の空間的なアライメントを行ってください。必要に応じて、simul PICモジュールの水平、垂直、および回転調整で画像を補正することができます。これで、2色の画像を同時にキャプチャするための準備が整いました。本ビデオで解説したデュアルカメラ蛍光分光システムのデモンストレーションには、平行平板フローチャンバー凝着アッセイを用いました。ここに示すように、本システムにより、抗ヒトCD24で赤色に蛍光標識したBT 20細胞と、SCO関連分子に結合するHECA 4 52で緑色に標識した細胞が検出されました。一部のローリング細胞は赤色のみのシグナルを示し、別の細胞は緑色のみのシグナルを示し、さらに別の細胞は赤色と緑色の両方のシグナルを示しました。ここでは、カメラにより光学的な分解能と時間分解能が維持されており、反応性基質上で流れの方向に沿ってローリングし、回転しながら転がる細胞の特徴を追跡できました。統合された発光チャンネルにより、CHO細胞単層にローリングおよび接着するBT 20細胞の表面におけるCD 24とsated分子の分布および共局在が明らかになりました。これらの画像は、単一のBT 20細胞を拡大したものであり、CD 24とsated分子が共局在し、赤色と緑色の擬似カラー放出チャネルを合成すると黄色からオレンジ色のスポットとして現れる様子を示しています。総合すると、これらの情報は、デュアルカメラ放出分割システムが、細胞が視野内を急速に移動するフローチャンバー接着アッセイのようなアプリケーションにおいて、細胞および分子の特徴を明らかにするために必要な空間的、時間的、および光学的な分解能を備えていることを証明しています。このビデオを視聴することで、2色でのリアルタイム撮影によるパラレルプレートフローチャンバー接着アッセイのイメージング、またはデュアルカメラ放射分光システムのセットアップおよびキャリブレーション方法について十分に理解できるはずです。この手法は、蛍光を用いて細胞挙動を研究する他のin vitroアッセイにも適用可能です。

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

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同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

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