Name: 1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶ 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードの構築方法。エピ蛍光、超解像、FRETイメージングを統合し、コストを抑えながら高度な単一分子検出を実現する実用的なガイドです。

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J. f. は、サール学者プログラムおよび NIH のディレクターの新しいイノベーター賞からサポートを認めています。著者は、ポール セルビン ラボ (アーバナ平原イリノイ大学) 3 D レンズを配置するための有用な示唆をご了承ください。

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<li>Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+photoactivatable+fluorophores+created+by+reductive+caging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging.</a> Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).</li>
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<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
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<li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+biochemistry.+Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li>
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<li>Stracy, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+super-resolution+imaging+of+transcription+in+living+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria.</a> Methods. 120, 103-114 (2017).</li>
<li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li>
<li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+disruption+of+ciliary+transition-zone+architecture+causes+Joubert+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome.</a> Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).</li>
<li>Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+nanoimprint+lithography+for+drift+correction+in+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy.</a> Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).</li>
</ol>

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このハイブリッド顕微鏡システムには、複数の顕微鏡を購入する必要があります。光学テーブル、テーブル ・ インストレーション、ソフトウェア、およびワークステーションを含む全ての部品の総コストは約 $230,000。マグ レンズと 3 D レンズを含むカスタム加工部品コスト約 $700 (コストは異なる機関で実際の請求によって異なります) です。典型的な市販システムのための統合単一分子検出に基づく SR 顕微鏡コスト以上の $300,000 〜 400,000 と容易に使用できない smFRET 測定、または合理的な視野のエピ イメージング白ライトなしソース。したがって、ここで紹介した方法は、コスト大幅削減で複数の顕微鏡と同等の画像処理機能を実現できます。
この変調顕微鏡システムは、さまざまなメーカーから選べるボディをに基づいてできます。3 D レンズは、排出スプリッター、顕微鏡本体内またはフィルター ホイールと客観的ノーズピースと使用可能な領域を含む排出パス内の任意の位置で潜在的インストールことができます。ただし、3 D レンズの物理的な場所は 3次元イメージングのための最高の非点収差...

蛍光顕微鏡は現代生物学研究のための重要なツールであり、蛍光イメージングは多くの生物学研究所で定期的に実行されます。Fluorophores が付いている興味の分子をタグ付け、直接顕微鏡の下で視覚化し、ローカリゼーション、構造、相互作用、およびアセンブリ状態で体内または体外で経時変化を記録できます。従来の蛍光顕微鏡は横方向に 200 ~ 300 nm と 500 ~ 700 nm 軸方向1、2、そして、したがっての 100 s でイメージングに限る回折限界の分解能があります。ナノメートル-ミクロン スケール。分子集合体または組織の細部を明らかにするため、回折限界を破ることができる様々 な SR 系が開発されています。SR を達成するために使用される戦略は、誘導放出の枯渇 (STED) 顕微鏡3,4や構造化照明顕微鏡 (SIM)5,6,などの非線型光学効果7、確率光再建顕微鏡 (嵐)8とセンサー ローカリゼーション顕微鏡 (パーム)9MINFLUX10など、両方の組み合わせなど、単一の分子の検出を確率。これらの SR 系の中で、単一分子の顕微鏡のセットアップから単一分子検出に基づく SR 顕微鏡を比較的簡単に変更できます。反復的な活性化と活性型蛍光タンパク質 (FPs) または興味の分子タグ写真切替可能な染料のイメージングは、空間分解能は 10-20 nm11を達することができます。分子間相互作用と立体構造情報を得るためには、リアルタイム ・ オングストローム-ナノメートル分解能動態が必要です。smFRET12,13は、この解像度を達成するために 1 つのアプローチです。一般に、生物学的興味に応じて、空間解像度の異なる撮像方法が必要です。
通常、各タイプのイメージ投射では、特定の励起および/または放射光の構成が必要です。例えば、単一分子検出のための最も一般的に使用される照明手法の 1 つは特定の励起角度がプリズムや対物レンズを通じて達成する必要があります内部全反射 (TIR) を通じてです。・空間的分離、電子-乗算の電荷結合素子 (EMCCD)、ミラー、ダイクロイック ビームスプリッターのセットを得ることができるのさまざまな部分に指示必要があります smFRET 検出、ドナーとアクセプターの染料からの排出量排出パスに配置されます。3 次元 (3-D) 排出パスの非点収差の影響を引き起こすこと SR イメージング、14シリンドリカル レンズなどの光学部品が必要です。したがって、自作や市販の統合された顕微鏡は、通常、機能的イメージング法の種類ごとに特化した、同じセッティングのさまざまなイメージング方法を切り替える柔軟ではありません。3 つの異なる撮像方法間調整で再現可能なスイッチを提供するコスト効率の高いハイブリッド システムの紹介: 単一分子検出に基づく SR の回折限界解像度と、従来のエピ蛍光イメージングイメージングおよびマルチカラー単一分子検出、smFRET イメージング (図 1 a) を含みます。具体的には、ここに示す設定を含む多波長励起入力レーザのファイバー結合型、商業照明アームにより、励起のパスにプログラム epi モードと TIR モードを切り替える、励起角度のコントロール。排出パス 3次元イメージングのための顕微鏡体内リムーバブル自作円筒レンズ カセットを配置し、複数の発光チャンネルを検出する選択的に有効にできる、EMCCD カメラ手前にある商業ビームスプリッター同時に。

<table><tbody><tr><td>ニコンTi-E顕微鏡スタンド</td><td>ニコン</td><td>Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>100X NA 1.49 CFI HP TIRF</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡イメージングソフトウェア</td><td>ニコン</td><td>NIS-Elements Advanced Research/HC</td><td>HCには、SRイメージングに使用されるプログラム取得モジュールである「JOBS」モジュールが含まれています。</td></tr><tr><td>イルミネーションアーム</td><td>ニコン</td><td>Ti-TIRF-EM 電動イルミネーターユニット M</td><td>倍率レンズ用のスロットを持つアームです</td></tr><tr><td>アナライズブロック</td><td>ニコン</td><td>Ti-A</td><td>フィルタータレットに取り付けられています。</td></tr><tr><td>Zドリフト補正装置</td><td>ニコン</td><td>PFS</td><td>対物レンズノーズピースにステッピングモーター、IR LED、検出器を搭載するシステムです。</td></tr><tr><td>光学テーブルトップ</td><td>TMC</td><td>783-655-02R</td><td></td></tr><tr><td>光学テーブルベース</td><td>TMC</td><td>14-426-35</td><td></td></tr><tr><td>647 nm レーザー</td><td>Cobolt</td><td>90346 (0647-06-01-0120-100)</td><td>変調レーザーダイオード 647nm 120mW レーザーヘッド、CDRHコントロールボックス、USBケーブル、PSU(電源ユニット)を含む</td></tr> <tr><td>561 nmレーザー</td><td>Coherent</td><td>1280721</td><td>OBIS 561nm LS 150mW レーザーシステム</td></tr><tr><td>488 nmレーザー</td><td>Cobolt</td><td>90308 (0488-06-01-0060-100)</td><td>変調レーザー ダイオード 488nm 60mW レーザー ヘッド、CDRH コントロール ボックス、USB ケーブル、PSU (電源ユニット)</td></tr> <tr><td>を含む 405 nm レーザー</td><td>クリスタライザー</td><td>DL405-025-O</td><td>405 (+/-5)nm、25mW、円形、M2 <1.3、低ノイズ、CW、TTL最大20MHz、TTLおよびTTL用BNCコネクタ2個アナログ調整</td></tr><tr><td>ヒートシンク</td><td>Cobolt</td><td>11658(HS-03)</td><td>2ユニット、ファンHS-03なしヒートシンク、647nmおよび488nmレーザー用ヒートシンクヒート</td></tr><tr><td>シンク</td><td>Coherent</td><td>1193289</td><td>Obisヒートシンク、ファン付き、165 x 50 x 50 mm(561 nmレーザー用</td></tr>) <tr><td>CAB-USB-miniUSB</td><td>Cobolt</td><td>10908</td><td>2ユニット、647 nmおよび488 nmレーザー用通信ケーブル高さ</td></tr><tr><td>調整用アルミニウム</td><td>McMaster-Carr</td><td>9146T35</td><td>多目的 6061 アルミニウム、長方形バー、4MM X 40MM、高さ調整用 561 nm レーザー アルミニウムを上げるための長さ</td></tr><tr><td></td><td>1 フィート McMaster-Carr</td><td>8975K248</td><td>多目的 6061 アルミニウム、厚さ 1-1/4 インチ X 3 インチ 幅 X 1 インチ 405 nm レーザー</td></tr><tr><td>BNC ケーブル</td><td>L-com</td><td>CC58C-6</td><td>RG58C 同軸ケーブル、BNC オス / オス、6.0 フィート</td></tr><tr><td>BNC アダプター</td><td>L-com</td><td>BA1087</td><td>同軸アダプター、BNCバルクヘッド、接地</td></tr><tr><td>SMA-BNC</td><td>アダプターHOD</td><td>SMA-870</td><td>Cobolt MLDレーザーはSMAインターフェースを備えているため、このアダプターはBNC接続に使用されます。</td></tr><tr><td>SMB-BNCアダプタ</td><td>Fairview Microwave</td><td>FMC1638316-12</td><td>SMBプラグ - BNCメスバルクヘッドケーブル RG316 Coherent Obisレーザ用12インチ同軸</td></tr><tr><td>データ収集カード</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6723</td><td>13ビット、32チャンネル、800 kS/秒 レーザ、DIC LEDなどを制御するためのアナログ出力デバイス</td></tr><tr><td>バリアフィルタホイールコントローラ</td><td>サッター計器</td><td>ラムダ10-B</td><td>光学フィルタチェンジャー</td></tr><tr><td>発光スプリッター</td><td>Cairn</td><td>OptoSplit III</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックビームスプリッター</td><td>Chroma</td><td>T640LPXR-UF2</td><td>OptoSplit IIIで赤色発光と緑色発光を分離するダイクロイックビームスプリッター</td></tr><tr><td></td><td>Chroma</td><td>T565LPXR-UF2</td><td>OptoSplit IIIで緑色と赤色の発光を分離するダイクロイックビームスプリッター OptoSplit</td></tr><tr><td>III発光フィルター</td><td>Chroma</td><td>ET700/75M</td><td>2ユニット、OptoSplit IIIの赤色発光用蛍光フィルター(Alexa Fluor 647など)、バリアフィルターホイール</td></tr><tr><td>蛍光</td><td>フィルターChroma</td><td>ET595/50M</td><td>2ユニット、OptoSplit IIIの黄色/緑色発光(Cy3Bなど)用蛍光フィルター、バリアフィルターホイール</td></tr><tr><td>蛍光</td><td>フィルターChroma</td><td>ET525/50M</td><td>2つのユニット、青色発光用蛍光フィルター(Alexa Fluor 488 / GFPなど)OptoSplit IIIおよびバリアフィルターホイール</td></tr><tr><td>蛍光</td><td>フィルターSemrock</td><td>FF02-447 / 60-25</td><td>紫色発光用蛍光フィルター(DAPI / Alexa Fluor 405など)、バリアフィルターホイール</td></tr><tr><td>ダイクロイックビームスプリ</td><td>ッターChroma</td><td>zt405 / 488/561/647 / 752rpc-UF3</td><td>に取り付けられています顕微鏡本体内部の647、561、488、405nmレーザー励起用マルチバンドダイクロイックビームスプリッター</td></tr><tr><td>DAPIフィルターセット</td><td>顕微鏡本体に取り付けられた</td><td>Chroma</td><td>49000</td></tr><tr><td>ニコンレーザー/TIRFフィルターキューブ</td><td>Chroma</td><td>91032</td><td></td></tr><tr><td>590ロングパスフィルター</td><td>647nmレーザーと561nmレーザーを組み合わせるための</td><td></td><td>T590LPXR-UF1</td></tr><tr><td>525ロングパスフィルター</td><td>Chroma</td><td>T525LPXR-UF1</td> は<td>、すでに組み合わされた647 nmと561nmのレーザーを488 nmレーザーと組み合わせるための</td></tr>ものです <tr><td>470ロングパスフィルター</td><td>T470LPXR-UF1</td><td></td>は<td>、すでに組み合わせた647 nm、561 nm、488 nmのレーザーと405 nmレーザーを組み合わせるための</td></tr>ものです <tr><td>レーザークリーンアップフィルター(647)</td><td>Chroma</td><td>zet640/20x</td><td>647 nmレーザーから他の波長をクリーンアップするための</td></tr>レーザー<tr><td>クリーンアップフィルター(488)</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-25</td><td>488nmレーザーLED</td></tr><tr><td>光源</td><td>Excelitas</td><td>X-Cite120LED</td>から他の波長をクリーンアップするため <td>DAPIイメージングのみに使用される</td>LED</tr><tr><td>ミラーマウント</td><td>ニューポート</td><td>SU100-F3K</td><td></td></tr><tr><td>オプティカルポスト</td><td>ニューポート</td><td>PS-2</td>クランプフォーク ニューポートPS-F<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パワーメーター</td><td>ニューポート</td><td>PMKIT</td><td>レーザーパワーの測定用</td></tr><tr><td>ダイクロイックビームコンバイナーマウント</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>58-872</td><td>Cマウント キネマティックマウント、レーザー励起アセンブリにダイクロイックビームコンバイナーを保持するため</td></tr><tr>リ<td>テーニングリング</td><td>Thorlabs</td><td>CMRR</td><td>ダイクロイックビームコンバイナーマウントに使用</td></tr><tr><td>ファイバーアダプタープレート</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FC</td><td>/PC ファイバーアダプタープレート 外部SM1 (1.035"-40) スレッド</td></tr><tr><td>Z軸並進マウント</td><td>Thorlabs</td><td>SM1Z</td><td>Z軸トランスレーションマウント、30 mmケージ対応</td></tr><tr><td>アクロマティックダブレットレンズ</td><td>Thorlabs</td><td>AC050-008-A-ML</td><td>&Oslash;5 mm、マウントされた無彩色のダブレット、ARコーティング:400 - 700 nm</td></tr>ケージ<tr><td>プレート</td><td>Thorlabs</td><td>CP1TM09</td><td>30 mmケージプレート、M9 x 0.5内部ねじ、8-32タップ</td></tr><tr><td>ケージアセンブリロッド</td><td>Thorlabs</td><td>ER4</td>ケージ<td>アセンブリロッド、4インチロング、&オスラッシュ;6 mm</td></tr><tr><td>ケージ取り付けブラケット</td><td>Thorlabs</td><td>CP02B</td><td>30 mm ケージ取り付けブラケット</td></tr><tr><td>シングルモード光ファイバー</td><td>Thorlabs</td><td>P5-405BPM-FC-2</td><td>パッチ ケーブル、PM、FC/PC から FC/APC、405 nm、パンダ、2 m</td></tr><tr><td>マルチモード光ファイバー</td><td>Thorlabs</td><td>M42L01</td><td>&Oslash;50 マイクロ;m、0.22 NA、FC/PC-FC/PCファイバーパッチケーブル、1 m</td></tr><tr><td>アクロマティックダブレットレンズ(マグレンズ)</td><td>Thorlabs</td><td>ACN127-025-A</td><td>ACN127-025-A - f = -25.0 mm、&Oslash;1/2 "アクロマティックダブレット、ARC:400-700 nm、 "マグレンズ"の凹レンズ"</td></tr><tr><td>アクロマティックダブレットレンズ(マグレンズ)</td><td>Thorlabs</td><td>AC127-050-A</td><td>f = 50.0 mm、&Oslash;1/2 "アクロマティックダブレット、ARC:400-700 nm、「マグレンズ」の凸レンズ「マグレンズ」</td></tr><tr><td>リテーニングリング</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PRR</td><td>SM05プラスチックリテーニングリング&Oslash用;1/2インチレンズチューブとマウント、「マグレンズ」用</td></tr>ナイロン<tr><td>チップネジ</td><td>Thorlabs</td><td>SS3MN6</td><td>M3 x 0.5ナイロンチップ止めネジ、長さ6 mm、「3Dレンズ」を保持するため3D</td></tr><tr><td>レンズ</td><td>CVIレーザー光学系</td><td>RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700</td><td>f = 10 m、長方形シリンドリカルレンズ</td></tr><tr><td>EMCCDカメラ</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>100 nmマルチチャンネルビーズ</td><td>サーモ</td><td>T7279、TetraSpeck マイクロスフェア</td><td></td></tr><tr><td>赤色色素</td><td>Thermo</td><td>Alexa Fluor 647</td><td></td></tr><tr><td>黄緑色色素</td><td>GE Healthcare</td><td>Cy3</td><td></td></tr><tr><td>緑色色素</td><td>GE Healthcare</td><td>Cy3B</td><td></td></tr><tr><td>青色色素</td><td>Thermo</td><td>Alexa Fluor 488</td><td></td></tr></tbody></table>

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

蛍光顕微鏡は、その場で生体分子の検出し、その動態とリアルタイムの相互作用を監視する強力なツールです。従来のエピ蛍光顕微鏡に加えて様々 なイメージング技術は実験の特定の目標を達成するために発達しました。Å の解像度と単一分子検出に基づく分子間相互作用の構造変化とに報告される単一分子蛍光共鳴エネルギー移動 (smFRET) を含むいくつかの広く使われている技術超解像度 (SR) イメージング、回折限界顕微鏡に比べて twentyfold に空間分解能約 10 を高めることができます。従来エピ蛍光イメージング、分子検出に基づく放射光イメージング、マルチカラー単一分子検出など、1 つの顕微鏡の複数の撮像方法をマージ顧客設計統合システムを紹介します。smFRET イメージングを含みます。光学素子を切り替えることにより、簡単かつ再現性をもってさまざまな撮像方法を実現できます。このセットアップは、ルーチンと多様なイメージング実験コストの削減と建物の個々 の目的別顕微鏡に比べて、領域の必要性と生物科学のすべての研究所によって採用する簡単です。

この顕微鏡では、柔軟性と再現性のあるさまざまなイメージング方法を切り替えることができます。ここで各イメージング モジュールで収集したサンプル画像を紹介します。
図 5は、SR 取得中に点滅に分子の PSF を示します。最終的な SR イメージ (図 5E) を生成する何千ものような画像が再現されます。図 5 eは、図 7Aのエピ蛍光イメージで示すように、同じ細菌規制 Rna を示しています。図 7は、U2OS 哺乳類細胞における大腸菌細胞における小規制 RNA と mRNA の代表的なエピ蛍光画像を示します。両方の Rna は、DNA オリ...

従来のエピ蛍光イメージング、分子検出に基づく超解像イメージング、およびマルチカラー単一分子検出を結合、統合された顕微鏡システムの構築の実践的なガイドの紹介など単一分子蛍光共鳴エネルギー移動イメージング、コスト効率の高い方法の 1 つの設定にします。

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

この方法は、同じ顕微鏡を使用して超解像度画像やFRET画像を取る方法など、光学顕微鏡分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、3つの異なるイメージングモジュールを1つの顕微鏡に組み合わせることができ、全体的なコストを大幅に削減できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、励起経路の組み立てが学習しにくいため重要です。それらは部品の適切な選択および敏感な光学的な直線を要求する。まず、PCIインターフェイスを介してデータ取得カードを取り付け、それを使用してレーザーをコンピュータに接続します。トランジスタ-トランジスタロジック出力によるレーザーのオン/オフ動作、およびこのカードのアナログ出力によるパワー調整を制御します。次に、ここに示すように、それに付随するテキストプロトコルに記載されているように、鏡とビームスプリッターを備えた振動分離光学表を準備します。Z軸変換台にファイバーアダプタプレートを取り付けて、レーザービームをシングルモード光ファイバに組み合わせます。次に、ケージプレートに伴奏式ダブレットレンズを取り付けます。アダプターとレンズを接続してケージを形成するために、延長棒を使用します。次に、1インチの厚い光ポストを使用して、光テーブルにケージを取り付けます。コンポーネントを調整して、ファイバーを通して最大のレーザー出力を得るようにして、647ナノメートルのレーザーを位置合わせします。最初のレーザーのアライメントが完了したら、一時的に一対のアイリスを取り付け、残りのレーザーを1つずつ揃えます。パワーメーターを使用して、各レーザーのアライメント効率を確認します。レーザーの反射を減らすために、アダプタプレートの前に虹彩を1つ残してください。次に、付属のテキストプロトコルに記載されているように、拡大レンズを設計して設置します。1つの分子のZ座標を抽出するのに必要な乱視効果を作り出すために、10メートルの焦点距離を持つ3Dレンズをカセットに入れ、それを放射ビーム経路に挿入します。連続多色蛍光イメージングの際の振動を最小限に抑えるには、顕微鏡の隣に接続されたバリアフィルターホイールに配置されたエミッションフィルタを使用します。単一分子 FRET 実験中の同時多色検出では、別のフィルターセットをエミッション スプリッタに配置します。エピ励起を使用して回折限定画像撮影を設定するには、まず励起レーザーの付随角度を照明アームのエピモードに調整します。次に、3D レンズを外し、バイパス立方体を放出スプリッタに挿入します。次に、広い照明用のマグレンズを挿入します。設定が完了したら、目的の結果に基づいて、マルチチャンネル、Zスタック、および/またはサンプルの時間経過画像を取得します。表面固定化分子の多色単分子検出を設定するには、まずフィルタホイールを空の位置に移動します。これにより、レーザーが通過できるようになります。次に、励起レーザーの付随角度を芝の角度に調整し、マグレンズと3Dレンズの両方を外します。次に、まずバイパスキューブをキャリブレーションキューブに置き換えて、すべてのライトがすべてのチャネルを通過できるようにして、エミッション スプリッターで 3 チャンネル モードを調整します。次に、DICの下でカメラをオンにし、3つの完全に分離されたチャネルが画面に表示されるまで、放出スプリッターの開口部を調整します。エミッションスプリッタの垂直水平調整コントロールノブを回し、3つのチャンネルを大まかに揃えます。次に、カメラの電源を切り、キャリブレーションキューブをトリプルキューブに置き換えます。100ナノメートルのマルチチャンネルビーズのサンプルを配置します。488ナノメートルで励起すると、100ナノメートルのマルチチャンネルビーズは異なる波長の光を放出し、3チャンネルのアライメントを可能にします。次に、カメラと488ナノメートルのレーザーをオンにし、明るいビーズの1つをズームインし、最後に調整コントロールノブを再び回して3つのチャンネルを整列させます。サンプルを配置し、弱いレーザーを使用して、妥当なスポット密度の領域に移動し、レーザーパワーと露出時間を調整して、許容可能な信号対雑音および光発光レベルを達成します。次に、イメージングソフトウェアを使用して、タイムラプス画像を撮影します。超解像度のイメージングの場合は、まず3Dレンズを挿入して、マグレンズを取り外します。次に、最適な励起レーザーの付随角度を芝の角度に決定します。SRイメージングの適切な目標高さを求めるには、DICイメージングを使用して細胞の中間面を見つけます。セルが透明になる高さで平面を識別します。目的の焦点面が決定されたら、超解像度イメージングを開始します。イメージング中に、405ナノメートルのレーザーのパワーを変え、点滅するスポットの適切な密度を維持します。バイオレットレーザーパワーなしでイメージングを開始します。一定期間の点滅スポットの数をカウントし、ビューの分野でユーザー定義のカウントしきい値を超えて点滅スポットの数が維持されるように、バイオレットレーザーパワーを増加させます。イメージングフレーム内の各スポットの重心を検出してデータを分析し、X幅とY幅から各スポットのZ値を抽出します。再構築されたイメージを構築し、3D でオブジェクトを視覚化します。この顕微鏡のセットアップは慣習的な蛍光イメージ投射、単分子検出ベースの超解像のイメージ投射および多色単一分子の検出を含む異なったイメージ投射方法間の適用範囲および再生可能な切り替えを可能にする。分子集合体の詳細を明らかにするために、超解像顕微鏡は、このような画像の数千を組み合わせたものです。これらの画像は、最終的な超解像度の画像を生成するために再構築されます。超高解像度の手法では、空間解像度が高く、他のテクニックでは見ることができない詳細な情報を提供します。これは、ここに示す 2 つの画像で強調表示されます。超解像画像は、蛍光画像と同じ細菌調節RNaseを示していますが、単一分子検出を可能にします。SmFRETは、ナノメートル分解能に対するオングストロームが可能な別の方法である。ここで、折り畳まれたRNA分子は、緑色ドナー色素と赤色のアクセプター色素で標識した。蛍光強度の軌跡は、個々の単一分子から抽出することができ、時間の関数としてFRET効率を生成する。レーザーを使用すると危険な場合があり、眼の保護を着用したりレーザーパワーを下げたりするなどの予防措置は、常にこの手順を実行する場所で取られるべきであることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。...

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

二色蛍光顕微鏡用のデュアルカメラ発光分割システムは、優れた光学的および時間的解像度、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを含む特定の生細胞アッセイの要件にリアルタイム画像シーケンスを生成する。ソフトウェアは同時に取得放出チャネルからの画像を合成するために使用された場合、疑似色画像シーケンスが生成される。...

同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。...

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。...

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

このプロトコルは、積極的に収縮している心臓の柱状の筋柱からサルコメア、カルシウム、および巨視的幾何学的データの集合...

心臓トラベキュラEx Vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング

ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。...

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

ラベルフリーの光学イメージングモダリティを組み合わせたマルチモーダルプラットフォームを利用して、細胞のダイナミクスと代謝を視覚化および定量化するためのプロトコルを開発しました。多光子蛍光、第2高調波発生、および誘導ラマン散乱顕微鏡によるイメージングを通じて、細胞および分子環境の全体像を生成することができます。...

細胞代謝研究のためのマルチモーダル光学イメージングプラットフォーム

手動IBEX法による低コストで汎用性の高い光照射技術の実装により、有意な天然自家蛍光でヒト組織の最適なイメージングが可能になります。このプロトコルでは、倒立顕微鏡、広く利用可能な試薬、および画像のアライメントと処理のためのオープンソースソフトウェアを使用して、アーカイブされた臨床サンプルからマルチプレックス化されたホールスライド画像を取得する方法を詳しく説明しています。...

反復漂白に最適化されたワークフローにより、高自家蛍光の臨床サンプルのマルチプレキシティイメージングが拡張されます

このプロトコルは、レーザー光源の生成方法、組織サンプルの調製方法、イメージングの実施方法、およびデータの分析方法の詳細を含む、同時ラベルフリー自家蛍光多重高調波(SLAM)顕微鏡技術のステップバイステップガイドを提供します。SLAMは、組織微小環境を調査するために4つの相補的なラベルフリーコントラストを測定することにより、非線形顕微鏡を進歩させます。...

同時ラベルフリー自家蛍光多高調波顕微鏡

スペクトル共焦点顕微鏡を使用したハイプレックスイメージングにより、非特異的組織蛍光を最小化

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。...

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

学ぶ 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードの構築方法。エピ蛍光、超解像、FRETイメージングを統合し、コストを抑えながら高度な単一分子検出を実現する実用的なガイドです。

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

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