コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

この手順の全体的な目標は、全細胞モードで最大12個の細胞のパッチクランプ記録を実行することです。これは、最初に目的の各細胞の位置をマークし、各細胞にピペットを割り当てることによって達成されます。2番目のステップは、各ピペットの先端を特定し、ピペットを割り当てられたセルの隣に自動的に移動させることです。

次に、一度に1本のピペットで各細胞にアプローチします。細胞膜との密接なシールを確立するための最終ステップは、細胞の膜を破裂させ、全細胞記録を行うことです。最終的に、コンピュータ支援多電極パッチクランプ記録は、小さなニューロン回路のネットワーク特性を高解像度で示すために使用されます。

手動パッチクランプのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、ネットワーク内で観察できる接続の数が、記録されているニューロンの数の2乗とともに増加することです。パッチクランプのステップは、その複雑さと実行速度のために習得が難しい場合があるため、この手法の視覚的なデモンストレーションは重要です。この手順は、顕微鏡の変位範囲の中心に関心領域を持つ脳スライスを配置することから始めます。

次に、目的の細胞を特定します。次に、顕微鏡の座標系に基づいて細胞の位置を保存します。グラフィカルインターフェースには、選択した細胞とマイクロピペットが表示され、全体像が見え、ソフトウェアが細胞位置にマーカーを追加して画像に重ね合わせます。

さらに、セルの画像は後で参照できるようにキャプチャされます。目的のセルを選択したら、グラフィカルインターフェースで割り当てコントロールを設定して、個々のセルの記録に使用するピペットを割り当てます。最終構成のプレビューを視覚化するには、[最終位置を表示] チェック ボックスをオンにします。

次に、細胞内溶液でピペットを準備し、ホルダーに置きます。ヘッドステージを固定しますが、前方にスライドさせないでください。ピペットチップでバスに触れないように、陽圧制御を有効にし、すべてのピペットを選択します。

先端が清潔なままになるように、各ヘッドステージを所定の位置にそっとスライドさせます。次に、ボタンAを押しながらR 2ボタンを押して、スライスの2ミリメートル上に焦点を合わせて顕微鏡を中央位置に配置します。この点 A.At ボタンを押しながらLの2ボタンを押して、前の実験から保存された各マニピュレーターの対応する位置を使用すると、ピペットの特徴的な影が見えるか、ピペットの軸に沿った小さな動きで十分ですそれを観察するために。ピペット形状のわずかな違いの補正は手動で行う必要があります。

次に、ピペットチップにピントを合わせます。次に、ビデオディスプレイの中央の赤い点に先端を置きます。顕微鏡を動かさずに、コントローラーのボタンCを押しながらZボタンを押して、ピペットがディスプレイの中央にあることをソフトウェアに通知します。

個々のピペットチップが見つかったら、そのピペットを後方に送り、ボタンaを押しながらLワンボタンを押して次のピペットを見つけられるようにします。すべてのピペットチップが正確に特定され、各ピペットがセルに帰属すると。グラフィカルな表示ウィンドウでセルグループの中央を右クリックし、ポップアップメニューのクラスターオプションを選択するだけで、ピペットをそれぞれのセルの近くに自動的に配置できます。

クラスターオプションウィンドウで、この時点で配置するすべてのピペットを選択し、チェックしたピペットで移動をクリックします。対象のセルのクラスターごとにこの手順を繰り返します。最終的なアプローチを実行するには、細胞に対するピペットの位置を、ピペットの軸上で細胞から200ミクロン離れ、垂直方向に200ミクロン上に指定し、ピペットの先端を組織の外側に保つのに十分です。

その後、ピペットの位置決めが終了するまで待ちます。次に、ボタンを押したままRボタンを押して顕微鏡をピペットに向かって動かしますC.ビデオディスプレイの任意の場所で顕微鏡を先端に焦点を合わせ、ボタンを押しながらBボタンを押すことにより、各ピペットの位置を再校正しますC.ピペットの識別位置を示す正方形のグリッドが一時的に表示されます。位置が正しくない場合は、先端をビデオディスプレイの中央のドットに置き、コントローラーのボタンCを押しながらZボタンを押します。

次に、現在のピペットの対象セルが正しくマーキングされ、アクティブにマーキングされていることを確認します。それ以外の場合は、中央の赤い点と目的の細胞を一致させるために顕微鏡を動かし、ボタンC.C.次に、ボタンを押しながらL 2ボタンを押して、割り当てられた細胞から200ミクロン離れたピペットを配置する C.To、顕微鏡は自動的に対応する位置に移動します。ピペットの位置を調整して、赤い点に一致させます。

次に、R oneボタンを押してピペットのオフセットを調整します。ボタンxを押しながら。ボタンxを押したままLワンボタンを押して、テストパルスをアクティブにします。

その後、ピペットをゆっくりと帰属セルに移動します。細胞の膜の表面にくぼみが形成されているのを観察したら、ボタンZを押したままYボタンを押して負圧の短いパルスを印加し、加えられた圧力が細胞に到達するようにします。この時点で、ボタンxを押しながらLの2つのボタンを押すことにより、約マイナス65ミリボルトの保持電位を確立する必要があります。

各細胞にギガシールが形成されたら、負圧を加えて膜を破裂させ始めます。次に、刺激取得システムを使用して記録を行います。個々のセルにパルスまたはパルス列を一度に1つずつ適用し、残りのセルの応答を観察して、これらの記録されたセル間の接続をマッピングします。

録音が終了したら、テーブルのラジオボタンを右クリックして、ピペットをティッシュからゆっくりと引き離します。リセプトピペット500ミクロンを選択して、ピペットを軸に沿って短い距離後退させます。次に、細胞がピペットを後退させる電位のドリフトを観察します。

位置決め速度を高速に設定し、同じ操作を繰り返しますが、すべてオプションを選択します。使用済みのピペットを取り外すには、ヘッドステージをそっとスライドさせ、ピペットをホルダーから緩めます。これは、個々の実験でマッピングされた直接シナプス結合のネットワークの例です。

これらの3つの接続性図は、レイヤー5に記録された12個のパラメタルセルのセットであり、それぞれの体細胞間距離があります。そして、これは、記録されたパラメタル細胞の形態学的染色に重ね合わせた接続図です。この図は、共通近傍効果を示しています。

青色の列は、サンプリングされたネットワーク内の少なくとも 1 つの他のニューロンに同時に接続されているニューロンのペアを示します。図表 相互接続される確率が大幅に増加しました。ここでは、複数の共通の隣接ノードを共有するニューロンのペアが、サンプリングされたネットワーク内で偶然に予想されるよりも頻繁に発生することを示しており、ニューロンのペア内の接続確率は、支払者によって共有される共通の隣接ノードの数に応じて増加します。

これらの特性により、スモールワールドのクラスターネットワークが生まれます。この図は、Martin nty細胞の動員の定量化を示しています。これは、赤のパラメタルセルが青色のMartin ntyセルにシナプスを形成し、さらに2番目のパラメタルセルにシナプスを形成する様子をグラフィカルに表現したものです。

黒色では、パラメタル細胞の閾値刺激がMartin nty細胞の動員につながります。興奮性シナプス後電位の促進の統合を通じて、動員されたMartin nty細胞は、次に第2のパラメタル細胞を阻害します。この図は、パッチクランプされたパラメタルセルの数の増加による刺激と、別のパラメタルセルへの影響を表しています。

これは、パラメタル細胞から記録された平均抑制性シナプス後電位を、刺激される他の近くのパラメタル細胞の数の関数として示します。局所回路におけるDYSシナプス阻害の振幅は、9つ以上のパラメタル細胞が刺激されると飽和する傾向があり、DYSシナプス阻害を受ける細胞の割合は、パラメタル細胞の数が増えると急速に1に上昇します。この手順を試行する際は、ピペットの先端を清潔に保ち、アプローチ段階で血管や他の細胞を避けて組織の歪みを最小限に抑えることが重要です。

この手順に続いて、別の細胞タイプによるパッチされたクランプ細胞の革新などの追加の問題に対処するために、光刺激などの追加の方法を採用することができます。このビデオを見れば、複数のニューロンのパッチクランプ手順を加速し、実行する方法を十分に理解できるはずです。