Name: 準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 学ぶアフリカツメガエルの視蓋ニューロンにおけるホールセルパッチクランプ記録法。脳標本作製と電気生理学的記録により、発達過程における神経回路の接続パターンと機能を解明します。この手法は神経発生学の研究に有用です。

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NIH グラント SBC COBRE 1P20GM121310-01 によってサポートされています。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ワイオミング大学のによって承認されています。電気生理学的記録を含めたすべての処理は、部屋の温度、およそ 23 ° c. で実施されてここで説明したすべてのメソッドは、発達段階 42 と 49 (Neiuwkoop、フェイバーの15によると上演) 間オタマジャクシからの視蓋ニューロンを記録するために最適化されています。
1体内の準備。
<ol><li>タドポールを麻酔します。<ol>
<li>0.01% スタインバーグのソリューションを含む小さなシャーレにタドポール MS-222 約 5 分。 注: MS-222 別名"Tricaine"は一般的な魚と両生類の麻酔です。オタマジャクシは mM でスタインバーグのソリューションで発生します: 0.067 倍 4.9 HEPES 5.8 NaCl、KCl、0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O。</li>
		<li>タドポールは手順 2 に進む前に、深くハイパーカプニア (応答がない、もはや水泳) を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>解剖記録/料理の床に冠水したシリコーン ブロック麻酔下のオタマジャクシを保護します。<ol>
<li>使い捨て可能な移動のピペットを使用して外部録音ソリューションを含んでいる解剖/記録皿にハイパーカプニアのオタマジャクシを移動 (115 mM nacl、KCl の 2 mM CaCl2の 3 mM、MgCl2の 3 mM、5 mM HEPES、ブドウ糖; の 1 mM の pH 調整 7.25 を使用するには10 N naoh、浸透圧 255 mOsm)。<ol>
<li>自発的な筋肉を最小限に抑えるためのけいれん、アセチルコリン受容体拮抗薬、ツボクラリン (100 μ M) 外部のソリューションに追加します。(通常、これは、外部溶液 10 mL に 10 mM ツボクラリン株式の 100 μ L を追加する 200 μ L ピペットを使用して)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>おたまじゃくし、背側、シリコーン ・ エラストマーの湛水ブロックに固定昆虫ピンを使用する (Sylgard 184 など詳細については表を参照してください、) を解剖皿床に接着されています。 注意: ピンの配置は重要です: 目からそのプロジェクト脳、RGC の求心性軸索を刺しを避けるために十分に尾の両側にそれらを配置し、ちょうど前方視蓋 (図 1A) 脳を入力してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>牛フィレ肉の正中線に沿って脳。<ol>
<li>脳のクリアな視界、滅菌 25 G 針を使用して正中線に沿って表面的な切開することによって脳を覆う皮膚を削除します。</li>
		<li>神経管に針を挿入して (背側) チューブの背の部分 (切断) の床の板がそのまま (図 1B) を残しながらカットがきれいにそのような物を引いてそっと上向きに同じ正中線軸に沿って脳を切り身。 注: 求心性感覚フロア プレートを介して蓋を入力するので、神経管の底板がそのまま残ってことが重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蓋ニューロンを覆う透明な心室膜を削除します。<ol>
<li>電気生理学のリグに記録皿を移動し、壊れたガラスのピペット チップを使用して蓋ニューロンの細胞体を覆う心室膜を削除します。軽く繊細なタスク ワイパーの間でドラッグすることで先端を破る。</li>
		<li>ピペット ホルダーにピペットをネジし、マニピュレーターを介して視蓋にそれを下げます。</li>
		<li>壊れたピペットを使用して、蓋から心室膜を剥離します。 注: 全体の蓋; から膜を削除する必要はありません。小さなウィンドウは十分で、ニューロンの多くへのアクセスを提供します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パッチ ・ クランプ記録セル全体を取得します。 注意: このポイント前方からのアプローチ Segevらに従ってマウス脳切片からセル全体パッチ クランプ録音実施と同様です。16(図 1C)。</li>
	<li>蓋ニューロン全体フィールド フラッシュ光を網膜上に投影のレスポンスを記録します。<ol>
<li>網膜上に光のフィールド全体のフラッシュに、幼生の目に隣接する光ファイバーを配置します。光ファイバーのもう一方の端を制御できる光の輝度は、可変抵抗器に沿った LED です。アンプのデジタル出力で LED をトリガーします。この方法では、光の強度変化の点滅がすることができます全体のフィールドは、(図 4A) を記録しました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 全脳の準備
<ol><li>1.1 から 1.3 の手順に従います。 注: この準備のための外部のソリューションでツボクラリンの必要はありません。</li>
	<li>脳を分離します。<ol>
<li>後脳 (図 2A) を断つに 25 G 針を使用します。</li>
		<li>タドポールから全脳を分離、そっと尾側吻側方向すべての側面と腹側の結合組織と神経線維を断つことで、脳の下に針を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シリコーン ・ エラストマーのブロックには、脳を保護します。<ol>
<li>一度完全に解放された, 嗅球のいずれかを 1 つピンと後脳 (図 2B) を別のピンを配置することによってシリコーン ・ エラストマーのブロックには、脳を保護します。これの視蓋ニューロンから記録に最適な構成です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電気生理学のリグに切り裂くスコープから固定された全脳の準備を含んでいる皿を移動します。1.4 の手順で説明するように壊れたガラス ピペットを使用して心室膜を削除します。</li>
	<li>双極刺激電極に配置視交叉 (中脳でそれぞれの眼から軸索路断面どこ) RGC 軸索を直接アクティブにします。<ol>
<li>吻側、および大きい中間心室にほぼ隣接する双極刺激電極を配置します。視交叉は大きい中間室 (図 2B) にすぐに吻側に位置しています。<ol>
<li>優しく下の刺激電極視交叉の上に小さなへこみが組織で形成されるように。バイポーラの電極は、正確に制御するために刺激の強度を可能にするパルス刺激によって駆動されます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segev et al.による記述で全細胞パッチク ランプ記録 (図 2C) を実行します。16
</li>
</ol>3. 水平脳スライス標本
<ol><li>2.1 から 2.3 の手順に従います。</li>
	<li>消費税 1 つこまの 1 つの側面の最も外側 4 番目 (どの生体内で最も背側の 4 番目に対応) にかみそりの刃を使用します。図 3Aに示すように吻側尾側平面に平行に作られるこのカット。</li>
	<li>再、スライスとシリコーン ・ エラストマーの側に脳をピン側 (つまり、突起や神経は、記録のため直接アクセスできます) 上向きとシリコーンのエラストマー ブロック (図 3 から離れて直面して脳の心室の表面B) (つまり、バイポーラ電極は、視交叉に配置できます)。</li>
	<li>Segev et al.による記述で全細胞パッチク ランプまたはローカルの下に潜在的な記録 (図 3C) を実行します。16
</li>
</ol>

<ol><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).</li>
<li>Pratt, K. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40139-015-0075-1">Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole.</a> Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).</li>
<li>Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+function+of+the+Xenopus+tadpole+retinotectal+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).</li>
<li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+regulation+of+voltage-gated+intrinsic+currents+in+the+developing+optic+tectum+of+the+Xenopus+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole.</a> J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).</li>
<li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+transmission+in+a+developing+visual+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit.</a> J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).</li>
<li>Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+analysis+of+electrophysiological+diversity+of+Xenopus+visual+neurons+during+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity.</a> Elife. 4, 11351(2015).</li>
<li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li>
<li>Wu, G., Malinow, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8875937">Cline H.T. of a central glutamatergic synapse.</a> Science. , 972-976 (1996).</li>
<li>Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory-evoked+spiking+behavior+emerges+via+an+experience-dependent+plasticity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism.</a> Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).</li>
<li>Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transcription+of+BDNF+enhances+visual+acuity+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development.</a> Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).</li>
<li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705(2008).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+avoidance+in+Xenopus+tadpoles+is+correlated+with+the+maturation+of+visual+responses+in+the+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum.</a> J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+horizontal+brain+slice+preparation%3A+a+novel+approach+for+visualizing+and+recording+from+all+layers+of+the+tadpole+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum.</a> J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland. New York. (1994).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).</li>
<li>Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Relationships+Impact+Neuronal+Tuning+within+a+Phylogenetically+Ancient+Vertebrate+Brain+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure.</a> Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).</li>
<li>Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+and+inhibition+in+recurrent+networks+mediate+collision+avoidance+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles.</a> Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).</li>
<li>Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+see%3A+patterned+visual+activity+and+the+development+of+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function.</a> Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).</li>
<li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+integration+in+mesencephalic+trigeminal+neurons+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles.</a> J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

この作品に記載されているすべてのメソッドは、発達段階 42 と 49 (Neiuwkoop、フェイバーの15によると上演) 間オタマジャクシからの視蓋ニューロンの記録に最適です。ステージ 42、オタマジャクシが十分に大きく、十分に発達した昆虫ピンは生体内での録音のため、全脳解剖を遂行するための脳の両側に置くことができるようにします。以前の段階、オタマジャクシが本質的に二次元で (すなわち、フラット)、ここで説明したアプローチが最適ではないです。
視蓋ニューロンをアクセスしてセル全体構成に記録できる、使いやすさのため19を形成しながら、このモデルの回路が機能している - と機能中どのように神経回路形態について基本的な発見の温床しました。ここで、生体内でおたまじゃくし全脳の準備、別の記録の構成とデータの種類の例を実行する方法などの視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を取得する方法を説明しました。さて、強みのディスカッション ・高...

発達回路は、両生類の視覚系の主要なコンポーネントです。それは、どのプロジェクトの視蓋ニューロンにシナプスとシナプス結合を形成するための軸索の目、Rgc ので構成されます。アフリカツメガエル幼生発達回路は、神経回路形成と機能を研究する人気発達モデルです。強力な実験的モデル1,2,3レンダリングこの幼生の発達回路の多くの属性があります。1 つの主要な属性と、この資料の焦点はからの視蓋ニューロンの生体内や脳全体準備を使用してセル全体パッチ クランプ録音を遂行する能力。電圧と電流クランプの記録モードをサポートしているアンプが備わっています電気生理学リグ、セル全体パッチ クランプ録音が高解像度で特徴付けられるニューロンの電気生理学できます。その結果、発達回路形成の主要な段階間の視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音が開発の詳細かつ包括的理解と本質的な4、5の可塑性を提供しています。,6,7とシナプス8,9,10,11プロパティ。セル全体パッチ クランプ蓋ニューロン録音を組み合わせ、遺伝子またはこれらのニューロンの12、および確立された視覚的回避テスト13を介して視覚的なガイド付き動作を評価する方法への関心の morpholinos を表現する能力を促進する、分子、回路機能と行動間のリンクの id。
セル全体パッチ クランプ録音から得られるデータは不可能遺伝的カルシウム インジケーター、GCaMP6 など新しいイメージング手法を用いた高解像度型カルシウム指示薬を使用することが許可されていますイメージングが重要です。カルシウムのニューロンの大規模な集団全体のダイナミクス、同時には直接またはある明白な方法は、いつつ、デルタの蛍光を測定することにより特定の電気パラメーターを取得でき、電圧に逃げ道はないクランプ測定するニューロン電流-電圧特性。明らかにこれらの 2 つの異なるアプローチ、電気生理学的記録、カルシウム イメージング、非重複の強みを持っている、異なる種類のデータを生成します。したがって、最善の方法は、対処されて特定の実験の質問に依存します。
ここでは、脳全体準備、生体内で製剤を用いたオタマジャクシの視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を獲得する手法について述べるし、新しい変更14 研究室で開発された脳全体準備.代表結果] セクションで、各準備と得ることができるデータの種類の実験の利点を示します。制限と異なる準備として、トラブルシューティングのためのヒントの強みは、ディスカッション セクションに含まれます。

<table><tbody><tr><td>ステミステレオ508</td><td>ツァイス</td><td>495009-0006-000&nbsp;</td><td>解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>MS-222 "Tricane"</td><td>Finquel</td><td>ARF5G</td><td>両生類全身麻酔薬</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S271-3</td><td>スティエンバーグ液と外液の調製に使用</td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>P217-500</td><td>シュティンバーグ液と外液の調製に使用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td>シュティンベルク溶液と外部溶液の調製に使用されます</td></tr><tr><td>硝酸カルシウム四ヒレート(Ca(NO3)&bull;4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124-500G</td><td>Stienbergの溶液を調製するために使用されます&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム(MgSO4)</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>スタインバーグ溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>外部記録溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム(MgCl2)</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-01</td><td>外部記録溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>D-グルコース無水</td><td>Mallinckrodtの化学薬品</td><td>6066-04</td><td>外部記録の解決</td></tr><tr><td>Tubocurarine塩酸塩pentahydrate</td><td></td><td>ΣT2379</td><td>ニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬</td></tr><tr><td>の昆虫ピン</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>0.1mmの直径のステンレス鋼ピン</td></tr><tr><td>Sylgard 184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウのコーニング</td><td>761028</td><td>予め秤量されたモノマーおよび硬化剤のキット</td></tr><tr><td>滅菌ポリスチレンのペトリ皿 - 60x15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4052</td><td>小さいペトリ皿</td></tr><tr><td>PrecisionGlideの針 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>シリンジの針</td></tr><tr><td>1mL スリップ チップ ツベルクリンのシリンジ&nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td>使い捨て、滅菌シリンジ</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ピペットガラス</td><td>サッター機器</td><td>BF150-86-10HP</td><td>ピペット引き機を使用して希望の仕様に引っ張る</td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-97</td><td>電気生理学記録用のマイクロピペットを製造</td></tr><tr><td>キムワイプ キムテックワイプ</td><td>キンバリークラーク</td><td>34120</td><td>デリケートタスクリントフリーワイパー</td></tr><tr><td>Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td>電流クランプと電圧クランプ ヘッドステージ</td></tr><tr><td>MP-285 卓上コントローラ付き電動マニピュレータ</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285/T</td><td>電気生理学リグのヘッドステージの制御</td></tr><tr><td>ファイバー結合LED (緑)</td> <td>Thorlabs</td><td>M530F2</td><td>緑色LEDとペアになった光ファイバーケーブル</td></tr><tr><td>クラスターバイポーラ電極(25&micro;m直径)</td><td>FHC</td><td>30207</td><td>バイポーラ刺激電極</td></tr><tr><td>ISO-Flex Stimulator</td><td>A.M.P.I. (イスラエル)&nbsp;</td><td>メーカーにお問い合わせください</td><td>フレキシブルスティミュラスアイソレーター</td></tr><tr><td>Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>電圧および電流クランプ記録用アンプ&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1322A デジタイザ</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-135</td><td>電気生理学記録用データ収集システム</td></tr><tr><td>Axio Examiner.A1</td><td>Zeiss</td><td>491404-0001-000&nbsp;</td><td>電気生理学用顕微鏡</td></tr><tr><td>Micro-g ラボテーブル</td><td>TMC</td><td>63-533</td><td>電気生理顕微鏡用エアテーブル</td></tr><tr><td>Inspiron 620 Windows 7 64ビット</td><td>Dell</td><td>D06D001</td><td>電気生理学ソフトウェアを実行しているコンピュータ</td></tr><tr><td>c2400 CCDカメラ</td><td>浜松</td><td>70826-5</td><td>電気生理学イメージング用電荷結合デバイスカメラ</td></tr><tr><td>7時 スーパープラチナ ステンレスカミソリ刃</td><td>ジレット</td><td>CMM01049</td><td>プラチナコーティングされたステンレス製カミソリの刃トランスファー</td></tr><tr><td>ピペットフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>13-711-7M</td><td>使い捨てポリエチレントランスファーピペット</td></tr></tbody></table>

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

アフリカツメガエル幼生発達回路、形成するシナプスの視蓋ニューロンに直接眼での網膜神経節細胞 (Rgc) の構成がどのように神経回路を研究する人気モデル自己組み立てます。全体を遂行する能力パッチ クランプ録音どちらか体内の RGC 誘発の応答を記録しての視蓋ニューロンからの細胞または通常の基になるメカニズムについて高解像度データの大きいボディを生成している全脳製剤を用いた、・異常、回路形成、機能。ここで体内の準備、元全脳の準備を実行する方法について説明より最近の視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を求める水平脳スライス標本を開発しました。それぞれの準備には、ユニークな実験的利点があります。生体内で準備できますの視蓋ニューロンの目に投影される視覚刺激への直接反応の記録です。脳全体の準備は、高度に制御された方法でアクティブにする RGC 軸索と水平脳スライス標本蓋のすべてのレイヤーにわたってからの録音が可能します。

光誘発電位を記録するには、光のフィールド全体のフラッシュは、個々 の視蓋ニューロン (図 4A) から結果の応答を記録しながら網膜上に投影されます。この特定のプロトコルは両方 (「オン」の応答) をオン、オフに 15 光にニューロンの応答を測定するように設計「オフ応答」を測定するために後で s視蓋ニューロンは通常応答の内外で堅牢な展示 (示されているここに記録された電圧クランプ モード、ニューロンはシナプス電流 (図 4B) を測定するために - 60mV クランプ)。自発的なシナプス イベント (図 4C) を記録することによって任意の一つのニューロンによって受信されたシナプスのドライブ量を定量化することができます。電流-電圧特性 (I-v カーブ) を同じニューロンからニューロンをますます脱...

アフリカツメガエル幼生の発達回路を勉強するセル全体パッチ ・ クランプ記録の 3 脳剤について述べる。それぞれの準備を独自の特定の利点は、神経回路機能を研究するモデルとしてアフリカツメガエルのオタマジャクシの実験的少ないに貢献します。

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

この手順の全体的な目標は、オタマジャクシ視蓋のニューロンから全細胞電気生理学的記録を取得し、発生中の接続パターンについて学び、最終的には神経回路がどのように形成および機能するかを理解することです。この方法は、ニューロンが発達の過程でどのように変化するのか、回路はどのように機能して行動を引き起こすのかなど、神経発達の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの調製物の主な利点は、視蓋ニューロンの電気生理学的記録を可能にし、発達中の神経回路の機能についての洞察を提供することです。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるZhenyu Luiです。廃棄移送ピペットを使用して、麻酔をかけたオタマジャクシを外部記録溶液を含む解剖記録皿に移します。麻酔をかけたオタマジャクシを、解剖記録皿の床にある水没したシリコンブロックに固定します。脳をはっきりと見るには、滅菌済みの25ゲージの針を使用して正中線に沿って表面的な切開を行い、脳を覆っている皮膚を取り除きます。針を神経管に挿入し、床板をそのままにして管の背側部分がきれいに切断されるようにゆっくりと上に引っ張ることにより、同じ正中線軸に沿って脳を切り詰めます。脳を分離するには、まず25ゲージの針を使用して後脳を切断します。次に、針を脳の下に尾側から吻側方向にそっと通し、すべての外側および腹側の結合組織と神経線維を切断します。次に、1本のピンを嗅球の1つに通し、もう1本のピンを後脳に通して、脳をシリコンエラストマーのブロックに固定します。これは、テクタルニューロンからの記録に最適な構成です。次に、ピン留めされた全脳製剤が入った皿を解剖スコープから電気生理学リグに移動します。壊れたガラスピペットを使用して心室膜を取り出します。RGC軸索を直接活性化するには、バイポーラ刺激電極を視交叉にゆっくりと下げて、組織に小さなへこみが形成されるようにします。バイポーラ刺激電極は吻側にあり、視交叉が位置する大きな中心室にほぼ隣接している必要があります。バイポーラ電極はパルス刺激装置によって駆動され、刺激の強さを正確に制御することができます。水平脳スライスを準備するには、全身の準備から始めます。次に、かみそりの刃を使用して、1つの視蓋の片側の最も外側の4分の1を切り取ります。このカットは、吻側尾面と平行に作成されます。その後、脳をシリコンエラストマーの側面に再度固定し、スライスした面を上に向けて、体腫と神経孔に直接アクセスして記録できるようにし、脳の心室表面をシリコーンエラストマーブロックから遠ざけて、バイポーラ電極を視交叉に配置できるようにします。次に、全細胞パッチクランプまたは局所電界電位記録を実行します。これは、水平ブレインスライス調製の構成を示す概略図です。刺激電極は視交叉に留まっていますが、記録ピペットは、水平脳スライス調製によって露出されたすべてのテクタル層にわたる細胞にアクセスするように配置されていることに注意してください。これは、テクタムの表層に存在するニューロンからのRGC誘発応答です。この図では、ニューロピル全体で記録された電界電位と変換された電流源密度がイメージプロットで示されています。一度習得すると、このテクニックは10分以内に完了し、通常は最大3〜4時間かかります。このビデオを見れば、テクタルニューロンの電気的特性とその接続性を定量化するために、全細胞記録のための全脳および水平脳スライスの準備を行う方法について十分に理解できるはずです。

preparations-protocols-for-whole-cell-patch-clamp-recording-xenopus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

これは、アフリカツメガエル卵母細胞からパッチクランプ記録の紹介を目的としています。それは、卵黄膜の除去、gigaohmシール（gigaseal）の形成、および外部のアウトトポロジへのパッチの任意の変換をカバーしています。...

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

BKチャネルのイオン電流をパッチクランプ技術を使用して記録されます。...

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚におけるマウトナーニューロンおよび他の細網脊髄細胞の電気的特性を研究する方法である、全細胞パッチクランプ電気生理学と呼ばれる技術を説明しています。...

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

このビデオは、フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプ技術を示しています。電極付きの薄いガラスピペットを使用して、網膜内のスターバーストアマクリン細胞(SAC)にアプローチします。シールを形成した後、吸引を加えてメンブレンを破裂させ、全細胞パッチクランプ構成を形成します。最後に、SACシナプス受容体を通るイオンの流れは、この構成を使用して測定されます。...

フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

このビデオは、全細胞パッチ電流クランプを使用して、蛍光タンパク質を発現するニューロン細胞の興奮性を研究する方法を示しています。電流クランプモードでは、ニューロンの興奮性を示す活動電位が生成されます。...

全細胞パッチクランプを用いた蛍光ニューロンの興奮性の研究

このビデオは、全細胞パッチクランプ技術を使用してニューロンの発火パターンを分析するために、脊髄切片のゼラチノーサ(SG)ニューロンで電気生理学的記録を実行する手順を示しています。この方法により、脊髄のSGニューロンの刺激に対する神経応答の研究が可能になります。...

脊髄切片のゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録

このビデオは、パッチクランプ技術を使用してレオベースと膜電位を測定し、増分電流注入に対するニューロンの応答を分析する後根神経節の感覚ニューロン興奮性の調査を示しています。...

Intact Rat背根神経節の全細胞パッチクランプ記録

私たちは、ゼブラフィッシュ胚におけるマウスナーニューロンや他の網様体細胞からパッチクランプ記録を経由して電気的活動を記録し、監視するための完全な脳脊髄準備を開発しました。従って、我々は、発生中の胚における主要ニューロンから興奮性と抑制性シナプス電流、電位依存性チャネル活性および活動電位を記録することができる。...

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

この原稿は、単一細胞レベルおよび蛍光標識された神経細胞の興奮で、ニューロンの構造的接続性を記述するために子宮内エレクトロポレーション（IUE） で使用するプロトコルを提供します。組織学は、樹状突起および軸索突起を特徴付けるために使用されます。急性スライスにおける全細胞記録は、興奮性を調査するために使用されます。...

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

本発明者らは、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を測定するために、細胞分離および全細胞パッチクランプ記録を組み合わせたプロトコルを提示する。このプロトコルは、副睾丸の生理的役割をさらに解明するために、初代副睾丸上皮細胞の機能的特性の調査を可能にする。...

精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

学ぶアフリカツメガエルの視蓋ニューロンにおけるホールセルパッチクランプ記録法。脳標本作製と電気生理学的記録により、発達過程における神経回路の接続パターンと機能を解明します。この手法は神経発生学の研究に有用です。

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セルパッチ・クランプ記録のためのプロトコル

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準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

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