準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル
2018年3月15日
アフリカツメガエル幼生の発達回路を勉強するセル全体パッチ ・ クランプ記録の 3 脳剤について述べる。それぞれの準備を独自の特定の利点は、神経回路機能を研究するモデルとしてアフリカツメガエルのオタマジャクシの実験的少ないに貢献します。
この手順の全体的な目標は、オタマジャクシ視蓋のニューロンから全細胞電気生理学的記録を取得し、発生中の接続パターンについて学び、最終的には神経回路がどのように形成および機能するかを理解することです。この方法は、ニューロンが発達の過程でどのように変化するのか、回路はどのように機能して行動を引き起こすのかなど、神経発達の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの調製物の主な利点は、視蓋ニューロンの電気生理学的記録を可能にし、発達中の神経回路の機能についての洞察を提供することです。
その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるZhenyu Luiです。廃棄移送ピペットを使用して、麻酔をかけたオタマジャクシを外部記録溶液を含む解剖記録皿に移します。麻酔をかけたオタマジャクシを、解剖記録皿の床にある水没したシリコンブロックに固定します。
脳をはっきりと見るには、滅菌済みの25ゲージの針を使用して正中線に沿って表面的な切開を行い、脳を覆っている皮膚を取り除きます。針を神経管に挿入し、床板をそのままにして管の背側部分がきれいに切断されるようにゆっくりと上に引っ張ることにより、同じ正中線軸に沿って脳を切り詰めます。脳を分離するには、まず25ゲージの針を使用して後脳を切断します。
次に、針を脳の下に尾側から吻側方向にそっと通し、すべての外側および腹側の結合組織と神経線維を切断します。次に、1本のピンを嗅球の1つに通し、もう1本のピンを後脳に通して、脳をシリコンエラストマーのブロックに固定します。これは、テクタルニューロンからの記録に最適な構成です。
次に、ピン留めされた全脳製剤が入った皿を解剖スコープから電気生理学リグに移動します。壊れたガラスピペットを使用して心室膜を取り出します。RGC軸索を直接活性化するには、バイポーラ刺激電極を視交叉にゆっくりと下げて、組織に小さなへこみが形成されるようにします。
バイポーラ刺激電極は吻側にあり、視交叉が位置する大きな中心室にほぼ隣接している必要があります。バイポーラ電極はパルス刺激装置によって駆動され、刺激の強さを正確に制御することができます。水平脳スライスを準備するには、全身の準備から始めます。
次に、かみそりの刃を使用して、1つの視蓋の片側の最も外側の4分の1を切り取ります。このカットは、吻側尾面と平行に作成されます。その後、脳をシリコンエラストマーの側面に再度固定し、スライスした面を上に向けて、体腫と神経孔に直接アクセスして記録できるようにし、脳の心室表面をシリコーンエラストマーブロックから遠ざけて、バイポーラ電極を視交叉に配置できるようにします。
次に、全細胞パッチクランプまたは局所電界電位記録を実行します。これは、水平ブレインスライス調製の構成を示す概略図です。刺激電極は視交叉に留まっていますが、記録ピペットは、水平脳スライス調製によって露出されたすべてのテクタル層にわたる細胞にアクセスするように配置されていることに注意してください。
これは、テクタムの表層に存在するニューロンからのRGC誘発応答です。この図では、ニューロピル全体で記録された電界電位と変換された電流源密度がイメージプロットで示されています。一度習得すると、このテクニックは10分以内に完了し、通常は最大3〜4時間かかります。
このビデオを見れば、テクタルニューロンの電気的特性とその接続性を定量化するために、全細胞記録のための全脳および水平脳スライスの準備を行う方法について十分に理解できるはずです。
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概要
本研究では、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）のオタマジャクシにおける視網膜視蓋路を研究するためのホールセルパッチクランプ記録法について検討します。異なる脳標本を用いることで、発生過程におけるオタマジャクシの視蓋ニューロンの結合パターンおよび神経回路の全体的な機能を理解することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 神経回路
背景
- 発生中の生物において神経回路がどのように形成され、機能するかを調査すること。
- 網膜視蓋回路は、両生類の視覚処理において極めて重要である。
- アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の幼生は、神経接続を研究するための貴重なモデルとなる。
- ホールセル記録により、ニューロン活性に関する詳細な知見が得られる。
研究目的
- 視覚中脳（ optic tectum）におけるニューロン間の接続パターンの解明。
- 発生過程を通じてニューロンがどのように変化するかを分析すること。
- 神経回路が行動にどのように寄与するかを探索すること。
使用方法
- 電気生理学的記録には、ホールセルパッチクランプ法が用いられた。
- 生物学的モデルとして、視蓋ニューロンを研究するために解剖したオタマジャクシの脳が使用された。
- マルチオミクスのワークフローについての記述はなかった。
- 具体的な手順には、オタマジャクシの固定、脳の単離、および標的部位での記録が含まれていた。
- この手法により、重要な時間枠である10分以内に記録を開始でき、通常は数時間にわたって記録を維持することが可能である。
主な結果
- これらの調製により、視蓋におけるニューロン活動の記録が正常に行われました。
- 神経接続を示す電気生理学的な変化が観察されました。
- これらの結果は、網膜視蓋回路の機能的な意義に関する議論を促しました。
- 本知見は、神経回路の発達に関する理解に寄与するものです。
結論
- 本研究は、発達段階にあるオタマジャクシの脳における神経接続を研究するための効果的な手法を提示しています。
- この研究により、発達過程における神経回路機能の理解が深まります。
- 得られた結果は、両生類の神経学的プロセスおよび行動を調査する上で、より広範な意義を持ちます。
よくある質問
業界における重要性
アフリカツメガエル（Xenopus laevis）のオタマジャクシにおけるホールセルパッチクランプ記録は、神経回路の形成と機能の高解像度解析を可能にし、発生過程におけるシナプス接続性とニューロンの興奮性に関するメカニズム的な知見を提供します。この手法は、視覚蓋における網膜神経節細胞誘発活動など、定義された刺激に対するニューロンの反応を直接測定できるため、神経科学におけるターゲット検証を支援します。本手法は、in vivo、全脳、および水平切片標本のいずれにも適応可能であり、神経発達ターゲットの前臨床段階におけるリスク低減に向けた再現性と拡張性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬および標的バリデーション
- 科学的価値：感覚入力に対する神経応答を定量化することで治療仮説の検証を可能にし、発達中の回路における機能的結合性を明らかにします。
- 運用の価値：神経活動の直接的な電気生理学的読み取りを通じて生物学的なリスク低減をサポートし、ターゲットへの関与における曖昧さを軽減します。
- 予測的価値：遺伝学的または薬理学的な摂動を、視蓋神経細胞の興奮性とシナプス統合の測定可能な変化に関連付けることで、ポートフォリオの優先順位付けを容易にします。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備： 刺激応答特性が定義された、安定かつ記録可能な神経細胞標本を構築することで、後続の化合物スクリーニングに向けた検証済み生物学的システムを準備します。
- 定量的出力： 後シナプス電流や電場電位などの電気生理学的測定値を生成し、用量反応解析および化合物による効果の定量化を可能にします。
- プラットフォームの再利用： 脳切片を水平方向に作製することで、視蓋の全層にわたる記録が可能となり、反復的な実験セッションにおけるスループットと一貫性が向上します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：回路の誤配線が関与する疾患に関連した神経発達プロセスをモデル化し、トランスレーショナルなバイオマーカー探索を支援する。
- 前臨床段階の連続性：発達の各タイムポイントにおいて神経機能の一貫した記録を可能にすることで、発見から検証までの橋渡しを行う。
- リスク調整後の意思決定：電気生理学的表現型に基づいたgo/no-go基準を支援し、神経発達プログラムにおける後期段階の失敗リスクを低減する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、リード最適化の前に神経細胞ターゲットの機能的な検証を行うことで、初期の創薬ワークフローに組み込まれ、その結果はターゲットの選定とメカニズムの解明の両方に寄与します。
- 探索生物学：網膜神経節細胞軸索刺激後の視床蓋ニューロンからの誘発反応を記録することにより、仮説検証および経路の解明を支援します。
- スクリーニング：再現性のある全脳および切片標本作製を通じてアッセイの標準化を可能にし、化合物スクリーニングのための定量的な電気生理学的リードアウトを提供します。
- 分析：電流振幅や潜時などの定量的な従属変数の測定を行い、実験条件間の比較を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ：標本間で疾患関連の回路特性を維持することで、前臨床的な妥当性へと結びつけ、バイオマーカーの整合性を支援します。
- エンタープライズ再利用：複数の実験的コンテキストに適応可能な再利用可能な電気生理学的プラットフォームを構築し、冗長な手法開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：直接的な神経細胞記録を通じてメカニズムの曖昧さを排除し、標的バリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：in vivo、全脳、およびスライス法における定義済みの調製プロトコルにより、研究室間の再現性と標準化を強化します。
- 戦略的価値：効果のない化合物を早期に検出することを可能にし、生存可能性のない標的への投資を削減することで、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：電気生理学的な結果を回路レベルの機能に関連付けることで、リスク調整後の進展決定に有用な情報を提供します。
実施上の留意点
- 一貫した脳標本の作製には、電気生理学および微小外科的解剖技術の専門知識が必要です。
- 信頼性の高い誘発反応を得るには、安定した細胞外記録溶液および機能的な刺激装置に依存します。
- データの比較可能性を確保するため、刺激パラメータおよび記録設定のチーム間での標準化が必要です。
- モデルシステム間で適用する場合、脳のサイズやアクセスしやすさに応じて、解剖およびプレートへの播種方法の調整が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、操作者の習熟度による成功率の変動や、長時間の記録セッションにおける標本の安定性が挙げられます。
