Name: 組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 学ぶ 組換えタンパク質ベイトを用いたファージディスプレイと親和性選択のプロトコル。固定化ベイト分子とのタンパク質相互作用を効率的に同定し、薬剤発見や抗体開発への応用が可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

このプロジェクトは、部分的に、NSF IOS（0849230）によって賄われていた、ハッチ、マッキンタイア·ステニス（AD421 CRIS）、USDAのシード·グラント（2011から04375）、そしてサー·フレデリック·マクマスター研究員ABDに。

<ol><li>Georgieva, Y., Konthur, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+screening+of+M13+phage+display+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Design and screening of M13 phage display cDNA libraries.</a> Molecules. 16, 1667-1681 (2011).</li>
<li>Beghetto, E., Gargano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda-display%3A+a+powerful+tool+for+antigen+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery.</a> Molecules. 16, 3089-3105 (2011).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORF+phage+display+to+identify+cellular+proteins+with+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">ORF phage display to identify cellular proteins with different functions.</a> Methods. 58, 2-9 (2012).</li>
<li>Willats, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display%3A+practicalities+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phage display: practicalities and prospects.</a> Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).</li>
<li>Konthur, Z., Crameri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+applications+of+phage+display+in+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Targets%22%5BJournal%5D)">High-throughput applications of phage display in proteomic analyses.</a> Targets. 2, 261-270 (2003).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+of+the+Arabidopsis+thaliana+protein+isoaspartyl+methyltransferase+1+identified+using+phage+display+and+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning.</a> J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).</li>
<li>Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+for+improved+protein+stability+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection for improved protein stability by phage display.</a> J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).</li>
<li>Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+LEA+proteins+and+other+hydrophilins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins.</a> Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).</li>
<li>Egli, D. B., Bruening, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source-sink+relationships%2C+seed+sucrose+levels+and+seed+growth+rates+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean.</a> Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).</li>
<li>Badotti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+the+mode+of+sucrose+utilization+by+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae.</a> Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).</li>
<li>Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Late+Embryogenesis+Abundant+%28LEA%29+Protein+Putative+Interactors+Using+Phage+Display%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).</li>
<li>Gasser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+conformational+stress+in+microbial+cells+producing+recombinant+proteins%3A+a+host+comparative+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview.</a> Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).</li>
<li>Daly, R., Hearn, M. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+heterologous+proteins+in+Pichia+pastoris%3A+a+useful+experimental+tool+in+protein+engineering+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production.</a> J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).</li>
<li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+protein+microarrays+for+the+high-throughput+identification+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions.</a> Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).</li>
<li>Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cold-shock+response+in+cultured+mammalian+cells%3A+Harnessing+the+response+for+the+improvement+of+recombinant+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production.</a> Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

3レプリケートウェルで実験を実行することにより、ベイトと結合する同じタンパク質の独立して取得されたファージは、それらが同じクローン取得されたCDS領域のヌクレオチド配列（ すなわち、差がないが、これらがされている場合であっても区別することができる独立した井戸から取得した）。それらは独立してヌクレオチド配列の一部が異なる転写領域を逆にしているそれ以外の場合、ベイトに結合する同一のタンパク質をコードするファージを区別するための唯一の方法である。 親和性選択されたファージを増幅する際に使用するための細菌のすべてを成長させる1フェルンバッハフラスコの使用は9三角フラスコを監視しようとするよりも親和性選択後の感染に至るまでの細菌増殖のはるかに少ない多忙なモニタリングを可能にします。あらかじめ温めておいた三角フラスコに、直前に感染、これらの細菌をデカントすることもアルテによるサブライブラリの力価の不一致を解消特定のフラスコに乏しい細菌の増殖による感染多重度における配給。このように、ラウンドのラウンドからのファージ力価の変化は、ウェル中に保持されたファージの数と、複製された井...

なぜファージディスプレイおよび親和性選択は、他の分子とタンパク質の相互作用を発見し、調査するための利用可能な無数の他の技術の代わりに使用？ファージディスプレイは、次のようなタンパク質-リガンド相互作用1-3を検出する他の方法に比べていくつかのユニークな利点を請求することができます。 餌分子の非常に広いレパートリー最も重要な理由は、親和性選択4に餌として作用することができる分子の多様性にある。ファージディスプレイは、ポリマー/分子が回収支持体に付着させることができる場合には本質的に、それは、ファージ表示されたタンパク質との親和性についてスクリーニングすることができる他のタンパク質、ヌクレオチド、炭水化物、 等 5と相互作用するタンパク質フラグメントを単離する非常に強力な手段である。条件をrに加えて使用される場合、ベイト分子は、6を固定化したときに生物学的活性を保持するかどうかを決定するためにアクセスすることができるその活性を除去する/引き出す親和性選択の前に餌の翻訳後修飾を導入するために、6又は有効である。 無関係な要因によるファージ耐性それはいくつかの餌がその相互作用タンパク質、またはファージ表示されたタンパク質を捕捉するために環境ストレス（熱、高浸透圧調節物質濃度が、特定の補助因子、等 。）を必要とする可能性があるということであるファージディスプレイを使用するための第二の理由は、何らかの方法で改変される必要があり得る親和性選択の前に。研究されている主な要因は、餌とタンパク質、ではないが、試験生物に致死的である場合には相互作用が発生することを可能にするか、条件の間の相互作用である。それは（T7生存率の公表サーマル最大値は〜60℃で7でEG）無傷で、生存の両方過酷な実験条件に耐えることができるので、T7ファージは、そのような研究に特に適しています。プロファージディスプレイを変化させることの一例として修復酵素のタンパク質基質のためのシロイヌナズナ種子プロテオームを調べるときteinsは、タンパク質イソアスパメチルトランスフェラーゼ（PIMT）は、これらの研究で使用されるウイルスは、導入を奨励するために、以前の各親和性選択へのラウンド、1週間、「高齢者」だったイソアスパラギン酸の認識と修復/このような異常を代謝することができる生物では不可能である影響を受けやすいタンパク質6（イソAsp）残基。 代謝的に不活性さらに、ファージは、通常、代謝毒と、少なくとも、代謝活性のある試験生物に対する多面的な効果をもたらすであろう小分子干渉に対して耐性である。ストリンジェンシー洗浄の後、毒は毒が細菌やその後のファージ複製に無害な範囲に希釈されるの​​で、細菌の大ボリュームが感染のために導入される前に削除されます。 PIMT修復のタンパク質標的を調査しながら、酵素、S-アデノシルメチオニン（AdoMetは）はで固定し、酵素を不活性化し、有用なネガティブコントロールを提供するために、S-アデノシルホモシステイン（AdoHcy）に依拠しながら、標的タンパク質の捕捉を可能にするマイクロタイタープレートウェル固定化酵素を活性化するために使用されたウイルスが悪のAdoMetやAdoHcy 6のどちらかに影響されないであろうという知識。さらに、特定の後期胚形成のメンバーは、この研究室で調査豊富（LEA）タンパク質ファミリーは、このような点で、ダイズ種子中の200mMの高濃度を得ることができるスクロース8、のような添加剤の存在下でその形状を変えることが知られている生理学的成熟度9の。ウイルスは、自律的に実行可能な試験生物10の場合ではない、特定のLEAクライアントタンパク質相互作用のための可能性に必要な各アフィニティー選択ラウンド、200 mMスクロースの添加によって影響されると予想されていません。 このラボでは、discoverinに焦点を当てている脱水11または種子を06吸収された後イソAsp形成を受けやすい記憶されたプロテオームの構成部品の修理中に記憶されたプロテオームの保護機構の根底にある、成熟した脱水もしくは発芽種子におけるgタンパク質-タンパク質相互作用。このため、生産、精製、アクティブ状態の餌として必要な組換えタンパク質の、それらが固定化される前と後しばしば困難、我々の仕事への基礎となるものですが、彼らは、そうしたままであることを確認。それぞれの組換えタンパク質生産のシナリオが異なるしかしながら、組換えタンパク質生産のための最適条件は、ここでは扱われないでしょう。ユーザは、（それが酵素である場合には、例えば 、マイクロタイタープレートウェルに酵素アッセイを行う）固定化されたタンパク質が依然として機能しているかどうかを決定するために、可能な限り試みるように付勢されている。これは、任意の発見の相互作用があることを、餌がありますので、生物学的に活性であり、いくつかの信頼性を提供しますもう少し生物学的関連性を有する可能性が高い。

<table><tbody><tr><td>トリプトン</td><td>ベクトンディキンソン株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>211705酵母エキス</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>・リサーチ・プロダクツ・インターナショナル</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>EMDケミカルズ株式会社</td><td>69064</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP359-212</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>・フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 BLT5403</td><td>EMDケミカルズ株式会社</td><td>BLT5403</td><td>遺伝子型:F-ompT hsdSB(rB - mB-)gal dcmpAR5403(AmpR)</td></tr><tr><td>アンピシリン、 ナトリウム塩</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>A40040</td><td></td></tr>エ<tr><td>チジウムブロマイドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP102-1</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>シグマアルドリッチ株式会社</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>Penta-HIS一次抗体</td><td>キアゲン(株)</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスアルカリホスファタイズコンジュゲート</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-5153</td><td></td></tr><tr><td>パラ-ニトロフェニルホスフェート</td><td>Sigma-Aldrich株式会社</td><td>N-7653</td><td></td></tr><tr><td>T7-UPプライマー</td><td>EMDケミカルズ(株)</td><td></td><td>5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN</td></tr><tr><td>プライマー</td><td>EMDケミカルズ株式会社</td><td></td><td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick</td></tr> <tr><td>PCR精製キット</td><td>Qiagen Inc.</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquickゲル抽出キット</td><td>Qiagen Inc.</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Big Dye Terminator v3.1 サイクル シーケンシング キット</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>4336917</td><td></td></tr><tr><td>Heating Block</td><td>Pierce Chemical Co. (サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック社)<td>18780</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート</td><td>Corning</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp インキュベーターオーブン</td><td>Fisher Scientific</td><td>516D</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes, 5 &#190; in</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>ChromaView Transilluminator</td><td>UVP Inc.</td><td>TS-15</td><td></td></tr><tr><td>UVシールド</td><td>オベロン</td><td>071AF</td><td></td></tr><tr><td>グローブ、ニトリル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>19-170-010C</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 1.5 ml チューブ</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ホウケイ酸ピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>13-678-25E</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸培養チューブ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-961-27</td><td></td></tr><tr><td>Uniskan I、ELISA プレートリーダー</td><td>Labsystem and Flow Laboratories、ヘルシンキ、フィンランド</td><td>Type 362</td><td></td></tr></tbody></table>

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

固定化ベイト分子に方向性クローニングされたcDNAライブラリーによってコードされる種々のタンパク質部分を提示するための足場として組換えファージを使用して、相互作用を発見するための効率的な手段である。技術は、主に、タンパク質 - タンパク質相互作用を発見するために使用されてきたが、チャレンジするベイト分子がタンパク質に限定される必要はない。ここで紹介するプロトコルは、餌の適度な数が同じタンパク質を提示​​する独立したクローンの同定を最大化するために反復してスクリーニングすることができるように最適化されている。これは、識別された相互作用するタンパク質を餌分子の合法的な相互作用因子であることを大きな自信を可能にします。各親和性選択後にファージ力価のモニタリングは、ラウンドの親和性選択はネガティブコントロールの有効性についてだけでなく、進行している方法に関する情報を提供しています。一つのファージを力価測定する手段と、どのように、どのようなこのプロセスは限り効率として進行させるために、事前に準備する可能では、提示される。独立したプラークを単離した後取り出したアンプリコンの属性は、親和性選択が進行しているどれだけ確認するために使用することができることを強調している。誤検知を最小限に抑えるか、永続的に回収したファージをバイパスするためにトラブルシューティングの技術が説明されています。ウイルス汚染を減少させる手段が議論されて燃え上がる。

（代謝的に餌を汚染）は、ファージディスプレイされたタンパク質と相互作用する餌の能力を損なうことができることは、この技術のための強力な負の制御を提供します。それは餌は、マイクロタイタープレートに結合した場合、その機能を保持しているかどうかを判断することをお勧めいたします。これらのチェックの両方がnonpoisoned餌によって回復の相互作用、ファージディスプレイされたタンパク質が正当であるという確信を増加します。 各ウェルから3三重測定をサンプリングすると、親和性選択に要する時間と作業を大幅に追加しますが、一度だけサンプリングするのではなく、各ウェル内の力価のより正確な推定値を提供します。三連のための力価のほとんどはよく一致しているが、ラウンド4中のBSAの複製2のための三連（ 表1）大きく異なることに注意してください。数回サンプリングすることにより、最終的な推定集計は、ピペッティングエラーやTをより正確に推定する感受性ではない彼の実際の力価およびこの推定値の周りの変動、ウェル間、（ 表1、図5C）が得られる。 <...

ファージディスプレイは、関心対象の固定化分子と相互作用するタンパク質又はタンパク質部分をキャプチャするための強力な技術である。作成するファージcDNAライブラリーの種類や画面の決定がなされると、ここで説明するプロトコルは、相互作用物質の同定をもたらす効率的な親和性選択を可能にする。

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

この手順の全体的な目的は、固定化されたベイト分子とのタンパク質相互作用を検出することです。まず、ベイトを調製して固定化し、次に、結合を促進する条件下で、スクリーニング対象となるファージライブラリをベイトに導入することでこれを達成します。次に、厳格な洗浄によって未結合のファージを除去します。結合したファージは、回収前に細菌に感染させるために使用されます。最終ステップとして、次回の親和性選択の反復に向けて、結合したファージを増幅させます。最終的に、ファージタイターがプラトーに達した時点で、単一のプラークを選択してシーケンシングを行い、実験的な結合条件下で、固定化されたラギングに対してどのタンパク質が最も高い親和性を持つかを示します。このプロセスは、タンパク質間相互作用における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手順は、テキストプロトコルに記載されている通り、精製したリコンビナントタンパク質をマイクロタイタープレートの底に配置することから始まります。次のステップは、テキストプロトコルに従ってあらかじめ育成した単一のコロニーを、250 mLのエルレンマイヤーフラスコに入れた100 µg/mLのアンピシリンを含む50 mLのLuria-Bertani培地に接種することです。37 °C、200 RPMの水平振盪機でインキュベートし、分光光度計を用いて細胞密度をモニタリングし、600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.5から0.6になるまで培養します。その後、細胞を50 mLのFalconチューブまたは同様の容器に移し、使用時まで4 °Cで保存します。細胞は通常、約1週間生存可能です。2日目の朝に、テキストプロトコルに従ってアフィニティー選択の準備を行います。オートクレーブ済みの空の250 milliliterエルレンマイヤーフラスコ9本を振盪インキュベーターのクランプにセットします。前夜に準備したファージ感染BLT 5 4 0 3細胞のオーバーナイト培養液から500 microlitersを、500 millilitersのlal buraniに接種します。フラスコをインキュベーターに入れた後、分光光度計の電源を入れ、600 nanometersの吸光度を測定するように設定します。その間に、4 °Cで保存していたマイクロタイタープレートを取り出し、プラスチックフィルムを剥がします。1 X tris buffered saline（TBS pH 7.5）を1ウェルあたり200 microlitersずつ用いて10回洗浄し、洗浄ごとにプレートをペーパータオルの上で逆さまに叩いて、プレート上の未結合タンパク質を除去します。1ウェルあたり200 µLのTBS調製5%ブロッキング剤を用いて、1時間ブロッキングを行う。プレートをラップで包んだ状態で、1X T-B-S-T 200 µLでブロッキング液を10回洗浄し、その際、4層のペーパータオルの上でプレートを逆さまにして叩く。洗浄の間にはペーパータオルで水分を拭き取る。ここからは、ファージの相互汚染を防ぐため、フィルター付きチップを使用してください。ファージライブラリー 100 µL をタンパク質と共にピペットで分注します。プレートをプラスチックラップで密閉し、室温で1時間インキュベートします。1時間後、プレートからプラスチックラップを取り除き、ファージをバイオハザード廃棄物容器に振り出して直ちに洗浄します。次に、マルチピペッターを使用して、各ウェルに1X TBS-Tを200 µLずつ速やかに加えます。タイマーを1分間に設定します。1分後、バッファーをバイオハザード廃棄物容器に捨て、プレートをペーパータオルの上で逆さまに叩きつけて水分を除去し、ベンチに戻します。洗浄工程を10回繰り返します。10回目の洗浄後、4°Cで保存されている50 mLファルコンチューブから200 µLのBLT 5 4 0 3細胞を分注し、最後の洗浄液を除去した9つのウェルの底にそれぞれ移します。プレートをプラスチックラップで包み、37 °Cで20分間静置します。これにより、ベイトに付着したままのファージが20分後に細菌に感染するようにします。プレートのラップを外します。次に、25 °CのBSA複製1ウェルから細菌を10 µL分取り出し、「1」と記された990 µLの培地へと移します。このウェルに対してこの工程をさらに2回繰り返し、そのウェルのファージの1〜100倍希釈液を3つのトリプリケート（3連系）で作成します。これがBSAレプリケーション1の3回のサンプリングとなります。これらの希釈液を用いて、そのBSAレプリケーションにおける平均タイターおよび平均標準誤差を推定します。BSAのレプリケーション2および3についても同様に行い、さらに毒化ベイトタンパク質の3つのレプリケートウェルおよびベイトタンパク質についても同様に操作します。これらの27本のEORチューブを脇に置いておきます。フラスコ内の細菌の光学密度（OD）が0.6〜1.0に達したら、三角フラスコから細胞液50 millilitersを、9本の250 milliliter三角フラスコそれぞれにデカンテーションで分注します。BSA replication oneウェルに残っているファージ感染BLT 5 4 0 3細菌170 µLを回収し、BSA rep.Oneと表記された50 mLの細胞懸濁液に加えます。37 °Cのインキュベーター内でフラスコを振盪させる前に、9つのウェルすべてに対してこの操作を行います。その間に、Einorチューブ1から細菌を含むLB培地100 µLを分取し、Einorチューブ内のLB培地900 µLに加えることで、最初の27段階希釈からの希釈系列を作成します。10⁻³希釈を行うため、フィルター付きチップを捨てて新しいものに交換し、チューブ4から細菌を含むLB培地を100 µL分取り、チューブ7にある900 µLのLB培地に加えます。10⁻⁴希釈についても同様に、すべてのタンパク質および処理の、すべての反復およびトリプリケートに対して希釈を継続します。細胞を溶出した後、合計で135本のチューブができるはずです。5 M 塩化ナトリウムストック溶液を 5 mL 添加して、培養液を 0.5 M 塩化ナトリウムに調整し、サンプルをラベル付き遠心ボトルに移して 4 °C、8,000 ×g で 10 分間遠心分離します。次に、ウイルスを含む上清を清潔で滅菌済みの 50 mL ファルコンチューブにデカンテーションします。ファルコンチューブ内の上清にクロロホルムを数滴加えます。上清は、3日目の次回のアフィニティセレクションまで4 °Cで保存可能です。4 °Cで保存していたVLT 5 4 0 3細胞250 µLを、あらかじめ準備した番号付きホウケイ酸ガラス試験管のそれぞれにピペットで分注します。次に、エップンドー管1の希釈液100 µLを、ホウケイ酸ガラス試験管1内の細胞250 µLにピペットで加えます。ピペットの先端5インチを火炎で短時間加熱し、溶融したトップアロスに浸します。3 mLを吸い上げ、細胞とファージが入った試験管の上に素早く加えます。片方の手でチューブを持ち、もう一方の手で指で弾くようにして混ぜ合わせ、その後、内容物をプレートに注ぎます。プレートを傾け、試験管を使って気泡や乾燥した箇所を追いやり、プレート全体が上層アガロースで覆われるようにします。ベンチの上に直立させたまま置いて冷却します。ホウケイ酸ガラス管は廃棄してください。フィルターバリアチップを排出し、新しいチップに交換して、すべての希釈系列のプレート塗布が完了するまで繰り返します。準備したプレートが使い終わるごとにインキュベーターから取り出します。ただし、一度に6枚を超えて取り出すと、プレートが冷却され、上層のアガロースが速く固まりすぎてしまうため注意してください。プレート上に形成されたプラークを確認し、コンフルエントな溶菌が見られるものは廃棄します。残りの連続希釈液のうち、正確なカウントが可能なほど十分に少ないプラークが形成されているものを決定します。これらのプレートのプラーク数を記録し、アフィニティー選択の最後にあるテキストプロトコルに従ってタイターを算出します。次に、滅菌済みの黄色ピペットチップを用いて、独立して明確に分かれているプラークコロニーを18個選択します。エイナーチューブに入れたpH 8.5のトリス塩酸塩でチップの内側を湿らせます。次に、十分に分離したプラークの中央をチップで貫通させて下のプラスチック製ペトリ皿まで押し込み、コアを吸引することで、タイタリングプレートからこれらのプラークをコアリングします。吸引したコアを適切なチューブ内の100 µLのpH 8.5トリス塩酸塩中に排出し、ボルテックスします。この溶液から20 µLを採取し、65 °Cで10分間短時間加熱した後、本文のプロトコルに従ってPCRおよびシーケンシングを行います。ここに示したのは、数回のサンプリングによる典型的なタイター結果です。最終的な推定合計値は、ピペッティングエラーの影響を受けにくく、実際のタイターおよびその変動をより正確に推定できます。アフィニティー選択の回数が増えるにつれて、非毒性ベイトにおいて優先的にファージタイターが増加しており、ウェルごとの推定値が得られています。これはまた、本手法が正常に機能しているという信頼性を示すものです。アフィニティー選択の回数が増えるにつれて、非毒性ベイトウェルにおいてインサートを含むファージの保持率が上昇していることも、高度なアフィニティー選択ラウンド後において良好な結果と言えます。第1ラウンドと比較して、インサートを持つ独立して回収されたファージの数が増加し、これらのアンプリコンがいくつかの同一サイズのバンドに集約されることは、このアフィニティー選択の手順に従って特定のクローンが選択されていることを示す良好な兆候です。ファージディスプレイによって発見された相互作用を検証するために、酵母ツーハイブリッド法などの他の手法を行うことができます。

a-protocol-for-phage-display-affinity-selection-using-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

AVEXISは、細胞認識のプロセスに関与する新規細胞外受容体 -...

低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS）

このビデオでは、標的タンパク質に対して高い親和性でタンパク質を発現する遺伝子組み換え済みファージを単離するファージディスプレイ技術を実演します。...

ファージディスプレイを用いて標的タンパク質に高い親和性を持つタンパク質を選択

この方法は、同時に、抗原の何百に対するファージディスプレイコンビナトリアル合成抗体ライブラリーから、スケーラブルで高スループットの選択を行うための視覚的な伴奏して説明する。このパラレルアプローチを使用して、我々は、標準的な免疫アッセイにおいて機能的に多様な抗原に対する高い親和性および特異性を示す抗体断片を単離した。...

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

バイオパニング細菌の表示ライブラリは、抗体に堅牢な代替ペプチド親和性試薬の発見の実績のある手法です。半自動ソーティング法を本書は誤検知の発生を減らすバイオパニングを合理化します。ここでは、思考プロセスと候補者を評価し、下流の解析を最小限に適用される技術を示しています。...

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

説明されているプロトコルは、建設、特性および DNA の任意のソースから作られた"domainome"ライブラリの (好みのターゲット) に対して選択を許可します。さまざまな技術を組み合わせた研究パイプラインにより、これ: バクテリオファージの表示、折りたたみ記者とシークエンサー データ解析のための web...

インタラクトーム Seq: Domainome ライブラリーの構築、検証およびバクテリオファージの表示と次世代シーケンシングによる選択のプロトコル

このプロトコルでは、合わせた多様性を持つ合成抗体のバクテリオファージの表示ライブラリの構築の詳細な手順について説明します。合成抗体は、病気の診断、治療に基礎研究から広範なアプリケーションを持っています。...

合成のバクテリオファージの建設は合わせた多様性と fab 抗体ライブラリーを表示

ここでは、特定の標的ペプチドをビオチン化する大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAの新規変異体を選択する方法を提示する。プロトコルは、標的ペプチドの細菌表示のためのプラスミドの構築、BirAライブラリーの生成、BirA変異体の選択および特徴付けについて説明する。...

新規ビオチニル化酵素の選択のための細菌ペプチド表示

任意の与えられた低分子リガンドに対して所望の親和性および特異性を有する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを作成することは、多くの生物学的センシングおよび作動アプリケーションを有するであろう。ここでは、ファージディスプレイコンビナトリアル単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的選択を介した化学的に誘導された二量体化システムのde...

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

本研究は、薬物とペプチドの相互作用を同定するための戦略を提示することを目的とした。この戦略は、水晶結晶マイクロバランス(QCM)バイオセンサーに基づく薬物認識短いペプチドのバイオパンニングを含み、続いてタンパク質上の薬物認識および薬物結合部位の注釈のために得られた情報を定量的に評価するためのバイオインフォマティクス分析を行う。...

バイオセンサーベースの高スループットバイオパンニングおよびバイオインフォマティクス分析戦略による、薬物-タンパク質相互作用のグローバル検証

この記事では、アルカリホスファターゼ結合ScFv D11抗体を使用した免疫蛍光法による組織内のイソレブグランジンの測定のための詳細な方法論を提供します。マウスとヒトの両方の高血圧モデルは、組織サンプル中のイソレブグランジン測定に関連する段階的な手順と基本原理を説明するために使用されます。...

D11 scFv-アルカリホスファターゼ融合タンパク質と免疫蛍光を用いた組織中のイソレブグランジンの直接検出(英語)

ユビキチン化は翻訳後修飾の重要なタンパク質であり、その中で多くのヒト疾患に関与している調節不全である。このプロトコルは、ファージディスプレイを使用して、ユビキチン化の特異性、効率、パターンを制御するE3リガスの活性を結合および調節できる新しいユビキチン変異体を分離する方法を詳述する。...

ファージディスプレイを使用してE3リガーゼ用ユビキチンバリアント変性変性器を開発する

学ぶ 組換えタンパク質ベイトを用いたファージディスプレイと親和性選択のプロトコル。固定化ベイト分子とのタンパク質相互作用を効率的に同定し、薬剤発見や抗体開発への応用が可能です。

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

さらに動画を探す