組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

この手順の全体的な目的は、固定化されたベイト分子とのタンパク質相互作用を検出することです。まず、ベイトを調製して固定化し、次に、結合を促進する条件下で、スクリーニング対象となるファージライブラリをベイトに導入することでこれを達成します。

次に、厳格な洗浄によって未結合のファージを除去します。結合したファージは、回収前に細菌に感染させるために使用されます。最終ステップとして、次回の親和性選択の反復に向けて、結合したファージを増幅させます。

最終的に、ファージタイターがプラトーに達した時点で、単一のプラークを選択してシーケンシングを行い、実験的な結合条件下で、固定化されたラギングに対してどのタンパク質が最も高い親和性を持つかを示します。このプロセスは、タンパク質間相互作用における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手順は、テキストプロトコルに記載されている通り、精製したリコンビナントタンパク質をマイクロタイタープレートの底に配置することから始まります。

次のステップは、テキストプロトコルに従ってあらかじめ育成した単一のコロニーを、250 mLのエルレンマイヤーフラスコに入れた100 µg/mLのアンピシリンを含む50 mLのLuria-Bertani培地に接種することです。37 °C、200 RPMの水平振盪機でインキュベートし、分光光度計を用いて細胞密度をモニタリングし、600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.5から0.6になるまで培養します。その後、細胞を50 mLのFalconチューブまたは同様の容器に移し、使用時まで4 °Cで保存します。細胞は通常、約1週間生存可能です。2日目の朝に、テキストプロトコルに従ってアフィニティー選択の準備を行います。

オートクレーブ済みの空の250 milliliterエルレンマイヤーフラスコ9本を振盪インキュベーターのクランプにセットします。前夜に準備したファージ感染BLT 5 4 0 3細胞のオーバーナイト培養液から500 microlitersを、500 millilitersのlal buraniに接種します。フラスコをインキュベーターに入れた後、分光光度計の電源を入れ、600 nanometersの吸光度を測定するように設定します。その間に、4 °Cで保存していたマイクロタイタープレートを取り出し、プラスチックフィルムを剥がします。1 X tris buffered saline（TBS pH 7.5）を1ウェルあたり200 microlitersずつ用いて10回洗浄し、洗浄ごとにプレートをペーパータオルの上で逆さまに叩いて、プレート上の未結合タンパク質を除去します。

1ウェルあたり200 µLのTBS調製5%ブロッキング剤を用いて、1時間ブロッキングを行う。プレートをラップで包んだ状態で、1X T-B-S-T 200 µLでブロッキング液を10回洗浄し、その際、4層のペーパータオルの上でプレートを逆さまにして叩く。洗浄の間にはペーパータオルで水分を拭き取る。

ここからは、ファージの相互汚染を防ぐため、フィルター付きチップを使用してください。ファージライブラリー 100 µL をタンパク質と共にピペットで分注します。プレートをプラスチックラップで密閉し、室温で1時間インキュベートします。

1時間後、プレートからプラスチックラップを取り除き、ファージをバイオハザード廃棄物容器に振り出して直ちに洗浄します。次に、マルチピペッターを使用して、各ウェルに1X TBS-Tを200 µLずつ速やかに加えます。タイマーを1分間に設定します。

1分後、バッファーをバイオハザード廃棄物容器に捨て、プレートをペーパータオルの上で逆さまに叩きつけて水分を除去し、ベンチに戻します。洗浄工程を10回繰り返します。10回目の洗浄後、4°Cで保存されている50 mLファルコンチューブから200 µLのBLT 5 4 0 3細胞を分注し、最後の洗浄液を除去した9つのウェルの底にそれぞれ移します。

プレートをプラスチックラップで包み、37 °Cで20分間静置します。これにより、ベイトに付着したままのファージが20分後に細菌に感染するようにします。プレートのラップを外します。次に、25 °CのBSA複製1ウェルから細菌を10 µL分取り出し、「1」と記された990 µLの培地へと移します。

このウェルに対してこの工程をさらに2回繰り返し、そのウェルのファージの1〜100倍希釈液を3つのトリプリケート（3連系）で作成します。これがBSAレプリケーション1の3回のサンプリングとなります。これらの希釈液を用いて、そのBSAレプリケーションにおける平均タイターおよび平均標準誤差を推定します。BSAのレプリケーション2および3についても同様に行い、さらに毒化ベイトタンパク質の3つのレプリケートウェルおよびベイトタンパク質についても同様に操作します。これらの27本のEORチューブを脇に置いておきます。フラスコ内の細菌の光学密度（OD）が0.6〜1.0に達したら、三角フラスコから細胞液50 millilitersを、9本の250 milliliter三角フラスコそれぞれにデカンテーションで分注します。

BSA replication oneウェルに残っているファージ感染BLT 5 4 0 3細菌170 µLを回収し、BSA rep.Oneと表記された50 mLの細胞懸濁液に加えます。37 °Cのインキュベーター内でフラスコを振盪させる前に、9つのウェルすべてに対してこの操作を行います。その間に、Einorチューブ1から細菌を含むLB培地100 µLを分取し、Einorチューブ内のLB培地900 µLに加えることで、最初の27段階希釈からの希釈系列を作成します。

10⁻³希釈を行うため、フィルター付きチップを捨てて新しいものに交換し、チューブ4から細菌を含むLB培地を100 µL分取り、チューブ7にある900 µLのLB培地に加えます。10⁻⁴希釈についても同様に、すべてのタンパク質および処理の、すべての反復およびトリプリケートに対して希釈を継続します。細胞を溶出した後、合計で135本のチューブができるはずです。

5 M 塩化ナトリウムストック溶液を 5 mL 添加して、培養液を 0.5 M 塩化ナトリウムに調整し、サンプルをラベル付き遠心ボトルに移して 4 °C、8,000 ×g で 10 分間遠心分離します。次に、ウイルスを含む上清を清潔で滅菌済みの 50 mL ファルコンチューブにデカンテーションします。ファルコンチューブ内の上清にクロロホルムを数滴加えます。

上清は、3日目の次回のアフィニティセレクションまで4 °Cで保存可能です。4 °Cで保存していたVLT 5 4 0 3細胞250 µLを、あらかじめ準備した番号付きホウケイ酸ガラス試験管のそれぞれにピペットで分注します。次に、エップンドー管1の希釈液100 µLを、ホウケイ酸ガラス試験管1内の細胞250 µLにピペットで加えます。ピペットの先端5インチを火炎で短時間加熱し、溶融したトップアロスに浸します。

3 mLを吸い上げ、細胞とファージが入った試験管の上に素早く加えます。片方の手でチューブを持ち、もう一方の手で指で弾くようにして混ぜ合わせ、その後、内容物をプレートに注ぎます。プレートを傾け、試験管を使って気泡や乾燥した箇所を追いやり、プレート全体が上層アガロースで覆われるようにします。

ベンチの上に直立させたまま置いて冷却します。ホウケイ酸ガラス管は廃棄してください。フィルターバリアチップを排出し、新しいチップに交換して、すべての希釈系列のプレート塗布が完了するまで繰り返します。

準備したプレートが使い終わるごとにインキュベーターから取り出します。ただし、一度に6枚を超えて取り出すと、プレートが冷却され、上層のアガロースが速く固まりすぎてしまうため注意してください。プレート上に形成されたプラークを確認し、コンフルエントな溶菌が見られるものは廃棄します。残りの連続希釈液のうち、正確なカウントが可能なほど十分に少ないプラークが形成されているものを決定します。これらのプレートのプラーク数を記録し、アフィニティー選択の最後にあるテキストプロトコルに従ってタイターを算出します。次に、滅菌済みの黄色ピペットチップを用いて、独立して明確に分かれているプラークコロニーを18個選択します。

エイナーチューブに入れたpH 8.5のトリス塩酸塩でチップの内側を湿らせます。次に、十分に分離したプラークの中央をチップで貫通させて下のプラスチック製ペトリ皿まで押し込み、コアを吸引することで、タイタリングプレートからこれらのプラークをコアリングします。吸引したコアを適切なチューブ内の100 µLのpH 8.5トリス塩酸塩中に排出し、ボルテックスします。この溶液から20 µLを採取し、65 °Cで10分間短時間加熱した後、本文のプロトコルに従ってPCRおよびシーケンシングを行います。ここに示したのは、数回のサンプリングによる典型的なタイター結果です。最終的な推定合計値は、ピペッティングエラーの影響を受けにくく、実際のタイターおよびその変動をより正確に推定できます。

アフィニティー選択の回数が増えるにつれて、非毒性ベイトにおいて優先的にファージタイターが増加しており、ウェルごとの推定値が得られています。これはまた、本手法が正常に機能しているという信頼性を示すものです。アフィニティー選択の回数が増えるにつれて、非毒性ベイトウェルにおいてインサートを含むファージの保持率が上昇していることも、高度なアフィニティー選択ラウンド後において良好な結果と言えます。

第1ラウンドと比較して、インサートを持つ独立して回収されたファージの数が増加し、これらのアンプリコンがいくつかの同一サイズのバンドに集約されることは、このアフィニティー選択の手順に従って特定のクローンが選択されていることを示す良好な兆候です。ファージディスプレイによって発見された相互作用を検証するために、酵母ツーハイブリッド法などの他の手法を行うことができます。