組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル
February 16th, 2014
ファージディスプレイは、関心対象の固定化分子と相互作用するタンパク質又はタンパク質部分をキャプチャするための強力な技術である。作成するファージcDNAライブラリーの種類や画面の決定がなされると、ここで説明するプロトコルは、相互作用物質の同定をもたらす効率的な親和性選択を可能にする。
この手順の全体的な目標は、固定化されたベイト分子とのタンパク質相互作用を発見することです。これは、最初に餌を取得して固定することによって達成されます。第2のステップは、結合を促進する条件下で、スクリーニングするファージライブラリーを餌に導入することです。
次に、結合していないファージを厳格な洗浄によって除去します。一方、結合したファージは、回収される前に細菌に感染するために使用されます。最後のステップは、アフィニティー選択の次の反復のために結合したファージを増幅することです。
最終的に、ファージ力価がプラトーになると、単一のプラークが選択され、配列決定されて、実験結合条件下で固定化された遅延に対してどのタンパク質が最も高い親和性を持つかが示される。このプロセスは、タンパク質タンパク質の相互作用における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、精製された組換えタンパク質をマイクロタイタープレートの底に配置することから始まります。
次のステップは、テキストプロトコルに記載されているように以前に成長した単一のコロニーを持つ250ミリリットルの三角フラスコに100マイクログラムのアンピシリンを含む50ミリリットルのLuria burani培地を接種し、水平シェーカーで摂氏37度、200RPMでインキュベートし、0.5〜0.6の600ナノメートルの光学密度が得られるまで分光光度計を使用して細胞密度を監視することです。次に、細胞を50ミリリットルのファルコンチューブなどに注ぎ、使用細胞が通常初日から約1週間生存可能になるまで摂氏4度に保ちます。2日目の朝のテキストプロトコルで説明されているアフィニティ選択の準備
をします。インキュベートシェーカーのクランプに9つのオートクレーブ空の250ミリリットルの三角フラスコを置き、500ミリリットルのlal buraniに500マイクロリットルを接種し、ファージ感染BLT 5 4 0 3細胞の一晩培養物の1つから500マイクロリットルをインキュベーターに入れた後、インキュベーターにフラスコを配置した後、分光光度計をオンにし、600ナノメートルで吸光度を読み取るように設定します。その間に、マイクロタイタープレートを摂氏4度から取り外し、プラスチックフィルムをはがします。X tris緩衝生理食塩水またはTBS pH 7.5のウェルあたり200マイクロリットルで10回洗浄し、洗浄の合間にプレートをペーパータオルの上に逆さまに叩きつけて、プレートから未結合のタンパク質を取り除きます。
TBS中の5%ブロッキング試薬をウェルあたり200マイクロリットルで1時間ブロックします。プレートをラップで包んだ状態で、200マイクロリットルのX-T-B-S-Tを4層の紙に逆さまに叩きつけてブロッキング溶液を10回洗い流します。洗濯の間にタオル。
ここからは、フィルターバリアチップを使用して、ファージの交差汚染を回避します。100マイクロリットルのファージライブラリーをタンパク質と一緒にピペットでつなぎます。プレートをラップで再密封し、室温で1時間インキュベートします。
1時間が経過したら、プレートからラップをはがし、すぐにファージを振り落としてバイオハザード廃棄物に洗い流します。次に、マルチピペッターを使用して、それぞれに1つのX-T-B-S-Tを200マイクロリットルすばやく追加します。タイマーを1分間にしっかりとセットします。
1分後、バッファーをバイオハザード廃棄物に振り落とし、プレートを逆さまにしてペーパータオルで叩き、ベンチに戻します。10回目の洗濯後、洗濯手順を10回繰り返します。摂氏4度の50ミリリットルのファルコンチューブから200マイクロリットルのBLT 5 4 0 3細胞を取り出し、最後の洗浄が除去された9つのウェルのそれぞれの底に移します。
プレートをラップで包み、摂氏37度で20分間置くと、20分後には餌に付着したままのファージがバクテリアに感染します。プレートを開梱します。次に、摂氏25度の複製1ウェルでBSAから10マイクロリットルの細菌を除去し、1つのマークされた培地の990マイクロリットルに移します。
このプロセスをその井戸に対してさらに2回繰り返し、その結果、その井戸からのファージの1〜100 diluの3回のトリプリケートが得られ、これがBSAレプリケーションの1つで、1つは3回サンプリングされます。これらの希釈は、平均力価を推定するために使用されます 平均 力価 プラスマイナス BSA の複製 BSA の複製 2 と 3 に対して同じことを行い、毒された餌タンパク質の 3 つの複製されたウェルの BSA と、これらの 27 の EOR チューブを脇に置きます。フラスコ内の細菌が光学密度が0.6〜1.0デカントの場合、シダフラスコからの細胞の50ミリリットルを9 250ミリリットルの三角フラスコのそれぞれに
注入します。BSA複製1ウェルの残りの170マイクロリットルのファージ感染BLT 5 4 0 3細菌を取り、BSArepとマークされた細胞の50ミリリットルに追加します。1。これを9つのウェルすべてで行い、その後、摂氏37度のインキュベーターでフラスコを振ってください。その間、Einor tube oneから細菌を含むLBの100マイクロリットルを取り出し、それをeinorチューブ内のLBの900マイクロリットルに加えて、最初の27希釈から希釈します。
マイナス3の希釈に10のための4は、新しいもののためのフィルターバリアチップを捨てて、einorチューブ4から細菌とLBの100マイクロリットルを取得し、それをEPHチューブのLBの900マイクロリットルに追加します。7〜10のマイナス4分の1希釈は、すべてのタンパク質と処理のすべての複製のすべてのトリプリケートに対して希釈を続けます。細胞が嘘をついたら、合計135本のチューブがあるはずです。
5モル塩化ナトリウムストックから5ミリリットルを添加し、サンプルを標識された遠心分離瓶に移送することにより、培養物を0.5モル塩化ナトリウムに持って行きます 8, 000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離機。次に、ウイルスを含む上清を清潔で滅菌済みの50ミリリットルのファルコンチューブにデカントします。Falconチューブのデカントされた上清にクロロホルムを数滴加えます。
上清は、3日目の次の親和性選択ラウンドのために摂氏4度で保存でき、摂氏4度からVLT 5 4 0 3細胞の250マイクロリットルを、事前に準備された番号付きのケイ酸ホウ酸塩試験管のそれぞれにピペットで注入します。次に、エイノールチューブ1の希釈から100マイクロリットルを、ケイ酸試験管内の細胞の250マイクロリットルにピペットで移します。1。ピペットの最初の5インチを炎の上で短時間加熱し、溶融したトップアロスに突
っ込みます。3ミリリットルを引き上げ、細胞とファージの上にある試験管に素早く送達します。もう片方の手でチューブを持ちながら指でフリックして混ぜ合わせ、内容物を皿に注ぎます。プレートを傾け、試験管を使用して、プレート全体が上部のアグロで覆われるまで、気泡とドライスポットを追いかけます。
ベンチに直立させて冷まします。ホウケイ酸チューブを廃棄します。フィルターバリアチップを取り出して新しいチップを入手し、すべての希釈がメッキされるまで続けます。
準備したプレートが枯渇したら、インキュベーターから取り出しますが、一度に6つ以下にしないと、冷却されて上部アグロスが急速に固まりすぎます。プレート上に形成されたプラークを検査し、コンフルエントな溶解のあるプレートを廃棄します。残りの段階希釈液のうち、正確なCaliを可能にするのに十分な数のプラークを生成したものを決定し、これらのプレートからのプラークの数を記録し、アフィニティー選択の最後にあるテキストプロトコルに記載されているように力価の計算に進みます。ラウンド4では、滅菌済みの黄色のピペットチップを使用して、18個の明確に定義されたプラークコロニーを選択します。
先端の内側をアイノールチューブ内の塩酸トリスpH8.5で濡らします。次に、先端を十分に分離されたプラークを介して下のプラスチックペトリ皿に直接押し込み、コアを吸引することにより、滴定プレートからこれらのプラークをコアにし、ボルテックスする前に適切なチューブ内の塩酸トリスpH8.5の100マイクロリットルにコアを排出します。簡単に言えば、このボリュームから20マイクロリットルを65°Cで10分間加熱し、ここに示すテキストプロトコルに記載されているようにPCRおよびシーケンシングを進めると、いくつかのサンプリングによる典型的な力価の結果であり、最終的な推定集計はピペッティングエラーの影響を受けにくく、実際の力価およびこれを取り巻く変動のより正確な推定値である。
アフィニティー選択ラウンドの数が増えるにつれて、非毒餌に対して優先的にファージ力価が増加すると、よく見積もることができます。また、この手法が機能しているという確信も得られます。アフィニティ選択の数が増えるにつれて、非毒餌ウェルにインサートを含むファージの割合が増加することも、アフィニティ選択の高度なラウンド後に縁起が良いです。
第1ラウンドと比較してインサートを有する独立して回収されたファージの数の増加、およびこれらのアンプリコンがいくつかの同じサイズのバンドに沈降することは、この手順に従って特定のクローンがアフィニティー選択で選択されていることを示す良い指標である。ease two hybridのような他の方法は、ファージディスプレイによって発見された相互作用を検証するために実行できます。
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概要
この記事では、固定化されたベイト分子とのタンパク質相互作用を同定するために使用されるファージディスプレイ技術について説明します。このプロトコルにより、効率的なアフィニティ選択と相互作用の同定が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- タンパク質相互作用
- ファージディスプレイ技術
- アフィニティ選択
背景
- ファージディスプレイはタンパク質相互作用を研究するための方法です。
- cDNAライブラリーの使用が含まれます。
- 固定化されたベイト分子がプロセスに不可欠です。
- この技術により、特定の相互作用体の同定が可能になります。
研究の目的
- 固定化されたベイト分子とのタンパク質相互作用を発見すること。
- ファージディスプレイの詳細なプロトコルを提供すること。
- アフィニティ選択の効率を向上させること。
使用された方法
- ベイト分子の取得と固定化。
- ベイトへのファージライブラリーの導入。
- 未結合のファージを除去するための厳密な洗浄。
- 結合したファージによる細菌への感染による回収。
主要な結果
- タンパク質相互作用の成功した同定。
- 結合したファージの効率的な増幅。
- プロトコルの有効性の実証。
- 様々な生物学的研究への潜在的な応用。
結論
- ファージディスプレイはタンパク質相互作用を研究するための価値あるツールです。
- 説明されたプロトコルは同定プロセスを向上させます。
- さらなる研究により、生物学におけるその応用を拡大することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Phage display enables high-confidence identification of protein-protein interactions through iterative affinity selection and titer monitoring, supporting target validation in early discovery. By requiring independent clone recovery and amplicon consistency, the method reduces false positives and increases predictive confidence in bait interactors. This workflow informs lead identification by prioritizing targets with reproducible binding evidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying proteins that consistently bind immobilized bait under stringent conditions.
- Operational Value: Supports biological de-risking through replicate screening and titer progression tracking to distinguish specific from nonspecific binding.
- Predictive Value: Increasing phage titer and insert retention across rounds provide quantitative evidence for target engagement strength and specificity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated phage libraries for downstream screening by enriching for high-affinity binders through controlled washing and amplification steps.
- Reproducibility: Monitoring phage titer after each selection round provides a quantifiable metric to assess selection efficacy and control consistency across replicates.
- Scalability: The protocol accommodates multiple baits in parallel using microtiter plates, enabling medium-throughput interaction profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Confirmed interactors from phage display can be forwarded to orthogonal validation (e.g., co-IP, yeast two-hybrid) to support preclinical target assessment.
- Mechanistic De-risking: Isolation of independent plaques and sequencing of amplicons helps confirm that observed binding reflects specific protein-protein interactions rather than artifacts.
- Risk-Adjusted Advancement: The settling of amplicons on identically sized bands after multiple rounds signals clonal enrichment, supporting go/no-go decisions in target prioritization.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead identification, providing biochemical evidence to inform downstream validation efforts.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about protein interactions by selecting for phage encoding proteins that bind bait under defined conditions.
- Screening: Generates enriched phage pools suitable for further characterization through iterative binding and amplification.
- Analytics: Titer measurements and amplicon analysis enable quantitative assessment of selection progress and clone enrichment.
- Translational Research: Identified interactors serve as candidates for functional validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: The standardized workflow can be applied across multiple baits and targets, supporting platform reuse in interaction discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by requiring reproducible recovery of independent clones presenting the same protein.
- Operational Value: Employs standardized washing, blocking, and infection steps to minimize variability and cross-contamination.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by filtering out nonspecific binders early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of targets based on binding consistency and enrichment metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology techniques including phage handling, bacterial culture, and nucleic acid manipulation.
- Depends on access to incubators, shakers, spectrophotometers, and centrifugation equipment for titer determination.
- Necessitates standardized reagent preparation (e.g., TBS, blocking agents) and strict adherence to washing protocols to control background.
- Involves adaptation considerations when using non-protein baits, as blocking and washing conditions may require optimization.
- Practical limitations include the time required for multiple affinity selection rounds and the need for careful plaque picking to avoid confluent lysis.
