組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

この手順の全体的な目標は、固定化されたベイト分子とのタンパク質相互作用を発見することです。これは、最初に餌を取得して固定することによって達成されます。第2のステップは、結合を促進する条件下で、スクリーニングするファージライブラリーを餌に導入することです。

次に、結合していないファージを厳格な洗浄によって除去します。一方、結合したファージは、回収される前に細菌に感染するために使用されます。最後のステップは、アフィニティー選択の次の反復のために結合したファージを増幅することです。

最終的に、ファージ力価がプラトーになると、単一のプラークが選択され、配列決定されて、実験結合条件下で固定化された遅延に対してどのタンパク質が最も高い親和性を持つかが示される。このプロセスは、タンパク質タンパク質の相互作用における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、精製された組換えタンパク質をマイクロタイタープレートの底に配置することから始まります。

次のステップは、テキストプロトコルに記載されているように以前に成長した単一のコロニーを持つ250ミリリットルの三角フラスコに100マイクログラムのアンピシリンを含む50ミリリットルのLuria burani培地を接種し、水平シェーカーで摂氏37度、200RPMでインキュベートし、0.5〜0.6の600ナノメートルの光学密度が得られるまで分光光度計を使用して細胞密度を監視することです。次に、細胞を50ミリリットルのファルコンチューブなどに注ぎ、使用細胞が通常初日から約1週間生存可能になるまで摂氏4度に保ちます。2日目の朝のテキストプロトコルで説明されているアフィニティ選択の準備

インキュベートシェーカーのクランプに9つのオートクレーブ空の250ミリリットルの三角フラスコを置き、500ミリリットルのlal buraniに500マイクロリットルを接種し、ファージ感染BLT 5 4 0 3細胞の一晩培養物の1つから500マイクロリットルをインキュベーターに入れた後、インキュベーターにフラスコを配置した後、分光光度計をオンにし、600ナノメートルで吸光度を読み取るように設定します。その間に、マイクロタイタープレートを摂氏4度から取り外し、プラスチックフィルムをはがします。X tris緩衝生理食塩水またはTBS pH 7.5のウェルあたり200マイクロリットルで10回洗浄し、洗浄の合間にプレートをペーパータオルの上に逆さまに叩きつけて、プレートから未結合のタンパク質を取り除きます。

TBS中の5%ブロッキング試薬をウェルあたり200マイクロリットルで1時間ブロックします。プレートをラップで包んだ状態で、200マイクロリットルのX-T-B-S-Tを4層の紙に逆さまに叩きつけてブロッキング溶液を10回洗い流します。洗濯の間にタオル。

ここからは、フィルターバリアチップを使用して、ファージの交差汚染を回避します。100マイクロリットルのファージライブラリーをタンパク質と一緒にピペットでつなぎます。プレートをラップで再密封し、室温で1時間インキュベートします。

1時間が経過したら、プレートからラップをはがし、すぐにファージを振り落としてバイオハザード廃棄物に洗い流します。次に、マルチピペッターを使用して、それぞれに1つのX-T-B-S-Tを200マイクロリットルすばやく追加します。タイマーを1分間にしっかりとセットします。

1分後、バッファーをバイオハザード廃棄物に振り落とし、プレートを逆さまにしてペーパータオルで叩き、ベンチに戻します。10回目の洗濯後、洗濯手順を10回繰り返します。摂氏4度の50ミリリットルのファルコンチューブから200マイクロリットルのBLT 5 4 0 3細胞を取り出し、最後の洗浄が除去された9つのウェルのそれぞれの底に移します。

プレートをラップで包み、摂氏37度で20分間置くと、20分後には餌に付着したままのファージがバクテリアに感染します。プレートを開梱します。次に、摂氏25度の複製1ウェルでBSAから10マイクロリットルの細菌を除去し、1つのマークされた培地の990マイクロリットルに移します。

このプロセスをその井戸に対してさらに2回繰り返し、その結果、その井戸からのファージの1〜100 diluの3回のトリプリケートが得られ、これがBSAレプリケーションの1つで、1つは3回サンプリングされます。これらの希釈は、平均力価を推定するために使用されます 平均 力価 プラスマイナス BSA の複製 BSA の複製 2 と 3 に対して同じことを行い、毒された餌タンパク質の 3 つの複製されたウェルの BSA と、これらの 27 の EOR チューブを脇に置きます。フラスコ内の細菌が光学密度が0.6〜1.0デカントの場合、シダフラスコからの細胞の50ミリリットルを9 250ミリリットルの三角フラスコのそれぞれに

BSA複製1ウェルの残りの170マイクロリットルのファージ感染BLT 5 4 0 3細菌を取り、BSArepとマークされた細胞の50ミリリットルに追加します。1。これを9つのウェルすべてで行い、その後、摂氏37度のインキュベーターでフラスコを振ってください。その間、Einor tube oneから細菌を含むLBの100マイクロリットルを取り出し、それをeinorチューブ内のLBの900マイクロリットルに加えて、最初の27希釈から希釈します。

マイナス3の希釈に10のための4は、新しいもののためのフィルターバリアチップを捨てて、einorチューブ4から細菌とLBの100マイクロリットルを取得し、それをEPHチューブのLBの900マイクロリットルに追加します。7〜10のマイナス4分の1希釈は、すべてのタンパク質と処理のすべての複製のすべてのトリプリケートに対して希釈を続けます。細胞が嘘をついたら、合計135本のチューブがあるはずです。

5モル塩化ナトリウムストックから5ミリリットルを添加し、サンプルを標識された遠心分離瓶に移送することにより、培養物を0.5モル塩化ナトリウムに持って行きます 8, 000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離機。次に、ウイルスを含む上清を清潔で滅菌済みの50ミリリットルのファルコンチューブにデカントします。Falconチューブのデカントされた上清にクロロホルムを数滴加えます。

上清は、3日目の次の親和性選択ラウンドのために摂氏4度で保存でき、摂氏4度からVLT 5 4 0 3細胞の250マイクロリットルを、事前に準備された番号付きのケイ酸ホウ酸塩試験管のそれぞれにピペットで注入します。次に、エイノールチューブ1の希釈から100マイクロリットルを、ケイ酸試験管内の細胞の250マイクロリットルにピペットで移します。1。ピペットの最初の5インチを炎の上で短時間加熱し、溶融したトップアロスに突

3ミリリットルを引き上げ、細胞とファージの上にある試験管に素早く送達します。もう片方の手でチューブを持ちながら指でフリックして混ぜ合わせ、内容物を皿に注ぎます。プレートを傾け、試験管を使用して、プレート全体が上部のアグロで覆われるまで、気泡とドライスポットを追いかけます。

ベンチに直立させて冷まします。ホウケイ酸チューブを廃棄します。フィルターバリアチップを取り出して新しいチップを入手し、すべての希釈がメッキされるまで続けます。

準備したプレートが枯渇したら、インキュベーターから取り出しますが、一度に6つ以下にしないと、冷却されて上部アグロスが急速に固まりすぎます。プレート上に形成されたプラークを検査し、コンフルエントな溶解のあるプレートを廃棄します。残りの段階希釈液のうち、正確なCaliを可能にするのに十分な数のプラークを生成したものを決定し、これらのプレートからのプラークの数を記録し、アフィニティー選択の最後にあるテキストプロトコルに記載されているように力価の計算に進みます。ラウンド4では、滅菌済みの黄色のピペットチップを使用して、18個の明確に定義されたプラークコロニーを選択します。

先端の内側をアイノールチューブ内の塩酸トリスpH8.5で濡らします。次に、先端を十分に分離されたプラークを介して下のプラスチックペトリ皿に直接押し込み、コアを吸引することにより、滴定プレートからこれらのプラークをコアにし、ボルテックスする前に適切なチューブ内の塩酸トリスpH8.5の100マイクロリットルにコアを排出します。簡単に言えば、このボリュームから20マイクロリットルを65°Cで10分間加熱し、ここに示すテキストプロトコルに記載されているようにPCRおよびシーケンシングを進めると、いくつかのサンプリングによる典型的な力価の結果であり、最終的な推定集計はピペッティングエラーの影響を受けにくく、実際の力価およびこれを取り巻く変動のより正確な推定値である。

アフィニティー選択ラウンドの数が増えるにつれて、非毒餌に対して優先的にファージ力価が増加すると、よく見積もることができます。また、この手法が機能しているという確信も得られます。アフィニティ選択の数が増えるにつれて、非毒餌ウェルにインサートを含むファージの割合が増加することも、アフィニティ選択の高度なラウンド後に縁起が良いです。

第1ラウンドと比較してインサートを有する独立して回収されたファージの数の増加、およびこれらのアンプリコンがいくつかの同じサイズのバンドに沈降することは、この手順に従って特定のクローンがアフィニティー選択で選択されていることを示す良い指標である。ease two hybridのような他の方法は、ファージディスプレイによって発見された相互作用を検証するために実行できます。