Stentor coeruleusにおける単一細胞創傷治癒中の細胞質の流れの可視化

この手順の全体的な目標は、単一細胞の創傷治癒中の細胞質の流れを測定することです。これは、まず、細胞創傷のモデルシステムとして使用するために、生きたステントまたはSEIU細胞を採取することによって達成されます。2番目のステップは、細胞を切断するためのガラスツールを準備することです。

次に、ステントサリウス細胞をカスタマイズされた顕微鏡セットアップで切り開き、低倍率手術と高解像度イメージングを同時に行うことができます。最後のステップは、粒子画像速度対称性ソフトウェアを使用して細胞質の流れの計算解析を実行することです。最終的には、細胞質の高解像度イメージングを使用して、創傷治癒中の細胞の活性応答を示します。

この方法は、周囲の培地への漏れを防ぐために、細胞質が切り傷の領域の周りでゲル状になるかどうかなど、細胞の創傷治癒に関する重要な問題に対処するために使用できます。この方法は、セルハンドリングツールの準備と切断手順が手先の器用さを必要とするため習得が難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。歯石に記載されている天然の橋から、または商業供給者からステントまたはシリウス細胞を取得し始めるには、歯石によるレシピから適合した300ミリリットルの改変ステントまたは培地を追加し、添付のテキストプロトコルに記載されているように抑止します。

20°Cの暗闇で培養物を育てて維持します。次に、クラミドモナスラインハーディ藻類の培養物をトリスアセテートリン酸培地で育てます。給餌前に標準的な培養方法を使用して、クラミドモナス細胞を穏やかに回転させ、上清を取り除き、改変したステントまたは培地に懸濁して洗浄します。

必要に応じて、300ミリリットルのステントまたはサリウス培養物に約3,000万chmの細胞を週に2〜3回供給します。手術のためにステントまたは細胞を収集します。まず、細胞が剥離して自由に泳ぎ始めるまで、ピペットチップから空気を泡立てて培養物を穏やかに攪拌します。

次に、細胞のせん断を避けるために、幅の広いボアチップを備えた1ミリリットルのピペットを使用して遊泳細胞を捕捉します。収集したら、細胞が落ち着くのを待ちます。次に、その上のメディアをゆっくりとピペットで取り除き、新しく修正されたステントまたはメディウムを追加します。

ステントセルを切断するために使用されるガラス針を準備します 2本のガラス攪拌ロッドを豊富に保持し、端が溶け始めるまでバーナーします。次に、溶融ガラスが融合するまで、2本のロッドの端を一緒に触れます。融合したら、炎から取り出し、1〜2秒間冷まします。

次に、それらをゆっくりと引き離してきれいに休憩します。理想的には、これにより長さが約1〜2センチメートルの針が生成され、端に細かい点があります。結果として得られる針が最適でない場合は、先端をガラスのウエストに割ってロッドを再利用します。

次に、ワセリンでコーティングされた正方形のゴム印を使用して、ガラスカバースリップに押し込んで正方形のワセリン壁チャンバーを準備します。次に、100マイクロリットルの改変ステントまたは2%メチルセルロースを含む培地をワセリンスクエアに追加します。準備したカバースリップをプラスチックアダプターに入れ、洗浄したステントセルをカバースリップに加えます。

最後に、メチルセルロース内の細胞を、イメージング中に焦点が合うように、細胞が等間隔に配置され、カバースリップの表面に十分に近づくように配置します。まず、スライドを倒立顕微鏡のステージに置きます。次に、解剖顕微鏡本体をスタンドから取り外し、スライドを上から低倍率で視覚化するために配置する必要があるおおよその位置を決定します。

次に、倒立顕微鏡の接眼レンズと解剖スコープとの間に希望の間隔で段ボール箱を追加して、ダブルデッカー顕微鏡を構築します。実験が完了したら、実験が完了したら、サンプルが視野に入り、焦点が合っていることを確認します 解剖スコープを動かさなくても、解剖スコープをボックスに押し付けて、ラボテープを使用してボックスにテープで固定します。次に、DICの光学系を使用して倒立顕微鏡を20倍の空気対物レンズを所定の位置に設置します。

また、上からマイクロサージェリーを行うのに十分なスペースを確保するために、長作動距離のDICコンデンサーを使用してください。次に、倒立顕微鏡で細胞に焦点を合わせ、すべてが準備され、両側から焦点が合っています。5 12 x 5 12 CCDカメラを使用して、1秒あたり2枚の画像のフレームレートで画像の取得を開始します。

次に、ガラス針を使用してセルをカットします。初期の細胞質の流れパターンを捕捉し、創傷および創傷治癒プロセスのすべての段階を観察します。細胞が正常な外観に戻ったか、再び活発な運動性を開始したときに、取得を終了します。

まず、粒子画像速度対称性を使用して細胞質の流れを測定するためのMATLABパッケージであるPIVラボをダウンロードしてください。次に、各ビデオシーケンスのTIFF画像スタックをMATLABマニュアル内の粒子画像veloc対称プログラムに読み込みます。各画像スタックのマスクを手動で生成して、ステントの本体の外側の生データの領域をマスクします。

次に、PIV ラボを高速フーリエ変換設定と 64 x 64 ピクセルのビン サイズを使用するように設定します。これにより、各フレームのピクセルがより大きな正方形ピクセルにビンされます。次に、PIV ラボを実行して、各フレーム内のピクセルと近くのピクセルとの間の相互相関を計算します。次のフレームでは、これにより、各ベンド ピクセルを中心とする時間依存のフロー ベクトルが生成され、生データと同じ時間解像度になります。

次に、結果として得られるベクトル場出力の時間平均を計算して、切断前と創傷治癒中にステントで取得したデータを比較します。また、流速のヒストグラムを計算して、流れの強度と特定のピクセルでの速度の経時的な変化を調査し、流れの変動を調査します。ステントまたは細胞を半分に切断した状態でシーケンスをイメージングする場合は、平均流速に細胞外細胞質の気泡基部の断面積を掛けて、細胞質の適切な細胞質に戻る全フラックスを計算します。

ここに示されているのは、ステントまたは細胞がガラス針で切断および破壊される様子のライブイメージングです。切断後、かなりの量の細胞質が細胞本体から引き出されますが、それは急速に細胞に逆流します。この手順に続いて、ステントまたは創傷治癒中の細胞質運動に寄与する可能性のある細胞骨格成分などの追加の質問に答えるために、化学的阻害剤を追加することができます。

このビデオを見れば、ステントを細胞に切断するためのツールを準備する方法と、単一の巨大細胞内での切断および創傷治癒プロセス中の細胞質の流れを画像化する方法について十分に理解できるはずです。