Stentor coeruleusにおける単一細胞創傷治癒中の細胞質の流れの可視化
2013年12月19日
巨大繊毛虫Stentor coeruleusは、単一細胞の再生と創傷治癒を研究するための古典的なシステムです。Stentor細胞を低倍率と高倍率で同時にイメージングすることにより、創傷前、創傷中、および創傷後の細胞質の流れを測定することができます。
この手順の全体的な目標は、単一細胞の創傷治癒中の細胞質の流れを測定することです。これは、まず、細胞創傷のモデルシステムとして使用するために、生きたステントまたはSEIU細胞を採取することによって達成されます。2番目のステップは、細胞を切断するためのガラスツールを準備することです。
次に、ステントサリウス細胞をカスタマイズされた顕微鏡セットアップで切り開き、低倍率手術と高解像度イメージングを同時に行うことができます。最後のステップは、粒子画像速度対称性ソフトウェアを使用して細胞質の流れの計算解析を実行することです。最終的には、細胞質の高解像度イメージングを使用して、創傷治癒中の細胞の活性応答を示します。
この方法は、周囲の培地への漏れを防ぐために、細胞質が切り傷の領域の周りでゲル状になるかどうかなど、細胞の創傷治癒に関する重要な問題に対処するために使用できます。この方法は、セルハンドリングツールの準備と切断手順が手先の器用さを必要とするため習得が難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。歯石に記載されている天然の橋から、または商業供給者からステントまたはシリウス細胞を取得し始めるには、歯石によるレシピから適合した300ミリリットルの改変ステントまたは培地を追加し、添付のテキストプロトコルに記載されているように抑止します。
20°Cの暗闇で培養物を育てて維持します。次に、クラミドモナスラインハーディ藻類の培養物をトリスアセテートリン酸培地で育てます。給餌前に標準的な培養方法を使用して、クラミドモナス細胞を穏やかに回転させ、上清を取り除き、改変したステントまたは培地に懸濁して洗浄します。
必要に応じて、300ミリリットルのステントまたはサリウス培養物に約3,000万chmの細胞を週に2〜3回供給します。手術のためにステントまたは細胞を収集します。まず、細胞が剥離して自由に泳ぎ始めるまで、ピペットチップから空気を泡立てて培養物を穏やかに攪拌します。
次に、細胞のせん断を避けるために、幅の広いボアチップを備えた1ミリリットルのピペットを使用して遊泳細胞を捕捉します。収集したら、細胞が落ち着くのを待ちます。次に、その上のメディアをゆっくりとピペットで取り除き、新しく修正されたステントまたはメディウムを追加します。
ステントセルを切断するために使用されるガラス針を準備します 2本のガラス攪拌ロッドを豊富に保持し、端が溶け始めるまでバーナーします。次に、溶融ガラスが融合するまで、2本のロッドの端を一緒に触れます。融合したら、炎から取り出し、1〜2秒間冷まします。
次に、それらをゆっくりと引き離してきれいに休憩します。理想的には、これにより長さが約1〜2センチメートルの針が生成され、端に細かい点があります。結果として得られる針が最適でない場合は、先端をガラスのウエストに割ってロッドを再利用します。
次に、ワセリンでコーティングされた正方形のゴム印を使用して、ガラスカバースリップに押し込んで正方形のワセリン壁チャンバーを準備します。次に、100マイクロリットルの改変ステントまたは2%メチルセルロースを含む培地をワセリンスクエアに追加します。準備したカバースリップをプラスチックアダプターに入れ、洗浄したステントセルをカバースリップに加えます。
最後に、メチルセルロース内の細胞を、イメージング中に焦点が合うように、細胞が等間隔に配置され、カバースリップの表面に十分に近づくように配置します。まず、スライドを倒立顕微鏡のステージに置きます。次に、解剖顕微鏡本体をスタンドから取り外し、スライドを上から低倍率で視覚化するために配置する必要があるおおよその位置を決定します。
次に、倒立顕微鏡の接眼レンズと解剖スコープとの間に希望の間隔で段ボール箱を追加して、ダブルデッカー顕微鏡を構築します。実験が完了したら、実験が完了したら、サンプルが視野に入り、焦点が合っていることを確認します 解剖スコープを動かさなくても、解剖スコープをボックスに押し付けて、ラボテープを使用してボックスにテープで固定します。次に、DICの光学系を使用して倒立顕微鏡を20倍の空気対物レンズを所定の位置に設置します。
また、上からマイクロサージェリーを行うのに十分なスペースを確保するために、長作動距離のDICコンデンサーを使用してください。次に、倒立顕微鏡で細胞に焦点を合わせ、すべてが準備され、両側から焦点が合っています。5 12 x 5 12 CCDカメラを使用して、1秒あたり2枚の画像のフレームレートで画像の取得を開始します。
次に、ガラス針を使用してセルをカットします。初期の細胞質の流れパターンを捕捉し、創傷および創傷治癒プロセスのすべての段階を観察します。細胞が正常な外観に戻ったか、再び活発な運動性を開始したときに、取得を終了します。
まず、粒子画像速度対称性を使用して細胞質の流れを測定するためのMATLABパッケージであるPIVラボをダウンロードしてください。次に、各ビデオシーケンスのTIFF画像スタックをMATLABマニュアル内の粒子画像veloc対称プログラムに読み込みます。各画像スタックのマスクを手動で生成して、ステントの本体の外側の生データの領域をマスクします。
次に、PIV ラボを高速フーリエ変換設定と 64 x 64 ピクセルのビン サイズを使用するように設定します。これにより、各フレームのピクセルがより大きな正方形ピクセルにビンされます。次に、PIV ラボを実行して、各フレーム内のピクセルと近くのピクセルとの間の相互相関を計算します。次のフレームでは、これにより、各ベンド ピクセルを中心とする時間依存のフロー ベクトルが生成され、生データと同じ時間解像度になります。
次に、結果として得られるベクトル場出力の時間平均を計算して、切断前と創傷治癒中にステントで取得したデータを比較します。また、流速のヒストグラムを計算して、流れの強度と特定のピクセルでの速度の経時的な変化を調査し、流れの変動を調査します。ステントまたは細胞を半分に切断した状態でシーケンスをイメージングする場合は、平均流速に細胞外細胞質の気泡基部の断面積を掛けて、細胞質の適切な細胞質に戻る全フラックスを計算します。
ここに示されているのは、ステントまたは細胞がガラス針で切断および破壊される様子のライブイメージングです。切断後、かなりの量の細胞質が細胞本体から引き出されますが、それは急速に細胞に逆流します。この手順に続いて、ステントまたは創傷治癒中の細胞質運動に寄与する可能性のある細胞骨格成分などの追加の質問に答えるために、化学的阻害剤を追加することができます。
このビデオを見れば、ステントを細胞に切断するためのツールを準備する方法と、単一の巨大細胞内での切断および創傷治癒プロセス中の細胞質の流れを画像化する方法について十分に理解できるはずです。
概要
本研究では、巨大繊毛虫 Stentor coeruleus における創傷治癒中の細胞質流を調査します。特製の顕微鏡セットアップを用いることで、研究者は創傷前、創傷中、および創傷後の細胞の低倍率および高倍率の画像の両方を撮影することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 再生
- 創傷治癒
背景
- Stentor coeruleusは、細胞プロセスを研究するためのモデル生物として利用されています。
- 細胞質流を理解することは、創傷治癒メカニズムに関する知見を得るために不可欠です。
- 先行研究により、細胞研究におけるイメージング技術の重要性が強調されています。
- 本研究に含まれる外科的手順には、手先の器用さが求められます。
研究目的
- Stentor coeruleusの創傷治癒過程における細胞質流を測定すること。
- 創傷後に細胞質がゲル状に変化し、漏出を防止するかどうかを検討すること。
- 細胞創傷に用いられる外科的手技を視覚的に提示すること。
使用された手法
- 実験用の生きた Stentor coeruleus 細胞の収集。
- 精密な細胞切断のためのガラス器具の準備。
- 低倍率での手術と高解像度イメージングの同時実施。
- 粒子画像流速測定（PIV）ソフトウェアを用いた細胞質流の計算解析。
主な結果
- 創傷治癒過程における細胞質流動パターンのイメージングに成功したこと。
- 創傷後の細胞の能動的応答に関する知見が得られたこと。
- 実験室環境における外科的手技の有効性が実証されたこと。
- データ解析により、流動の変動および時間経過に伴う速度変化が明らかになったこと。
結論
- 本研究は、単一細胞における細胞質流動を分析するための包括的な手法を提供します。
- 得られた知見は、細胞の創傷治癒メカニズムの理解に寄与します。
- 今後の研究において、これらの手法を基盤として他の細胞応答を探索することが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
単一細胞の創傷治癒における細胞質ダイナミクスを理解することは、膜修復と細胞の回復力に関するメカニズム的な知見を提供し、これらは再生生物学におけるターゲットバリデーションに関連しています。本手法により、物理的摂動に対する細胞内応答の定量的な評価が可能となり、細胞骨格や輸送モジュレーターの表現型スクリーニングアプローチを支援します。この単一細胞解像度のアッセイは、サブセルラーな修復メカニズムを調査するための疾患関連システムを提供することで、前臨床モデルの開発に寄与します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的活用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：細胞骨格の調節および膜修復経路に関連する治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値：制御されたシステム内で細胞内損傷に対する機能的応答を可視化することにより、生物学的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 基線となる細胞質流動の指標を確立することにより、ダウンストリームのワークフローに向けて検証済みの生物学的システムを準備します。
- 運用上の価値： 高解像度イメージングと粒子画像流速測定（PIV）分析を通じて、アッセイの標準化と再現性に取り組みます。
- 運用上の価値： 定量可能な細胞質流束の測定により、スクリーニングへの適用可能性と拡張性を強調します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 損傷後の能動的な細胞質応答パターンを通じて、疾患との関連性およびトランスレーショナルなバイオマーカーの整合性について論じている。
- 運用的価値： サブセルラーレベルの修復と細胞生存率の結果を関連付けることで、発見から前臨床検証までの連続性を記述している。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、細胞骨格が創傷治癒にどのように寄与しているかという仮説検証を可能にすることで、早期の創薬ワークフローに統合でき、細胞質流動ダイナミクスの変調を通じたリード化合物の同定に直接的に活用できます。
- 探索生物学：膜破壊に対する細胞内応答をリアルタイムで可視化することにより、本手法がどのように仮説検証、パスウェイの解明、または生物学的なリスク低減をサポートするかを説明します。
- スクリーニング：粒子画像流速計（PIV）から得られた流速ベクトル場および速度ヒストグラムを通じて、アッセイの準備状況、再現性、または定量的な出力を記述します。
- 分析：時間平均流速ベクトルや細胞質フラックスの計算など、チームが条件比較を行う際に有用な測定値、リードアウト、または統計的出力を強調します。
- トランスレーショナルリサーチ：細胞質再封鎖キネティクスを細胞回復フェノタイプに結びつけることで、本手法を前臨床段階の連続性やバイオマーカーの整合性に連携させます。
- エンタープライズ再利用：標準化されたガラス針の作製および2段構成の顕微鏡設定により、本手法を単発的なテクニックではなく、再利用可能な機能として枠組み化します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 予測精度の向上、ターゲットの検証、メカニズムに関する不確実性の低減。
- 運用の価値： 標準化、再現性、および拡張性。
- 戦略的価値： より適切なGo/No-go判断、資本効率の向上、および後期段階における生物学的リスクの低減。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けおよび推進決定。
実施上の検討事項
- マイクロサージェリーおよびライブセルイメージングにおける専門的な科学的知識が必要である。
- 倒立顕微鏡、実体顕微鏡、高NAレンズ、PIVソフトウェアを含む、装置および分析インフラストラクチャが必要である。
- チャンバーの調製および細胞のポジショニングに関するチーム間の標準化が必要である。
- Stentor coeruleus固有のサイズおよび再生特性による、モデルシステム間の適応上の検討事項。
- ガラス器具の作製や細胞のハンドリングに求められる手先の器用さなど、ソース資料に基づく実用上の制限事項。
バイオ医薬品FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Cell Culture and Collection
2:32
Preparation of Tools and Cells for Microsurgery
3:43
High Resolution Imaging of Wound Healing in Live Stentor Cells
5:19
Analyzing Cytoplasmic Flow During Wound Healing
7:13
Results: Live Imaging of Stentor Cells Following Disruption
7:33
Conclusion
