の体系的な分析体外セルローリング

次の実験の全体的な目標は、厳密に制御された生理学的に関連性のあるせん断流の下で、スループットを向上させた細胞ローリング研究を実施することです。これは、特殊なプレート内の隣接するウェルがマイクロ流体チャネルを介して接続されているマルチウェルマイクロ流体システムを使用して実現されます。システムのインターフェースは、電空ポンプをマルチウェルプレートの上部に接続し、空気圧を適用して、ウェル内からマイクロ流体チャネルを介して定義された流量で流体を駆動します。

マイクロ流体チャネルが目的の基板または細胞単分子膜でコーティングされると、目的の細胞をマイクロ流体チャネルに導入して、コーティングされた表面との特定のローリング相互作用を探索し、異なる実験条件下で基板または単層コーティング表面と相互作用する細胞のローリング特性を適切なソフトウェアで分析できます。この手法がパラレルプレートフローチャンバーのような既存の方法よりも優れている点は、この技術により、試薬や細胞の消費を最小限に抑えながら、正確に制御された生理学的に関連性のあるチューブフローの下で、大幅に高いスループットで銀の圧延特性を研究できることです。このプラットフォームは、細胞のローリングとホーミングに影響を与えるように設計された工学的アプローチの迅速かつ正確な分析を可能にすることにより、外因性細胞ベースの治療の進歩に役立つ可能性があります。

マイクロ流体チャネルをタンパク質基質でコーティングするには、まず、調製したばかりのタンパク質溶液を25〜50マイクロリットルをインレットに加えます。次に、1平方センチメートルあたり2食の力を5分間加えて、溶液をチャネルに灌流します。出口に液体のビーズが見えてきたら、流れを十分に止め、目的のタンパク質とプレートを適切な時間インキュベートし、それぞれから溶液を吸引します。まぁ。

次に、200〜500マイクロリットルのPBSを出口ウェルに加え、1平方センチメートルあたり2ダイナの純粋な流れを5分間適用してチャネルを洗浄し、マイクロ流体チャネル内に細胞単層を作成します。まず、培養皿から目的の細胞を3分間穏やかにトリプシンし、2倍の容量のフル培地で反応を停止し、次に細胞を400Gsで5分間遠心分離し、rtします。次に、ペレットを10ミリリットルのフルメディアで洗浄します。

次に、細胞を1ミリリットルの新鮮なフル培地に再懸濁してカウントし、細胞溶液を適切な濃度に調整し、次いで細胞懸濁液の25〜50マイクロリットルを各入口にプレートする。さて、プレートを顕微鏡ステージに置き、細胞がチャネル全体を満たしていることが観察されるまで、1平方センチメートルあたり2つのダイネの純粋な流れを適用して、細胞をチャネルに流します。流れを止めた後、出口ウェルと内陸ウェルの両方に200マイクロリットルの適切な細胞培地を充填し、細胞を5%CO2中で摂氏37度で沈殿させて接着させます。

3時間後、チャネルをフルメディアで洗浄し、付着していない細胞を取り除きます。これで、細胞は完全にコンフルエントになり、チャネル内の内皮細胞の炎症性活性化を誘導するために使用できるはずです。新たに調製したTNFアルファ溶液100マイクロリットルをインレットウェルに加え、次いで、1平方センチメートルあたり2ダイナの純粋な流れを5分間適用することにより、溶液をチャネルに導入します。

コントロールの非活性化内皮細胞チャネルについては、100マイクロリットルの内皮細胞基礎培地をインレットに加えます。さて、内皮細胞表面のPまたはEセレクチンをブロックするには、適切な中和抗体のミリリットルあたり5マイクログラムをチャネルに導入し、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、ローリングアッセイを開始する前に、チャネルを基礎培地で洗浄します。

顕微鏡でチャンネルを注意深く調べて、チャンネルが適切にコーティングされていることを確認してください。次に、HL 60細胞懸濁液を2回目の洗浄回数後に基礎培地で2回洗浄し、IMDMで細胞を10の5倍から6番目の細胞濃度で再懸濁します。25〜50マイクロリットルの細胞懸濁液を出口に追加した後、プレートを摂氏37度の温度制御プレートホルダーによく入れ、プレートホルダーを顕微鏡ステージに置きます。

細胞をマイクロ流体チャネルに導入します。それらは、出口から入口に流れる10〜15秒以内に観察されるべきです。ここでは、蛍光標識されたHL60細胞を観察することができ、P選択符号化表面と相互作用し、せん断応力の関数として圧延応答を調べるためのローリング応答を表示し、せん断を平方センチメートル当たり0.25ダイネに減少させ、各所望のせん断におけるストリーム取得機能を使用して20〜32番目のビデオを取得し、 そして、せん断を0.25から1平方センチメートルあたり5ダインまで徐々に増加させます。

最後に、CCDカメラを使用して、毎秒11フレームのストリーム取得でアッセイのビデオを取得します。例えば、ここでは、chope細胞の単層上を転がるHL60細胞が示されている。適切な互換性のあるソフトウェアを使用して、転がり経路と速度を解析します。

HL 60細胞は、ローリングリガンド、Pセレクトおよび糖タンパク質リガンド1、CI Lewisなどのさまざまなホーミングリガンドを発現 X.To、マルチウェルプレートマイクロ流体システムの能力をテストするため、ゴールドスタンダードローラーと見なされています。多数のマイクロ流体チャネルは、さまざまな基質とHL60細胞のローリング相互作用で同時にコーティングされています。これらの基質を分析したところ、細胞はPセレクトコード表面上で堅牢なローリング挙動を示し、細胞は最初にフローから捕捉され、続いて明確なローリング運動が見られました。このグラフに示されているように、また文献と一致しているように、HL 60細胞は、eおよびpセレクチン表面では同様の転がり挙動を示しますが、FiberIncでコーティングされた基板上では示されません。

互換性のあるソフトウェアを介して分析された細胞速度は、純粋なストレスに対してプロットされ、pおよびeセレクチン上の細胞の堅牢なローリング応答を示し、平均速度は1秒あたり1〜12ミクロンでした。このマイクロ流体システムの実現可能性を評価するために、目的の細胞と表面をコーティングした細胞単層をコーティングした細胞単層との間の相互作用を効率的に試験するために、Pを安定的に発現するようにトランスフェクションしたが、eセレクチンは発現しないようにトランスフェクションした、ここに示すように使用しました。HL 60細胞は、HL P細胞単層上で有意なローリング応答を示し、HL 60のローリング運動が実際にペクチンによって媒介されているかどうかを検証します。

この単層は、HL 60細胞をチャネルに増殖させる前に、PまたはEセレクチンのブロッキング抗体と事前にインキュベートしました。このグラフに示すように、CHO p単層をPセレクチン抗体でブロックすると、表面を転がるHL60細胞の数が大幅に減少し、PがHL60の転がりを選択し、実際に媒介することが実証されました。前述のように、マルチウェルマイクロ流体プレートは多数の個別のマイクロ流体チャネルで構成されているため、複数の異なる条件でより高いスループットテストが可能です。

この有利な設計は、炎症状態をシミュレートするためのさまざまな実験条件下でHL 60細胞と内皮細胞との間の相互作用を迅速に分析するために、マイクロ流体チャネル内の内皮細胞をプレートするために使用され、内皮細胞は炎症誘発性サイトカインTNFアルファで前処理され、その結果、内皮細胞表面上のEのアップレギュレーションが起こりましたが、Pセレクチンはアップレギュレーションされませんでした。興味深いことに、HL 60細胞は不活化された内皮細胞と相互作用せず、細胞がこの表面を転がることは観察されませんでした。それどころか、HL 60細胞は、TNF alpha活性化内皮細胞上で平均速度5〜15ミクロン/秒で堅牢なローリング挙動を示し、HL 60細胞と活性化内皮細胞との間のローリング相互作用におけるpまたはEセレクチンの関与を調査しました。

TNFアルファ活性化内皮細胞をPまたはE selectとブロッキング抗体で事前にインキュベートし、HL60細胞のローリングをTNFアルファ内皮細胞で選択されたグラフに示すように分析したところ、活性化内皮単層上のローリング細胞の数が有意に減少しました。対照的に、同位体コントロールやペクチンに対する抗体を用いても、活性化された内皮細胞上に発現していないものは、活性化された内皮層上のHL60のローリングに有意な影響を与えませんでした。これらのデータは、TNFα活性化内皮細胞上のHL 60ローリングにおけるSセレクチンの直接的な関与を実証しており、以前の報告と一致しています。

解析ソフトウェアでは、個々の細胞が表面と相互作用する際の経路を追跡することができます。したがって、個々の細胞が、e selectおよび抗体ブロッキングの有無にかかわらずTNFアルファ活性化内皮細胞と相互作用する際の経路を特異的に追跡した この図に示すように、ブロックされていない活性化内皮細胞上のローリング細胞の数は、選択およびブロックされた活性化内皮細胞上のローリング細胞の数よりも有意に多かった。さらに、ブロックされていない内皮細胞上のHL 60細胞のローリング運動は連続的かつ堅牢である一方で、選択内皮細胞とブロックされた内皮細胞上の細胞のローリングパスは断片化されているように見えました。

この知見と一致して、ブロックされていないTNFアルファ活性化内皮細胞上のHL60細胞のローリング速度は、eセレクトおよびブロックされた内皮細胞のローリング速度よりも有意に低かった。この研究では、複数のマイクロ流体システムを使用して、厳密に制御されたチューブの流れの下で1時間あたり最大10個のローリングガスのスループットを向上させ、セルローリング実験を効率的に実行することを示しています。全体として、このマイクロ流体システムは、細胞ホーイングの重要な側面である細胞のローリングを研究するための強力な技術として浮上しています。

例えば、当研究室では現在、このシステムを用いて、間葉系幹細胞のホーミングを増強する条件をスクリーニングし、治療効果を向上させるための戦略として