ウェスタンブロッティングにおける実用的で便利で信頼性の高い全タンパク質ローディング制御のためのV3染色不要のワークフロー

BioRad V three Workflow は、ウェスタンブロッティングプロセスにおいて、研究者により信頼性の高い定量と信頼性を提供します。これは、まずTGXステインフリーゲルを使用してタンパク質サンプルを分離し、可視化することで達成されます。分離後、タンパク質はブロットターボラピッドトランスファーシステムを使用してメンブレンに転写され、転写の品質と効率を検証できます。

転写を確認した後、メンブレンをブロックし、標的タンパク質の一次抗体と二次抗体でプローブします。最後に、ローディングコントロールとして、無染色の全タンパク質測定を使用して、標的タンパク質レベルを正規化します。V threeワークフローは、ウェスタンブロッティングプロセスに利便性と透明性をもたらし、分離から転写、定量までのすべてのステップで研究者に自信を提供します。

従来のウェスタンブロッティングと比較した場合のV three Westernワークフローの主な利点は、ステンフリー技術が、標的タンパク質シグナルを正常化するための実用的で便利、かつ信頼性の高い全タンパク質ローディング制御を提供することです。この方法は、ハウスキーピングタンパク質シグナルの過飽和と、さまざまな実験条件下でのハウスキーピングタンパク質の差次的発現レベルを含むウェスタンブロッティング技術のローディング制御方法論の信頼性に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。私たちは、染色フリーゲルで活性化されたタンパク質は、さらに染色することなくブロで可視化できることを発見し、従来の総タンパク質染色の代替として、またハウスキーピングタンパク質ローディングコントロールとして使用することができます。

次の数分で、マルチプレックス蛍光を使用した完全なV 3ワークフローを実演します。同じ手順は、テキストプロトコルに従ってタンパク質サンプルを調製した後の化学発光にも使用できます。基準TGX汚れのないKDプレキャストゲルを使用して、カセットの底からコームとテープをはがします。

カセットをゲル装置にセットし、両方のリザーバーにランニングバッファーを充填します。タンパク質の標準試料とサンプルをロードします。次に、ゲルを300ボルトで20分間実行します。

電気泳動が完了したら、Criterion Cellの蓋にあるゲルカセット開口ツールを使用してカセットを開きます。次に、Chemi Dock MPイメージャーのUVトランスルミネーターに数ミリリットルの水を適用します。カセットからゲルを慎重に持ち上げてUV Trans Illuminator Launch Image Labソフトウェアにセットし、デフォルトの1分間のゲル活性化時間を使用して、染色のないゲル用の新しいシングルチャネルプロトコルを設定し、適切なゲルタイプとインテンスバンド用のデフォルトの自動最適化を選択します。

次に、[プロトコルの実行] をクリックします。画像キャプチャが完了したら、分離とサンプル品質を視覚化します。その後、すぐに転送手順に進みます。

タンパク質の転写を行うには、trans block turbo MIDI PVDF トランスファーパックを開封します。一番下のスタックをカセットベースの中央に置きます。ゲルをイメージャーから取り出します。

ゲルをメンブレンの上に整列させます。ブロットローラーをそっと使用して、ゲルとメンブレンの間の気泡を取り除きます。次に、一番上のスタックをゲルの上に揃えます。

気泡を取り除いたら、カセット蓋をベースに置きます。蓋をしっかりと押し下げ、ダイヤルを時計回りに回してカセットをロックし、2つの吸い取り紙ベイのいずれかに挿入します。ホーム画面から、ターボプロトコルを選択します。

2つのミニゲルまたは1つのミニゲルを選択し、適切なベイのランボタンを押します。転送は7分で完了します。カセットをベイから取り外します。

カセットのロックを解除し、ブロッティングサンドイッチを分解します。転写後ゲルをChemi dock MPイメージャーのUVトランスルミネーターに置き、すぐにメンブレンを脱イオン水に入れます。.活性化時間なしで染色フリーゲル用の新しいシングルチャンネルプロトコルをセットアップします。

適切なゲルタイプを選択し、露光時間をプレトランスファーゲルの露光時間に手動で設定し、[run protocol]をクリックします。画像のキャプチャが完了したら。転写前と転写後のゲル間のサンプルバンド強度を比較することにより、転写効率を確認します。

不要になったゲルをサンプルトレイから取り出して廃棄します。確認するには、ブロットに移します。メンブレンをサンプルトレイに置き、新しいシングルチャネルプロトコールをセットアップします。

汚れのないブロット用。適切なゲルタイプを選択し、インテンスバンドのデフォルトの自動最適化を選択します。次に、[プロトコルの実行] をクリックします。

画像キャプチャが完了したら、メンブレンへの転写を確認します。UVトランスイルミネーターからブロットメンブレンを取り外し、ウェスタンブロッティング用のブロッキングバッファーに入れます。メンブレンを室温で1時間インキュベートした後、翌日、マウスおよびウサギの一次抗体と4°Cで一晩インキュベー

抗体溶液を注ぎ、50ミリリットルのTBSTを使用してブロットを5分間洗浄します。ブロットを蛍光標識、抗ミューズ、抗ウサギ二次抗体と室温で1時間インキュベートします。次に、TBSTを使用して、ブロットを5回ずつ5分間洗浄します。

ブロットをイメージングするには、Image LabソフトウェアでChemi doc MPイメージャーのUVトランスイルミネーターにブロットを置きます。新しいマルチチャネルプロトコルを設定します。dite six 50 under blot アプリケーションを選択してチャンネル 1 を設定し、インテンスバンドにはデフォルトの自動最適化を使用します。

これらの手順を繰り返して、DITE 5 49と染色フリーブロットのチャンネル2と3をそれぞれ設定します。適切なゲルタイプを選択し、[run protocol]をクリックします。レーンを定義するには、ステンフリーブロット画像のレーンとバンドを選択します。

次に、正確な定量のための自動レーンファインダー。各サンプルレーンの背景プロファイルが類似していることを確認するには、ローリングディスクのサイズを70に調整します。すべてのレーンプロファイルをスキャンして、6つの50チャンネルと5つの49チャンネルの両方でバンドを定義することにより、背景の均一性を確認します。

バンド ファインダー ツールを使用して、デフォルトの感度設定を使用してバンドを検出します。正規化チャネルを指定するには、解析ツールボックスに戻ります。「ノーマライゼーション」をクリックし、ステンフリーブロットを選択し、トータルレーンタンパク質が選択されていることを確認します。

分子量標準レーンを解析ツールボックスに戻すには、[MW 解析ツール] をクリックし、適切なレーンの下にあるチェックボックスをオンにします。最後に、正規化されたタンパク質バンド強度を表示するには、ツールバーの分析テーブルをクリックします。ソフトウェアは、ボリューム強度、正規化係数、および正規化されたボリュームを含むテーブルを自動的に生成します。

正規化されたボリュームは、データ分析とレポート作成に使用する必要があります。テーブルはエクスポートできます。さらなる分析のために、完全なV 3ウェスタンブロッティングワークフローを実証しました。

次に、実際の実験の代表的な結果を示します。コントロール細胞培養液および照射リンパ芽球細胞培養液のライセートを、V 3ウェスタンブロットワークフローを用いて分析しました。無染色の全タンパク質シグナルは青色で表示されます。

標的タンパク質M CM sevenは赤色で、バリデーション済みのハウスキーピングタンパク質ローディングコントロールGA DHは緑色で示されています。GA DHは、このビデオで説明されている実験条件を使用してその線形性を評価することにより、適切な負荷制御として検証されています。ブロット上の各レーンの無染色総タンパク質シグナルは、Image Labソフトウェアを使用して測定しました。

MCM 7シグナル強度は、全タンパク質シグナルとGA DHシグナルの両方を使用して正規化されました。両方の方法で正規化したMCMの7つのタンパク質バンドボリュームは、正確な標準化前に、照射されたサンプルの発現レベルが対照サンプルと比較して25%減少したことを示しました。ハウスキーピングタンパク質は、バリデーションなしでは、その線形範囲とサンプル間で一貫した発現レベルを確認するバリデーションが必要です。

ハウスキーピングタンパク質ローディングコントロールは、正確な標準化を保証するものではありません。対照的に、全タンパク質の標準化にはバリデーションは必要ありません。したがって、V threeワークフローによって得られる無染色の全タンパク質シグナルは、この手順を試みながら、実用的で、便利で、より信頼性の高いローディング制御を提供します。

ステンフリー技術により、利用可能なトリプトファン残基のUV誘起共有結合修飾を通じてタンパク質サンプルを蛍光的に可視化できることを忘れないでください。まれなケースでのみ、この修飾が免疫検出や質量分析などのダウンストリームアプリケーションに大きな影響を与えます。このビデオをご覧いただければ、V 3ウェスタンワークフローの実行方法と染色フリーの全タンパク質標準化の方法について十分に理解できるはずです。

このワークフローはマルチプレックス蛍光ウェスタンブロッティングで実証しましたが、ステンフリーテクノロジーは、発光ウェスタンブロットによる全タンパク質の標準化にも使用できます。