Name: リンパ節間質細胞起源の研究のためのリンパ節脂肪パッドキメラの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶリンパ節脂肪パッドキメラの作製法。新生マウスのリンパ節と胚脂肪パッドを分離し、体外で再構成して腎被膜下に移植することで、脂肪組織由来細胞がリンパ節間質形成に寄与する機構を解明します。

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私たちは、動物のコロニーの世話をしてくれたバーミンガム大学の生物医学サービスユニットの職員に感謝しています。この作業は、EU FP7統合プロジェクトINFLACARE to JCの支援を受けました。

マウスは、英国内務省および地元の倫理委員会の規則に従って、バーミンガム大学の生物医学サービスユニットでSPF条件下で飼育および維持されました。このプロトコルに記載されているすべての手順は、地元の倫理委員会と内務省の両方によって承認されたプロジェクトライセンスの下でカバーされています。
1. 新生児LNの分離
<ol>
	<li>子宮頸部脱臼により新生児マウスを犠牲にします。</li>
	<li>頭を切片にし、胸部の上部から腹部の下部までハサミで体を開き、腹腔からすべての内臓(心臓、肺、肝臓、腸、腎臓、膀胱)を慎重に取り除きます。</li>
	<li>RF10培地(10%ウシ胎児血清、100U / mlペニシリン、100mg / mlストレプトマイシン、2mM L-グルタミンを補充したRPMI1640培地)を含む90mmシャーレに体を移します。.このステップ以降、組織は無菌状態に保たれ、組織培養フードで取り扱われます。</li>
	<li>本体をRF10が入った新しい90mmシャーレに移します。</li>
	<li>解剖顕微鏡の下で、鼠径部の皮膚から腹膜を慎重に取り外します。鼠径部のLNは、脂肪パッドの3つの血管の交点に位置しています。</li>
	<li>LNを慎重に取り外します。すべての脂肪組織が除去されていることを確認してください。LNをRF10メディアを含む50mmシャーレに移します。手順を続行している間、組織を氷の上に保ちます。</li>
</ol>
2. E18.5脂肪パッドの分離
<ol>
	<li>妊娠18.5日目(E18.5)にマウス胚を生成するには、ケージごとに雌マウスと雄マウスを一晩配置して、時限妊娠を設定します。午前中にマウスを分離し、膣栓を確認します(妊娠日E0.5)。
	<ol>
		<li>妊娠18.5日目に子宮頸部脱臼により、詰まった女性を安楽死させます。</li>
		<li>胚を取り出し、RF10が入った90mmのシャーレに入れます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>このステップ以降、組織は組織培養フードで滅菌技術を使用して取り扱う必要があります。解剖顕微鏡の下で、頭部を切片にし、胸部から腹部の底部までハサミで胚を開き、体腔からすべての内臓(心臓、肺、肝臓、腸、腎臓、膀胱)を慎重に取り除きます。</li>
	<li>残っているすべての内臓組織から体をきれいにし、PBSで洗って、解剖をより困難にする可能性のある血液の痕跡をすべて取り除きます。</li>
	<li>きれいな本体をRF10が入った新しい90mmのペトリ皿に移します。</li>
	<li>鼠径部の皮膚から腹膜を慎重に取り外します。鼠径部のLNは、脂肪パッドの3つの血管の交点に位置しています。</li>
	<li>LNを慎重に取り外して廃棄します。キメラに使用される脂肪パッドがリンパ系間質細胞によって汚染されていないことを確認するために、LNを完全に除去することが非常に重要です。</li>
	<li>鼠径部脂肪パッドを取り外し、RF10培地が入った50mmのシャーレに移します。手順を続行している間、組織を氷の上に保ちます。</li>
</ol>
3. LN-fatパッドキメラの生成
<ol>
	<li>in vitro臓器培養システムを調製する 15.
	<ol>
		<li>スポンジとフィルターの準備:これは事前に行うことができ、スポンジとフィルターは培養フード内のペトリ皿に滅菌して保管します。
		<ol>
			<li>Vulkanアンダーラップを1〜1.5 cm2個にカット</li>します
			<li>スポンジを蒸留水で2時間茹でます。</li>
			<li>スポンジを細胞培養フードで数時間乾燥させます。</li>
			<li>フィルターを20分間煮沸します。</li>
			<li>フィルターを細胞培養フードで数時間乾燥させます。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>10%ウシ胎児血清、10 mM HEPES、1x MEM 非必須アミノ酸溶液、50 mM 2-メルカプトエタノール、100 U/mL ペニシリン、100 mg/ml ストレプトマイシン、および 2 mM L-グルタミンを添加した DMEM 培地を調製します。</li>
		<li>50mmのペトリ皿に2mlの培地を加えます。</li>
		シャーレの<li>底にスポンジを1つ並べます。スポンジの両面をメディアに沈めて濡らします。</li>
		<li>スポンジの上にフィルターを1つ置きます。フィルターは液体と空気の界面に配置されています。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖顕微鏡下で、1つの新生児LNを1つの胚性脂肪パッドに慎重に再結合します。</li>
	<li>LN脂肪パッドキメラをフィルターの上に置きます。</li>
	<li>蓋にいくつかの穴があり、湿度を確保するために底に水が入った長方形のプラスチックの箱にペトリ皿を移します。</li>
	<li>蓋を箱にテープで密封します。蓋の2つの穴は開いたままにしておきます。</li>
	<li>ボックスを37°Cの細胞培養インキュベーターに5% CO2で移します。ボックスを2時間平衡化させてから、蓋の穴をテープで塞ぎます。</li>
	<li>組織を少なくとも2日間インキュベートして、LNが脂肪パッドに付着し、腎臓カプセルの下に移すことができるようにします。</li>
</ol>
4. 宿主マウスの腎臓嚢下へのLN-fat Pad Chimeraの転写
<ol>
	<li>フィルターからLN脂肪パッドキメラを採取し、宿主マウスの腎臓カプセルの下に移します。腎臓嚢移植法については、既に説明した16。</li>
</ol>
5. 転送されたLNの分離
<ol>
	<li>腎臓カプセルの下で3〜4週間後、LN脂肪パッドキメラを収穫する準備が整います。承認されたガイダンスを使用して宿主マウスを安楽死させます。</li>
	<li>宿主マウスから腎臓を取り出します。</li>
	<li>解剖顕微鏡下で、LN脂肪パッドキメラを分離し、LNを解剖します。</li>
</ol>
6. フローサイトメトリー解析のための転移LNの酵素消化
<ol>
	<li>酵素が臓器に浸透し、消化を促進するために、小さなハサミでLNに1つの切開を行います。</li>
	<li>600 μlの消化バッファー(RPMI 1% FCS、2.5 mg/ml Collagenase D、100 μg/ml DNase I)を含む1.5 mL Eppendorfに1つのLNを入れます。</li>
	<li>攪拌サーマルブロック上で37°Cで30分間インキュベートします。ピペットを上下に動かして、10分ごとに組織の解離を助けます。</li>
	<li>6 μl EDTA 0.5 Mをチューブに加え、ピペットで上下に動かして組織の解離を終了します。</li>
	<li>490 x gで5分間遠心分離します。</li>
	<li>一次抗体の組み合わせを含む染色溶液(PBS、0.1%BSA、5%ラット血清、5%マウス血清)に細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>氷上で30分間インキュベートします。</li>
	<li>PBSで2回洗う</li>
	<li>必要に応じて、二次抗体と20分間インキュベートします。</li>
	<li>PBSで2回洗ってください。</li>
	<li>フローサイトメーターで解析します。</li>
</ol>
7. 免疫蛍光法による転移LNの解析
<ol>
	<li>凍結および凍結切片プロセス中のEYFP保存のための固定:LNをPBS、4%PFA、10%スクロースの溶液に入れ、3〜4時間放置します。</li>
	<li>アルミホイルの小片に冷たいOCTコンパウンドを1滴ずつ入れます。気泡を避けてください。液滴の中央に液体を入れずにLNを慎重に置きます。</li>
	<li>アルミホイルをドライアイスの上に置いて臓器を凍結します。</li>
	<li>クライオスタットを使用して、8〜10μmの切片を余分な接着剤のスライドガラスにカットします。スライドを2時間乾燥させてから、-20°Cで保管します。</li>
	<li>染色手順は、使用する一次抗体によって異なり、以下のプロトコールから最適化することができます。一次抗体の組み合わせを含む染色溶液(PBS、1% BSA)で切片を染色します。</li>
	<li>加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベー</li>トします。
	<li>PBSで5分間2回洗浄します</li>
	<li>二次抗体と1時間インキュベートします。</li>
	<li>PBSで5分間2回洗浄します。</li>
	<li>DAPIを含む封入メディアにスライドをマウントします。</li>
	<li>蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+contributions+to+the+homeostasis+and+functionality+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-immune cell interactions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 813-825 (2010).</li>
<li>Katakai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizer-like+reticular+stromal+cell+layer+common+to+adult+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs.</a> J. Immunol. 181, 6189-6200 (2008).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nat. Immunol. 8, 1255-1265 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+stromal+organizer+cells+during+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of stromal organizer cells during lymph node development.</a> J. Immunol. 184, 4521-4530 (2010).</li>
<li>Cupedo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presumptive+lymph+node+organizers+are+differentially+represented+in+developing+mesenteric+and+peripheral+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Presumptive lymph node organizers are differentially represented in developing mesenteric and peripheral nodes.</a> J. Immunol. 173, 2968-2975 (2004).</li>
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<li>Vondenhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTbetaR+signaling+induces+cytokine+expression+and+up-regulates+lymphangiogenic+factors+in+lymph+node+anlagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">LTbetaR signaling induces cytokine expression and up-regulates lymphangiogenic factors in lymph node anlagen.</a> J. Immunol. 182, 5439-5445 (2009).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes Dev. 13, 2412-2424 (1999).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peripheral+lymph+node+genesis+by+the+tumor+necrosis+factor+family+member+TRANCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE.</a> J. Exp. Med. 192, 1467-1478 (2000).</li>
<li>Carragher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stroma-derived+defect+in+NF-kappaB2-%2F-+mice+causes+impaired+lymph+node+development+and+lymphocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A stroma-derived defect in NF-kappaB2-/- mice causes impaired lymph node development and lymphocyte recruitment.</a> J. Immunol. 173, 2271-2279 (2004).</li>
<li>White, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+a-dependent+and+-independent+signals+regulate+stromal+organizer+cell+homeostasis+during+lymph+node+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin a-dependent and -independent signals regulate stromal organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis.</a> Blood. 110, 1950-1959 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin-beta+receptor+signaling+through+NF-kappaB2-RelB+pathway+reprograms+adipocyte+precursors+as+lymph+node+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin-beta receptor signaling through NF-kappaB2-RelB pathway reprograms adipocyte precursors as lymph node stromal cells.</a> Immunity. 37, 721-734 (2012).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J. Vis. Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Krautler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+dendritic+cells+emerge+from+ubiquitous+perivascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Follicular dendritic cells emerge from ubiquitous perivascular precursors.</a> Cell. 150, 194-206 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この記事では、発生中のLNに対する脂肪組織前駆細胞の寄与をアッセイおよび定量化する方法と、それらの子孫の分析を可能にする2つの技術を紹介しました。胚性脂肪パッドと新生児LNの解剖は繊細であり、実際のLN脂肪パッドキメラを生成する前に、多くの練習によって得られた手作業のスキルが必要です。解剖の品質を制御するために、ファットパッドとLNに対してフローサイトメトリー分析を実行できます。 胚性脂肪パッドの調製にはリンパ節がなく、CD45+CD4+IL-7Ra+ リンパ組織誘導細胞が含まれていてはなりません。新生児のLN製剤は、脂肪組織を完全に含まず、CD45-CD31-ICAM-1、高VCAM-1、高リンパ組織組織細胞6,13-14を高の割合で含んでいる必要があります。汚染のリスクを減らすために、組織培養と手術の標準的な無菌技術に従う必要があります。	
	未熟なLN間質細胞へのLTβRの関与は、完全に成熟したLN間質...

リンパ節(LN)は、リンパ管ネットワークに沿って体内の戦略的な部位に位置する免疫系の主要な器官です。それらは、抗原および病原体の濾過を可能にし、リンパ球への抗原提示および適応免疫応答の誘導のための部位を提供する。間質は、LNの基本構造を形成し、適応免疫応答のさまざまな造血参加者の動きを指揮し、これらの臓器の機能の中心です。間質細胞の異なる集団は、免疫系の造血成分の運動、局在化、生存、増殖、成熟に不可欠かつ特異的な手がかりを提供します1-3。成体のLN間質細胞は、血液内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞の3つのカテゴリーに分類されます。これら 3 つのカテゴリには、異種集団が含まれます。線維芽細胞集団には、線維芽細胞網状細胞(FRC)、濾胞性樹状細胞(FDC)、辺縁網状細胞(MRC)が含まれ、一方、カプセルを形成する線維芽細胞、髄質、およびまだ同定されていない他の細胞1-5。異なるLN間質細胞集団の成熟を支配する起源とメカニズムは不明であり、特定のLN間質細胞集団の運命マッピングを可能にする特定のマーカーがないため、彼らの研究は特に困難になっています。しかし、適応免疫応答の理解には、LN間質細胞の個体発生を完全に理解することが必要であり、耐性に寄与するメカニズムであり、人工LNの開発の基礎となっています。
これまで、LN間質細胞の起源と発生の研究は、野生型マウスと異なるノックアウトマウス系統6-9の胚と新生児におけるLN発生の直接的な評価にほとんど限られていました。これらのアプローチは、LNの発生に重要な遺伝子の欠失を持つ一部のマウス系統の胚および周産期の致死性によって制限されます。また、リンパ組織の発生に必須な遺伝子の中には、RANK10-11やNF-κB212のように、幅広い生物学的プロセスに関与しているものもあります。これらの問題に対処するために、宿主マウスの腎臓嚢下への胚性LNの単離と移植が行われてきた12-13。この技術により、例えば、遺伝子組み換え胚性LNを野生型の環境に移植し、臓器の発達や宿主細胞の動員と組織化を評価することができます。しかし、成体宿主の腎臓嚢の下に移植された胚性LNの成長が損なわれるため、この技術の使用は制限されます。
LNと脂肪沈着物は解剖学的に密接に関連しており、胚形成中に同時に発生します。私たちは最近、LN/脂肪組織の会合が、LNの間質細胞前駆細胞の供給に重要な役割を果たしていることを示しました。特に、LTβRを介したシグナル伝達は、脂肪形成を阻害し、代わりにLN間質細胞表現型14への成熟を促進することにより、脂肪細胞前駆細胞の運命を制御する。ここでは、発生中のLN中の脂肪組織由来細胞の追跡を可能にするLN脂肪パッドキメラの生成に基づく方法について説明します。この方法は、脂肪組織の異なるLN間質細胞集団への寄与を決定するのに役立ち、遺伝子改変マウス系統の組織の使用と組み合わせることで、異なるLN間質細胞サブセットの分化を制御するメカニズムをよりよく理解できるようになります。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Σ</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Sterilin ペトリ皿</td><td>アップルトンウッズ</td><td>SC265</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Sterilin ペトリ皿</td><td>アップルトンウッズ</td><td>SC260</td><td></td></tr><tr><td>接着スライド</td><td>Surgipath</td><td>00202</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス CD31 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0311</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス CD4 アレクサ 647</td><td>eBioscience</td><td>51-0041</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD45 PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス IgM ローダミン レッド</td><td>ストラテック</td><td>715-296-020-JIR</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス ポドプラニン PE/Cy7</td><td>バイオレジェンド</td><td>127411</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス ポドプラニン精製</td><td>eBioscience</td><td>14-5381</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ D</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td>11088858001</tr><tr><td>DMEM ミディアム</td><td>シグマ</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>シグマ</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子 イノックス バイオロジー</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>胚および新生児解剖用の極細鉗子</td></tr><tr><td>EDTA溶液 0.5 M</td><td>シグマ</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>ERTR-7</td><td>生合成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>シグマ</td><td>F9665</td><td></td></tr>硬化<tr><td>微細虹彩はさみストレート11cmFST14090-11</td><td></td><td></td>解<td>剖HEPES溶液用の小さなはさみ</td></tr><tr><td></td><td>シグマ</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>イソポアメンブレンフィルター0.8 &mu;m ATTP</td><td>Millipore</td><td>ATTPO 1300</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>蓋付きプラスチックボックス</td><td>ワトキンスとドンカスター</td><td>E6052</td><td>in vitro臓器培養用のサンドイッチボックスです。蓋に2つの穴を開けて、CO2インキュベーターでガス交換できるようにします。</td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム</td><td>シグマ</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>スポンジ バルカン アンダーラップ</td><td>パターソン メディカル</td><td>004383</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ95</td><td>ズーム付き解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5436</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド 埋込媒体 DAPI</td><td>付き Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

リンパ節間質細胞起源の研究のためのリンパ節脂肪パッドキメラの生成

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

間質はリンパ節の構造と機能の主要な構成要素です。しかし、その起源、正確な細胞組成、およびその形成を支配するメカニズムについてはほとんど知られていません。リンパ節は常に脂肪組織にカプセル化されており、最近、リンパ節間質の形成に対するこの関係の重要性を示しました。脂肪細胞前駆細胞は、その発生中にリンパ節に移動し、Lymphotoxin-b受容体が関与すると、脂肪形成をオフにしてリンパ系間質細胞に分化します(Bénézechら。14)脂肪組織のリンパ間質電位に基づき、リンパ節間質細胞前駆細胞の系統追跡を可能にするリンパ節/脂肪パッドキメラを用いた方法を提示する。新生児のリンパ節とEYFP+胚性脂肪組織を分離し、LN/EYFP+脂肪パッドキメラを作る方法を示します。宿主マウスの腎臓嚢の下に移植した後、リンパ節は局所脂肪組織前駆細胞を取り込み、その形成を終えます。得られたリンパ節のEYFP+脂肪パッド細胞の子孫解析は、酵素的に消化されたリンパ節のフローサイトメトリー解析、またはリンパ節凍結切片の免疫蛍光解析によって行うことができます。この方法は、異なるノックアウトマウスモデルの脂肪パッドを使用することにより、異なるリンパ節間質細胞集団の起源を分析する効率的な方法を提供します。

移植から3週間後、腎臓からLN/脂肪組織キメラを回収します。この時点でのキメラは、自身の脂肪組織内にある正常なLNと非常に類似しており、脂肪組織の中央にLNが確認できます（図1）。LNが特定できない場合は、腎臓への移植時に喪失した可能性があります。LNの発達に重要である可能性のある遺伝子の役割を評価する場合、回収されるLNが非常に小さいままであり、発見がより困難になることがあります。これは、LTβR-/-マウス由来の脂肪組織を新生児LNと再結合させた場合に当てはまります14。
LNを慎重に単離することで、EYFP+ 脂肪由来細胞の子孫のさらなる解析が可能になります。LNの凍結切片および免疫蛍光解析により、EYFP+ 脂肪由来細胞がLNへと遊走し、Gp38+ERTR-7+ LN基質細胞ネットワークに寄与することが明らかになりました（Figure 2A）。フローサイトメトリー解析により、L...

リンパ節間質細胞の起源を研究するためのリンパ節/脂肪パッドキメラの生成について記載しています。この方法は、新生仔マウスおよび胚性脂肪パッドからのリンパ節の単離、キメラリンパ節脂肪パッドの生成、および宿主マウスの腎臓嚢下でのそれらの移動を含む。

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

この手順の全体的な目的は、リンパ節ストロマの形成における脂肪組織の寄与を評価するために、リンパ節脂肪パッドキメラを作製することです。まず、新生マウスからリンパ節を、胎生18.5日のマウス胚から脂肪パッドをそれぞれ単離します。その後、胚の脂肪パッドからリンパ節を取り除き、そこに新生マウスのリンパ節を移植します。リンパ節脂肪組織キメラは、新生児のリンパ節1つと胚の脂肪組織1つをin vitroで再結合させ、その後培養することで構築されます。次いで、このキメラを宿主マウスの腎被膜下に移植します。移植から3週間後、腎臓を採取し、キメラを回収します。最終的に、脂肪組織由来細胞のリンパ節ストローマへの寄与は、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡分析によって評価できます。もともと、脂肪組織からの細胞がリンパ節の形成に寄与しているかどうかを評価する方法を探していた際に、この手法を考案しました。新生児の鼠径リンパ節を単離します。頭部を切り離した後、はさみを用いて、胸部上端から腹部下端まで動物の体を切開します。腹腔からすべての内臓を慎重に取り除いた後、体をRF 10培地を入れた90 mmシャーレに置きます。シャーレを滅菌済みの組織培養フードに入れ、体を新鮮なRF 10を入れた新しい滅菌済み90 mmシャーレに移します。次に、鼠径部の皮膚から腹膜を慎重に剥離し、脂肪組織内の3本の血管が交差する位置にある鼠径リンパ節を確認します。脂肪組織が完全に除去されていることを確認しながら、リンパ節を注意深く取り出します。次に、胚18.5日目の鼠径部脂肪体（inguinal fat pads）を分離するため、氷上のRF 10培地が入った50 mmペトリ皿にリンパ節を移します。先ほど実演したように内臓を取り除いた後、体表を滅菌PBSで洗浄し、血液の痕跡をすべて取り除きます。洗浄済みの個体を新しい90 mmペトリ皿に移し、腹膜を剥離して鼠径リンパ節を特定し、デモンストレーションで示した通りに摘出します。分離した組織は廃棄してください。脂肪組織キメラの汚染を防ぐため、リンパ節全体を確実に摘出するように注意してください。次に、鼠径脂肪体を摘出し、氷上のRF 10培地が入った50 mmペトリ皿に移します。in vitro器官培養システムを構築するため、まずVulcanアンダーラップを1〜1.5 cm²のサイズに切断します。その後、スポンジを蒸留水で2時間、フィルターを20分間煮沸し、細胞培養フード内で数時間乾燥させます。材料が乾燥したら、2 mLの培地を入れた50 mmペトリ皿にスポンジを1枚ずつ入れます。各スポンジを培地に浸して両面を濡らし、in vitro器官培養システムの液体空気界面にフィルターを1枚ずつ配置します。次に、胚性脂肪組織1つと新生児リンパ節1つを、各フィルターの最上部に直接、注意深く再結合させます。ペトリ皿を、底に水が入っており、蓋に穴が開いた長方形のプラスチックボックスに移します。穴が開いたままの状態にして、蓋をボックスにテープで固定します。その後、ボックスを37 °C、5% CO2の細胞培養インキュベーターに入れます。ボックスを2時間静置して平衡化させた後、蓋の穴をテープで密封します。組織を少なくとも2日間インキュベートし、移植の3〜4週間後に腎被膜下へ移行させる前に、リンパ節が脂肪パッドに付着するようにします。各腎臓内の各リンパ節脂肪パッドキメラを分離し、リンパ節を切り出します。次に、各リンパ節について、小さなハサミを用いて組織に1箇所切開を加え、酵素消化を促進させます。続いて、各リンパ節を、600 µLの消化バッファーを入れた個別の1.5 mLエッペンドルフチューブに1つずつ入れます。チューブを振盪機能付きサーマルブロックを用いて37 °Cで30分間インキュベートし、組織の解離を助けるために10分ごとにピペッティングを行います。次に、チューブに6 µLのEDTAを加え、細胞懸濁液を数回ピペッティングして解離を完了させます。その後、目的の抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーで解析することで、強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）の発現を保持できます。リンパ節を3～4時間固定します。次に、リンパ節ごとに、冷やしたOCTコンパウンドを1滴、小さなアルミホイルの上に落とします。気泡が入らないように注意しながら、各液滴の中央にリンパ節を1つずつ配置し、ホイルをドライアイスの上に置いて組織を凍結させます。その後、リンパ節を切片化し、染色して、蛍光顕微鏡で解析することができます。リンパ節を注意深く単離することで、EYFP陽性の脂肪由来細胞の子孫をさらに解析することが可能になります。リンパ節の凍結切片および免疫蛍光解析により、EYFP陽性の脂肪由来細胞がリンパ節へと遊走し、GP38陽性かつER-TR7陽性のリンパ節ストローマ細胞ネットワークに寄与していることが明らかになります。フローサイトメトリー解析により、リンパ節ストローマ細胞の重要な割合が局所のEYFP陽性脂肪組織前駆細胞に由来していることが確認され、CD45陰性GP38陽性CD31陰性の線維芽細胞分画の30%、およびCD45陰性GP38陰性CD31陽性の血管内皮細胞分画の10%を構成しています。CD45陰性GP38陽性CD31陰性の線維芽細胞分画の最大80%が脂肪組織前駆細胞に由来する場合があり、これはリンパ節ストローマの成長を維持する上で脂肪組織が果たす極めて重要な役割を示しています。したがって、リンパ系器官形成分野の研究者がこの手法を習得すれば、リンパ系ストローマに関与する様々な分子の役割を探索することが可能になります。

generation-lymph-node-fat-pad-chimeras-for-study-lymph-node-stromal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

リンパ節間質細胞の起源を研究するためのリンパ節-脂肪パッドキメラの生成

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間肩甲膜白脂肪パッドへのラット乳腺上皮細胞移植

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マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

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腫瘍形成中の抗原特異的CD8+ T細胞の動態を評価するためのリンパ節転移モデル

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マウス脾臓組織形成研究のための基底膜マトリックスカプセル化細胞凝集

学ぶリンパ節脂肪パッドキメラの作製法。新生マウスのリンパ節と胚脂肪パッドを分離し、体外で再構成して腎被膜下に移植することで、脂肪組織由来細胞がリンパ節間質形成に寄与する機構を解明します。

リンパ節間質細胞起源の研究のためのリンパ節脂肪パッドキメラの生成

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