リンパ節間質細胞起源の研究のためのリンパ節脂肪パッドキメラの生成

この手順の全体的な目標は、リンパ節間質の形成に対する脂肪組織の寄与を評価するために、リンパ節脂肪パッドキメラを生成することです。これは、最初に新生仔マウスからリンパ節を分離し、18.5日目のマウス胚から脂肪パッドを分離することによって達成されます。リンパ節は胚性脂肪パッドから除去され、新生児のリンパ節に置き換えられます。

リンパ節脂肪パッドキメラは、1つの新生児リンパ節をin vitroで1つの胚性脂肪パッドと再結合して培養することによって組み立てられます。次に、キメラを宿主マウスの腎臓嚢の下に移植します。移植から3週間後、腎臓を採取し、キメラを回収します。

最終的に、脂肪パッド由来細胞のリンパ節間質への寄与は、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡分析によって評価できます。ですから、私たちは最初にこの方法のアイデアを持っていました 脂肪パッドからの細胞 リンパ節の形成に寄与している 新生児の鼠径リンパ節を分離するために。頭を切片にした後、ハサミを使って動物の体を胸部の上部から腹部の下部まで開きます。

腹腔からすべての内臓を慎重に取り除いた後、RF 10メディアが入った90ミリメートルのシャーレに体を置きます。ディッシュを滅菌組織培養フードに入れ、新鮮なRF 10を含む新しい滅菌90ミリメートルペトリディッシュに体を移します。次に、鼠径部の皮膚から腹膜を慎重に剥がし、脂肪パッドの3つの血管の交点に位置する鼠径リンパ節を見つけます。

リンパ節を慎重に切除し、すべての脂肪組織が除去されていることを確認します。次に、リンパ節を氷上のRF 10培地を含む50ミリメートルのペトリ皿に入れて、18.5日目の胚から鼠径部脂肪パッドを分離します。先ほどの方法で内臓を取り除いた後、血液の痕跡をすべて取り除くために、無菌PBSで体を洗います。

洗浄した体を新しい90ミリメートルのシャーレに移し、次に腹膜を剥離し、鼠径リンパ節を局在化して、示したようにそれを取り除きます。分離された組織を廃棄します。脂肪パッドキメラの汚染を避けるために、リンパ節全体を切除するように注意してください。

次に、鼠径部脂肪パッドを取り外し、氷上のRF 10メディアを含む50ミリメートルのシャーレに入れます。in vitro臓器培養システムをセットアップするには、まず、ラップの下にいくつかのバルカンを1〜1.5平方センチメートルの小片にカットします。その後、スポンジを2時間、フィルターを蒸留水で20分間煮沸し、細胞培養フードで数時間乾燥させます。

材料が乾いたら、2ミリリットルのメディアが入った50mmのシャーレに各スポンジを1つずつ入れます。各スポンジを培地に浸して両面を濡らし、in vitro臓器培養システムごとに1つのフィルターを液体空気界面に配置します。次に、1つの胚性脂肪パッドと1つの新生児リンパ節を各フィルターの上部に直接慎重に再結合します。

ペトリ皿を長方形のプラスチックの箱に移し、底に水があり、蓋に穴が開いています。穴を開けたまま、蓋をボックスにテープで固定します。次に、ボックスを摂氏37度の5%CO2細胞培養インキュベーターに入れます。

ボックスを2時間平衡化してから、蓋の穴をテープで塞ぎます。移植後3〜4週間、腎臓嚢の下に移植する前に、リンパ節が脂肪パッドに付着できるように、組織を少なくとも2日間インキュベートします。各腎臓内の各リンパ節脂肪パッドキメラを分離し、リンパ節を解剖します。

次に、リンパ節ごとに、小さなハサミを使用して組織を1回切開し、酵素消化を助けます。次に、1つのリンパ節を、600マイクロリットルの消化緩衝液を含む個々の1.5ミリリットルのeinorチューブにそれぞれ留置します。チューブを摂氏37度で30分間インキュベートし、攪拌サーマルブロックで10分ごとにピペッティングして組織の解離を助けます。

次に、6マイクロリットルのEDTAをチューブに加え、細胞懸濁液を数回三重化して解離を終了します。その後、細胞を目的の抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析して、増強された黄色蛍光タンパク質またはEYFP発現を保存できます。リンパ節を3〜4時間固定します。

次に、リンパ節ごとに、冷たいOCT化合物を1滴、アルミホイルの小片に置きます。気泡を避けて、各滴の中央に1つのリンパ節を慎重に配置し、次にホイルをドライアイスの上に置いて組織を凍結します。その後、リンパ節を切片化し、染色し、蛍光顕微鏡で分析することができます。

リンパ節のP慎重な単離により、EYFP陽性脂肪由来細胞の子孫のさらなる分析が可能になります。リンパ節のクライオ切片と免疫蛍光分析により、EYFP陽性脂肪由来細胞がリンパ節に移動し、GP 38陽性E RTR7陽性リンパ節間質細胞ネットワークの流れに寄与することが明らかになりました サイトメトリー分析は、リンパ節間質細胞の重要な画分が、CD 45陰性G38陽性CD31陰性線維芽細胞の30%に寄与する局所EYFP陽性脂肪組織前駆細胞に由来することを確認しますCD45の10%、および陰性のGP38陰性CD31陽性の血液内皮細胞分画の最大80%のCD45、陰性のG38陽性CD31の陰性線維芽細胞分画は、脂肪組織前駆細胞細胞から得ることができ、脂肪組織がリンパ節間質の成長を維持する上で果たす重要な役割を実証する。だから、リンパ系器官形成の分野の研究者と一緒にこの技術を習得して、リンパ系外傷に関与するさまざまな分子の役割を探求しました。