リンパ節間質細胞起源の研究のためのリンパ節脂肪パッドキメラの生成

この手順の全体的な目的は、リンパ節ストロマの形成における脂肪組織の寄与を評価するために、リンパ節脂肪パッドキメラを作製することです。まず、新生マウスからリンパ節を、胎生18.5日のマウス胚から脂肪パッドをそれぞれ単離します。その後、胚の脂肪パッドからリンパ節を取り除き、そこに新生マウスのリンパ節を移植します。

リンパ節脂肪組織キメラは、新生児のリンパ節1つと胚の脂肪組織1つをin vitroで再結合させ、その後培養することで構築されます。次いで、このキメラを宿主マウスの腎被膜下に移植します。移植から3週間後、腎臓を採取し、キメラを回収します。

最終的に、脂肪組織由来細胞のリンパ節ストローマへの寄与は、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡分析によって評価できます。もともと、脂肪組織からの細胞がリンパ節の形成に寄与しているかどうかを評価する方法を探していた際に、この手法を考案しました。新生児の鼠径リンパ節を単離します。頭部を切り離した後、はさみを用いて、胸部上端から腹部下端まで動物の体を切開します。

腹腔からすべての内臓を慎重に取り除いた後、体をRF 10培地を入れた90 mmシャーレに置きます。シャーレを滅菌済みの組織培養フードに入れ、体を新鮮なRF 10を入れた新しい滅菌済み90 mmシャーレに移します。次に、鼠径部の皮膚から腹膜を慎重に剥離し、脂肪組織内の3本の血管が交差する位置にある鼠径リンパ節を確認します。

脂肪組織が完全に除去されていることを確認しながら、リンパ節を注意深く取り出します。次に、胚18.5日目の鼠径部脂肪体（inguinal fat pads）を分離するため、氷上のRF 10培地が入った50 mmペトリ皿にリンパ節を移します。先ほど実演したように内臓を取り除いた後、体表を滅菌PBSで洗浄し、血液の痕跡をすべて取り除きます。

洗浄済みの個体を新しい90 mmペトリ皿に移し、腹膜を剥離して鼠径リンパ節を特定し、デモンストレーションで示した通りに摘出します。分離した組織は廃棄してください。脂肪組織キメラの汚染を防ぐため、リンパ節全体を確実に摘出するように注意してください。

次に、鼠径脂肪体を摘出し、氷上のRF 10培地が入った50 mmペトリ皿に移します。in vitro器官培養システムを構築するため、まずVulcanアンダーラップを1〜1.5 cm²のサイズに切断します。その後、スポンジを蒸留水で2時間、フィルターを20分間煮沸し、細胞培養フード内で数時間乾燥させます。

材料が乾燥したら、2 mLの培地を入れた50 mmペトリ皿にスポンジを1枚ずつ入れます。各スポンジを培地に浸して両面を濡らし、in vitro器官培養システムの液体空気界面にフィルターを1枚ずつ配置します。次に、胚性脂肪組織1つと新生児リンパ節1つを、各フィルターの最上部に直接、注意深く再結合させます。

ペトリ皿を、底に水が入っており、蓋に穴が開いた長方形のプラスチックボックスに移します。穴が開いたままの状態にして、蓋をボックスにテープで固定します。その後、ボックスを37 °C、5% CO2の細胞培養インキュベーターに入れます。

ボックスを2時間静置して平衡化させた後、蓋の穴をテープで密封します。組織を少なくとも2日間インキュベートし、移植の3〜4週間後に腎被膜下へ移行させる前に、リンパ節が脂肪パッドに付着するようにします。各腎臓内の各リンパ節脂肪パッドキメラを分離し、リンパ節を切り出します。

次に、各リンパ節について、小さなハサミを用いて組織に1箇所切開を加え、酵素消化を促進させます。続いて、各リンパ節を、600 µLの消化バッファーを入れた個別の1.5 mLエッペンドルフチューブに1つずつ入れます。チューブを振盪機能付きサーマルブロックを用いて37 °Cで30分間インキュベートし、組織の解離を助けるために10分ごとにピペッティングを行います。

次に、チューブに6 µLのEDTAを加え、細胞懸濁液を数回ピペッティングして解離を完了させます。その後、目的の抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーで解析することで、強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）の発現を保持できます。リンパ節を3～4時間固定します。

次に、リンパ節ごとに、冷やしたOCTコンパウンドを1滴、小さなアルミホイルの上に落とします。気泡が入らないように注意しながら、各液滴の中央にリンパ節を1つずつ配置し、ホイルをドライアイスの上に置いて組織を凍結させます。その後、リンパ節を切片化し、染色して、蛍光顕微鏡で解析することができます。

リンパ節を注意深く単離することで、EYFP陽性の脂肪由来細胞の子孫をさらに解析することが可能になります。リンパ節の凍結切片および免疫蛍光解析により、EYFP陽性の脂肪由来細胞がリンパ節へと遊走し、GP38陽性かつER-TR7陽性のリンパ節ストローマ細胞ネットワークに寄与していることが明らかになります。フローサイトメトリー解析により、リンパ節ストローマ細胞の重要な割合が局所のEYFP陽性脂肪組織前駆細胞に由来していることが確認され、CD45陰性GP38陽性CD31陰性の線維芽細胞分画の30%、およびCD45陰性GP38陰性CD31陽性の血管内皮細胞分画の10%を構成しています。CD45陰性GP38陽性CD31陰性の線維芽細胞分画の最大80%が脂肪組織前駆細胞に由来する場合があり、これはリンパ節ストローマの成長を維持する上で脂肪組織が果たす極めて重要な役割を示しています。したがって、リンパ系器官形成分野の研究者がこの手法を習得すれば、リンパ系ストローマに関与する様々な分子の役割を探索することが可能になります。