骨髄由来マクロファージの生産
November 22nd, 2013
マクロファージは、長い自然免疫と獲得免疫応答の重要な構成要素として認識されている。マクロファージや微生物間の相互作用の進化遺伝的、および生化学的な側面に関する知識の最近の爆発はマクロファージへの科学的関心をリニューアルしました。この記事では、マウスの骨髄からマクロファージを差別化する方法を説明している。
この手順の全体的な目標は、尿、骨髄由来の細胞培養物からマクロファージを生成することです。これは、まずマウスの後肢から骨髄を抽出することによって達成されます。第2のステップでは、骨髄に常在するマクロファージが除去され、次に骨髄細胞がマクロファージ分化条件下でさらに培養されます。
その後、骨髄細胞がマクロファージに分化したら、それらを収集して実験的分析を行うことができます。最終的には、共焦点顕微鏡を使用して、骨髄由来マクロファージ、末端酸性コンパートメント内の細菌性LPSの局在を実証できます。この手法は、マクロファージ、細胞株の増殖などの既存の方法よりも優れているため、数が多いため、一次マクロファージを取得できます。
自己生産ステップは習得が難しく、練習が必要なため、方法の視覚的なデモンストレーションは重要であり、成功を収めるには、安楽死させたマウスの皮膚を70%エタノールで消毒します。各後ろ足の上部に切開を行い、皮膚を足に向かって引き下げて筋肉を露出させます。次に、後ろ足を切り落とし、滅菌ハサミと鉗子を使用します。
皮膚を取り除くには、5ミリリットルの滅菌氷が入った滅菌35ミリメートルのペトリ皿に脚を置きます。コールドPBS。骨に付着している皮膚と筋肉をすべて取り除き、骨を5ミリリットルの氷が入った新しい滅菌ペトリ皿に移します。
冷たく、滅菌されたPBS。さらに5ミリリットルのPBSで骨を2回洗い、次に5ミリリットルの氷が入った滅菌乳鉢に移します。冷たく、滅菌されたPBS。
次に、関節で大腿骨から脛骨を切り取り、乳棒を使用して骨を優しく粉砕します。上清を氷冷した15ミリリットルのチューブに3回集めます。次に、70ミクロンのナイロン製セルストレーナーで組織懸濁液をろ過します。
固形物を取り除くには、濾液をスピンダウンし、上清を静かに捨てます。ペレットを赤血球溶解緩衝液で解離し、30秒後に20ミリリットルの氷冷完全DMEMを追加して反応を停止します細胞を遠心分離した後、ペレットを摂氏37度の20ミリリットルで懸濁し、DMEMを完了し、次に細胞懸濁液を2つの100ミリメートルペトリ皿に分割します。皿を摂氏37度で4時間インキュベートし、次に上清を室温で50ミリリットルのチューブに集めます。
上清をスピンダウンした後、ペレットを、以前に調製したL 9 29細胞上清を補充した10ミリリットルの完全なDMEMに再懸濁し、次いで40ミクロンのナイロン細胞ストレーナーを通じて細胞を濾過する。濾液を140ミリリットルの完全DMEMおよびL 9 29細胞培地に加え、次いで皿当たり10ミリリットルの細胞懸濁液を15 100ミリメートルのペトリ皿に分配する。細胞を摂氏37度で3日間、二酸化炭素5%で10ミリリットルの完全DMEMとL9.29上清でインキュベートした後、さらに4日間細胞をインキュベートします。
倒立顕微鏡で定期的に細胞増殖をモニタリングし、骨髄由来のマクロファージを採取し、まず吸引して上清を廃棄します。次に、完全なDMEMでペトリ皿を2回洗います。次に、摂氏37度の完全DMEMを5ミリリットル加え、ゴム製のポリスマンを使用して細胞を優しく切り離し、骨髄由来のマクロファージを50ミリリットルのチューブに集めてから、細胞をスピンダウンします。
Resusは、20ミリリットルの完全なDMEMでペレットを懸濁します。最後に、トライアムブルーの除外でセルをカウントします。この方法を使用すると、先ほど示したように、骨髄に常在するマクロファージを除いた丸い非接着性骨髄細胞を単離してプレーティングした後、わずか数日で多数のマクロファージを取得できます。
これらの代表的なBMDM前駆細胞をG-M-C-S-Fとインキュベートしました。3日後、細胞は接着し始め、マクロファージに分化しました。7日後、骨髄由来マクロファージのコンフルエント単層が観察されました。
F four 80およびH-L-A-D-Rのフローサイトメトリー解析により、骨髄由来のマクロファージは両方のマーカーを発現していることが明らかになり、骨髄細胞のマクロファージへの分化が確認されました。骨髄由来マクロファージのPHA酸性能力を評価すること。細胞がラテックス速度を内部化する能力は、予想どおりにモニターされました。
細胞あたりのビーズの数は、エンドサイトーシス能を評価するために、時間の経過とともに増加すると判断されました。骨髄由来のマクロファージもCoxiellaと共培養しました。赤のバーネットアイLPSは、青のリソソーム関連膜タンパク質1を抱くコンパートメントに局在していることが観察されましたが、緑のカテプシンDはなく、LPSが後期エンドソームに存在し、骨髄由来マクロファージと予想されるようにリソソームと融合することができないことを示しています。
細菌性病原体の相互作用は、TMA Wiley眼による感染を通じてさらに分析されました。予想通り、赤色の細菌はKPSとDを宿すコンパートメントに局在しておらず、再び緑色で現れます。この代表的な免疫ブロットでは、骨髄由来のマクロファージシグナル伝達経路が評価され、骨髄由来のマクロファージ組織、単離されたマクロファージが大腸菌LPS刺激に応答してリン酸化P38αマップキナーゼレベルをアップレギュレートすることを示しました。
この方法は、細胞内コンパートメントがどの細胞内コンパートメントにマイクロ局在化したかなど、細胞微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。
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概要
この記事では、マウスの骨髄からマクロファージを分化する手法を紹介します。この手順では、骨髄を抽出し、実験分析のために一次マクロファージを生成するために特定の条件下で培養します。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 微生物学
背景
- マクロファージは免疫システムで重要な役割を果たします。
- 最近の進歩により、マクロファージと微生物の相互作用の理解が深まっています。
- 一次マクロファージを生成する方法は研究に不可欠です。
- この研究は、マウスの骨髄からマクロファージを入手する新しいアプローチに焦点を当てています。
研究の目的
- マウスの骨髄からマクロファージを分化する信頼性の高い方法を開発すること。
- マクロファージの機能と相互作用の研究を促進すること。
- 一次マクロファージを大量に得られる技術を提供すること。
使用された方法
- マウスの後ろ脚から骨髄を抽出すること。
- 骨髄から常在マクロファージを除去すること。
- マクロファージ分化条件下で骨髄細胞を培養すること。
- コンフォカル顕微鏡を用いて細菌性LPSのマクロファージ局在を分析すること。
主な結果
- 骨髄細胞からマクロファージへの成功した分化。
- マクロファージにおける細菌性LPSの局在の実証。
- 従来の方法と比較して、大量の一次マクロファージの入手。
- 微生物刺激に対するマクロファージの挙動の理解の向上。
結論
- この方法は一次マクロファージを生成する効果的な方法を提供します。
- このアプローチは様々な実験分析に適用できます。
- 将来の研究では、これらのマクロファージを利用して免疫応答を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Obtaining primary macrophages from bone marrow enables physiologically relevant modeling of host-pathogen interactions and immune responses. This method supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing scalable access to disease-relevant immune cells. The approach enhances predictive confidence in preclinical models by reducing reliance on immortalized cell lines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of macrophage-mediated pathways in infectious disease and inflammation models.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary macrophages for consistent target engagement studies.
- Scientific Value: Supports functional validation of immunomodulatory targets through phagocytosis and cytokine assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized macrophage populations for reproducible compound screening in immunology assays.
- Operational Value: Enables high-throughput preparation of differentiated cells for assay reproducibility across sites.
- Scientific Value: Facilitates quantitative readouts such as LPS localization and bead uptake for mechanistic screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human macrophage behavior in preclinical studies of bacterial persistence and intracellular survival.
- Operational Value: Supports longitudinal infection models using pathogens like Coxiella to evaluate therapeutic candidates.
- Scientific Value: Enables biomarker-aligned readouts such as phosphorylated p38 MAPK activation in response to LPS.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, providing a scalable source of primary immune cells for mechanistic and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing in host-pathogen interactions by enabling controlled macrophage-pathogen co-culture experiments.
- Screening: Delivers assay-ready macrophages with quantifiable outputs like internalization kinetics and signaling activation.
- Analytics: Enables confocal microscopy and flow cytometry for high-content analysis of macrophage phenotype and function.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through disease-relevant immune cell models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for generating primary macrophages across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive validity of immunology and infectious disease models through primary cell use.
- Operational Value: Reduces variability and enhances reproducibility in macrophage-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by de-risking target mechanisms in physiologically relevant systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory and anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic tissue harvest and primary cell culture techniques.
- Depends on access to L929 cell supernatant or M-CSF for macrophage differentiation.
- Necessitates standardized protocols for bone marrow extraction and macrophage quantification across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to human or other species bone marrow sources.
- Limited by the need for sterile conditions and timed differentiation steps to ensure macrophage purity and yield.
