骨髄由来マクロファージの生産

この手順の全体的な目標は、尿、骨髄由来の細胞培養物からマクロファージを生成することです。これは、まずマウスの後肢から骨髄を抽出することによって達成されます。第2のステップでは、骨髄に常在するマクロファージが除去され、次に骨髄細胞がマクロファージ分化条件下でさらに培養されます。

その後、骨髄細胞がマクロファージに分化したら、それらを収集して実験的分析を行うことができます。最終的には、共焦点顕微鏡を使用して、骨髄由来マクロファージ、末端酸性コンパートメント内の細菌性LPSの局在を実証できます。この手法は、マクロファージ、細胞株の増殖などの既存の方法よりも優れているため、数が多いため、一次マクロファージを取得できます。

自己生産ステップは習得が難しく、練習が必要なため、方法の視覚的なデモンストレーションは重要であり、成功を収めるには、安楽死させたマウスの皮膚を70%エタノールで消毒します。各後ろ足の上部に切開を行い、皮膚を足に向かって引き下げて筋肉を露出させます。次に、後ろ足を切り落とし、滅菌ハサミと鉗子を使用します。

皮膚を取り除くには、5ミリリットルの滅菌氷が入った滅菌35ミリメートルのペトリ皿に脚を置きます。コールドPBS。骨に付着している皮膚と筋肉をすべて取り除き、骨を5ミリリットルの氷が入った新しい滅菌ペトリ皿に移します。

冷たく、滅菌されたPBS。さらに5ミリリットルのPBSで骨を2回洗い、次に5ミリリットルの氷が入った滅菌乳鉢に移します。冷たく、滅菌されたPBS。

次に、関節で大腿骨から脛骨を切り取り、乳棒を使用して骨を優しく粉砕します。上清を氷冷した15ミリリットルのチューブに3回集めます。次に、70ミクロンのナイロン製セルストレーナーで組織懸濁液をろ過します。

固形物を取り除くには、濾液をスピンダウンし、上清を静かに捨てます。ペレットを赤血球溶解緩衝液で解離し、30秒後に20ミリリットルの氷冷完全DMEMを追加して反応を停止します細胞を遠心分離した後、ペレットを摂氏37度の20ミリリットルで懸濁し、DMEMを完了し、次に細胞懸濁液を2つの100ミリメートルペトリ皿に分割します。皿を摂氏37度で4時間インキュベートし、次に上清を室温で50ミリリットルのチューブに集めます。

上清をスピンダウンした後、ペレットを、以前に調製したL 9 29細胞上清を補充した10ミリリットルの完全なDMEMに再懸濁し、次いで40ミクロンのナイロン細胞ストレーナーを通じて細胞を濾過する。濾液を140ミリリットルの完全DMEMおよびL 9 29細胞培地に加え、次いで皿当たり10ミリリットルの細胞懸濁液を15 100ミリメートルのペトリ皿に分配する。細胞を摂氏37度で3日間、二酸化炭素5%で10ミリリットルの完全DMEMとL9.29上清でインキュベートした後、さらに4日間細胞をインキュベートします。

倒立顕微鏡で定期的に細胞増殖をモニタリングし、骨髄由来のマクロファージを採取し、まず吸引して上清を廃棄します。次に、完全なDMEMでペトリ皿を2回洗います。次に、摂氏37度の完全DMEMを5ミリリットル加え、ゴム製のポリスマンを使用して細胞を優しく切り離し、骨髄由来のマクロファージを50ミリリットルのチューブに集めてから、細胞をスピンダウンします。

Resusは、20ミリリットルの完全なDMEMでペレットを懸濁します。最後に、トライアムブルーの除外でセルをカウントします。この方法を使用すると、先ほど示したように、骨髄に常在するマクロファージを除いた丸い非接着性骨髄細胞を単離してプレーティングした後、わずか数日で多数のマクロファージを取得できます。

これらの代表的なBMDM前駆細胞をG-M-C-S-Fとインキュベートしました。3日後、細胞は接着し始め、マクロファージに分化しました。7日後、骨髄由来マクロファージのコンフルエント単層が観察されました。

F four 80およびH-L-A-D-Rのフローサイトメトリー解析により、骨髄由来のマクロファージは両方のマーカーを発現していることが明らかになり、骨髄細胞のマクロファージへの分化が確認されました。骨髄由来マクロファージのPHA酸性能力を評価すること。細胞がラテックス速度を内部化する能力は、予想どおりにモニターされました。

細胞あたりのビーズの数は、エンドサイトーシス能を評価するために、時間の経過とともに増加すると判断されました。骨髄由来のマクロファージもCoxiellaと共培養しました。赤のバーネットアイLPSは、青のリソソーム関連膜タンパク質1を抱くコンパートメントに局在していることが観察されましたが、緑のカテプシンDはなく、LPSが後期エンドソームに存在し、骨髄由来マクロファージと予想されるようにリソソームと融合することができないことを示しています。

細菌性病原体の相互作用は、TMA Wiley眼による感染を通じてさらに分析されました。予想通り、赤色の細菌はKPSとDを宿すコンパートメントに局在しておらず、再び緑色で現れます。この代表的な免疫ブロットでは、骨髄由来のマクロファージシグナル伝達経路が評価され、骨髄由来のマクロファージ組織、単離されたマクロファージが大腸菌LPS刺激に応答してリン酸化P38αマップキナーゼレベルをアップレギュレートすることを示しました。

この方法は、細胞内コンパートメントがどの細胞内コンパートメントにマイクロ局在化したかなど、細胞微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。