Name: BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学ぶボツリヌス神経毒素の定量法。複雑なマトリックスから免疫沈降と蛍光タンパク質レポーターを用いて、食品や環境サンプル中のBoNT活性を高感度に検出・定量化する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、貴重な議論やアドバイスをH·オリバーレスとDルーゲに感謝したいと思います。この研究は、NSFのSBIR賞（BioSentinel社へIIP-1127245）と国防省の契約（BioSentinel社へW81XWH-07-2から0045）によって部分的にサポートされていました。

FMの督促、TM広場、F. Zeytin、トイレタッカーはBioSentinel株式会社BioSentinelの従業員または所有者である現在、製造、本報告書で提示された試薬の一部を商品化しました。

このプロトコルは、複雑なマトリックス中のBoNT / A複雑、ホロ毒素、またはクロストリジウム培養上清を定量化するための手順について説明します。アッセイ感度は血清型およびアッセイ間で変化するが、56,60それぞれのマトリクスアッセイと他のBoNT血清型（ 例えばのBoNT / B、E、およびF）をテストする際のプロトコルは、しかし、同じです。このプロトコルは、可能な試料の種類毎に考慮していない、いくつかの改変は、特定のサンプル組成物および所望の用途に応じて必要とされ得る。マトリックスは、食品試料（ 例えば 、食品負荷試験）又は医薬賦形剤の緩衝液（ 例えばなBoNTベースの薬剤製品試験）を含むことができる。複雑な食料品以外（ 例えば動物の組織または環境的）液体と固体のサンプルは、食品サンプルとして扱う必要があります。このプロトコルは、200μl/ウェルのサンプルのボリュームを使用していますが、50μL/ウェル10倍バインディンの容量に対応する調整をテストすることができるように、わずかGバッファ。 50μLより小さいサンプルは、試...

ボツリヌス神経毒素（BoNTを）が知られている最も致命的な物質で、1〜3 NGと推定静脈人間の致死量に/ 1,2キロ。七つのBoNT血清型は構造的に類似し、Gを介して標識され、各々は、サイトゾルと亜鉛エンドペプチダーゼ3-5をコードする軽鎖への細胞結合、取り込み、および転座に関与する重鎖ドメインからなる、存在する。部分的には、その具体的な結合および神経筋接合部6での運動ニューロンへのエントリーからのBoNT結果の絶妙な毒性。一旦ニューロンの内部に、軽鎖エンドペプチダーゼを特異的に切断する可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質レセプター（SNARE）小胞融合に必要なタンパク質の1つ以上が、神経伝達物質放出を阻害し、弛緩性麻痺7-14をもたらす。一般的疾患」ボツリヌス中毒」のBoNTによる横隔膜や肋間筋の麻痺として知られ、最終的には、その結果早期診断と治療しない限り、呼吸不全や死を受けている。 人間の食品媒介性ボツリヌス症は、最も一般的なBoNT血清型A、B、Eに関連付けられており、通常は、F（BoNT / A型、のBoNT / B 等 ）とは汚染された食物15,16の摂取に起因される。たが、創傷ボツリヌス中毒のいくつかのケース静脈内薬物使用者の間で報告された17,18。米国では、1歳未満の子供によるクロストリジウム胞子の摂取による乳児ボツリヌス症は、ボツリヌス中毒19〜21の中で最も一般的な形式です。しかし、不適切な家庭缶詰食品加工に起因する食中毒のBoNTのアウトブレイクは、米国および海外の両方で報告された。 2000-2009の間、食品媒介性ボツリヌス症の少なくとも338例は6死亡例22を含め世界的に報告された。迅速かつ高感度に食中毒ボツリヌス中毒の発生を検出する能力は、早期診断を支援することができ、重要な指標である23,24。さらに、費用対効果の高い、日常食品検査できるように検出方法が改善された食料安全保障につながる。 のBoNTの神経細胞の特異性と生物学的半減期が長く、また、それ強力な治療になります。米国において、BoNT系薬剤は、化粧品の条件や眉間のしわ、頸部ジストニア、片頭痛、過活動膀胱、および斜視などの神経筋関連障害の治療のための食品医薬品局（FDA）によって承認されています。多数の「適応外」アプリケーションは、重度の筋機能不全のため25〜28高用量治療を含む、文書化されています。過剰投与が潜在的に有害な副作用のリスクがある患者を置くながら過少が無効治療につながる可能性がある正確な毒素定量化は、正しい投与のために重要である。残念ながら、標準化された効力アッセイプロトコルはなBoNTに基づく薬剤のprodu間の単位定義不平等で、その結果、製造業者間で共有されていないCTS 29〜31。 のBoNTのための標準的な試験は、のBoNT含有試料をマウスに腹腔内注射し、死亡者の数は1〜7日以上16,32,33が記録されたマウスのバイオアッセイである。マウスバイオアッセイは、5月10日PGのBoNT / A 34の検出限界（LOD）と非常に敏感であるが、動物使用上の倫理的な問題、高い人材育成のコストと動物施設、長いアッセイ時間、および欠如を維持標準化されたプロトコルは標準化された、アニマルフリーのBoNTテストおよび定量方法35-39を開発するために呼び出しされた。最近、いくつかの代替のBoNT定量法は、マウスまたはそれに近いマウスバイオアッセイ感度40-49を提供することが開発された。これらの方法には、一般的に、蛍光、質量分析、または免疫学的方法を使用し、動物を使用することなく、マウスのバイオアッセイよりもかなり短いアッセイ時間を提供します。免疫学的techniqと組み合わせた質量分析のアプローチUEは、食品やその他の複雑なサンプルに含まれているのBoNTを検出し、定量化することが示されたが、人材育成の必要条件と特殊な装置の制限これらのアッセイは、50〜55。他のほとんどの代替のアッセイは、複雑なサンプル試験に容易に適用できないか、日常的なBoNTのテストに必要なスループットを欠いている。のBoNTの極端な効力に一致するように感度のインビトロアッセイ法を開発しようとする食品サンプルの粘度、pH、塩分、およびマトリックス構成成分の高度に可変性は、特に困難な挑戦を提示する。さらに、このようなBoNT系医薬品の再懸濁に起因するものなどであっても、単純で、比較的良性の緩衝系は、有意にインビトロ効力のBoNT 56影響を及ぼす塩、アルブミン、および糖安定剤（ すなわち、賦形剤）を含有する。毒素精製は、サンプル56〜59の最も単純ますが、すべての正確な活性試験のために必要である。 ザ·BoTestマトリックスアッセイは迅速で高スループットのために設計されており、一般的に研究室56,60で見つかった機器を使用して、高度に複雑なサンプルからのBoNTの一貫した定量化された。これらのアッセイは、共有結合的に結合して、サンプルからのBoNTを封鎖した後、洗浄することによってマトリックス化合物を干渉除去して血清型特異的抗のBoNT抗体に連結常磁性ビーズを使用しています。洗浄後、結合したBoNTタンパク質分解活性は、その後のBoNT血清型は、試験されると互換性のレポーターを用いて最適化反応バッファー中で定量化される。これらのレポーターは、N末端シアン蛍光タンパク質（CFP）部分とを構成するBoNT基板、SNAP25残基141から206またはシナプトブレビン残基33から94で連結されたC末端黄色蛍光タンパク質誘導体（ヴィーナス）部分からなる蛍光性タンパク質であるBoTest A / EまたはB / D / F / Gの記者、それぞれ45。のBoNTによるレポーター切断は、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて監視される。ときはT彼記者は、CFPの励起はCFP発光と刺激的な金星発光が消光、金星にFRETの結果、無傷である。のBoNTによるレポーターの切断は、CFP発光と金星排出量の減少の増加につながる、FRETを防ぐことができます。活性のBoNT次いで定量的にCFPと金星の発光の比率を用いて測定することができる。 3視聴以下LODは、ハイスループットの96ウェルプレートフォーマットを使用して、食品56の広い範囲から可能である。アッセイは、ビーズ表面上の毒素の濃度を可能にするので、感度の増加は、より大きな試料体積を用いて得ることができる。 のBoNT A、B、E、およびFのためのBoTestマトリックスアッセイは、食品、製薬、環境試料56,60を使用して開発し、試験した。ここでは、（ 例えば 、食品、環境）のサンプル低複雑でのBoNTの検出のためのこれらのアッセイを実行するための手順（ 例えば医薬品、バッファ内のBoNT）と高い複雑性を説明しています。具体的な処理方法いくつかのサンプルタイプについて、このプロトコルで扱われており、ここでは説明しない試料の種類は、通常、提示される方法の組み合わせを使用して適合させることができる。プロトコルが開発され、テストのBoNT / Aであるが他の場所で56,60実証されたように、それぞれのアッセイを使用して他のBoNT血清型に適用可能であるした。

<table><tbody><tr><td>BoTest Matrix A ボツリヌス神経毒検出キット</td><td>BioSentinel</td><td>A1015</td><td>BoNT/BおよびF用の検出キットもご用意しています。</td></tr><tr><td>Varioskan Flash蛍光マイクロプレートリーダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>5250040</td><td>励起波長が434 nm、蛍光波長が470 nm、526 nmのモノクロメーターまたはフィルターベースのほとんどのユニットを使用することができます。</td></tr><tr><td>96ウェル磁気ビーズ分離プレート</td><td>V&P Scientific</td><td>VP771H</td><td>他の磁気プレートを使用することもできますが、プレートはビーズをウェルの側面に分離するように設計する必要があります。</td></tr><tr><td>磁気ビーズ対応プレートウォッシャー</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>オプション、自動プレート洗浄にのみ必要です。&nbsp;他の磁気ビーズ互換プレートワッシャーも使用できますが、使用前にテストする必要があります。</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td></td><td></td><td>オプションで、遠心分離が必要なサンプルにのみ必要です。</td></tr><tr><td>MixMate プレートミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td></td><td></td><td>室温または25°Cで使用。C 温度制御が可能な場合</td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠</td><td>ロシュ</td><td>4693132001</td><td>食品または環境試験にのみ必要です。プロテアーゼ阻害剤はEDTAフリーでなければなりません。</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>メタバイオロジクス</td><td></td><td>オプション、標準化および定量化の目的でのみ必要</td></tr><tr><td>ブラック、フラットボトム 96ウェルプレート</td><td>NUNC</td><td>237105</td><td>プレートは処理すべきではない</td></tr><tr><td>96ウェルプレートシーリングテープ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

botestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

複雑なマトリックス中のボツリヌス神経毒素（BoNT）の正確な検出および定量は、製薬、環境、食品サンプルのテストに必要とされる。正確な効力試験をするBoNTベースの薬剤製品の製造および患者の安全のために必要であるが、食品の急速なBoNT試験は流行フォレンジック、患者の診断、および食品の安全性試験の際に必要となります。のBoNTテストのための広く使用されているマウスのバイオアッセイは、高感度であるが、迅速かつ日常的なBoNTのテストに必要な精度とスループットを欠いている。さらに、動物のバイオアッセイの使用はのBoNTテストのためのマウスのバイオアッセイに代わる米国および海外での薬物製品の規制当局や動物の権利の支持者による通話をもたらしました。いくつかのインビトロ置換アッセイは、単純な緩衝液中で精製されたBoNTでうまく機能するよう開発されてきたが、ほとんどは、非常に複雑なマトリックス中の試験に適用可能であることが示されていない。ここで、検出のためのプロトコルBoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックス中のBoNTが提示されている。検定は3つの部分から構成されています。最初の部分はテストのためのサンプルの調製を含む、第二部は、マトリックスからのBoNTを精製する抗のBoNT抗体でコーティングされた常磁性ビーズを用いて免疫沈降ステップであり、3番目の部分は分離されたBoNTのタンパク質分解を定量化蛍光性レポーターを使用して、アクティビティ。プロトコルは、液体および固体の両方の行列を用いて96ウェルプレートでハイスループット試験のために書かれ4-26時間の合計アッセイ時間は、試料の種類、毒素負荷、および所望の感度に応じた手動製剤の約2時間を必要とする。データは、リン酸緩衝生理食塩水、医薬製品、培養上清を、2％ミルク、新鮮なトマトのBoNT / A試験のために提示され、アッセイの成功のための重要なパラメータの議論を含むている。

記載されたプロトコルにおけるステップを要約した図を図2に示されている。検定は、サンプルの種類と必要なアッセイ感度に応じて、完了するために4月26日時間の間が必要ですが、実践的な時間しか〜2時間。アッセイは、96ウェルプレート中で実施し、実行されるテストのタイプに依存している、プレート当たりの基準を含む最大20個のサンプルの三連の試験を可能にする。 図3は、BoNTを使用して代表的なアッセイの結果を示しています/ホロ毒素をPBSにスパイクおよびA / Eの記者と2、4、および24時間のインキュベーション後に記述されたプロトコルを使用してテスト。精製されたBoNT /ホロ毒素を〜150 kDaで、その定義された分子量は、毒素複合体のためのより広範に定義された700〜900 kDaのに比べので、この実験のために選択され、純度は、正確な濃度で非常に正確なスパイクを許可した。発光比、434での励起後470nmの場合と526 nmでの発光の比率以下、各時点でのBoNT /濃度（MLD <su...

BoTestマトリックスボツリヌス神経毒素（BoNT）検出アッセイは、急速にサンプルマトリックスの範囲からのBoNTを浄化し、定量化する。ここでは、固体と液体の両方の行列からのBoNTの検出および定量のためのプロトコルを提示し、BOTOX、トマト、ミルクを用いたアッセイを示す。

BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

この手順の全体的な目的は、医薬品、環境、食品サンプルなどの複雑なマトリックスにおけるボツリヌス神経毒素のタンパク質分解活性を定量することです。まず、必要に応じて試験サンプルおよび標準曲線サンプルを処理し、適切なpHおよび粘度条件を確立します。次に、抗体コーティング磁気ビーズを用いて、サンプルからボツリヌス神経毒素を免疫沈殿させます。次に、干渉物質を除去するために磁気ビーズを十分に洗浄し、最適化した反応バッファーで再懸濁します。最後に、洗浄したビーズをタンパク質レポーターとともにインキュベートし、時間の経過に伴うレポーターの切断を分光法で測定します。最終的に、検体中のレポーター切断を標準曲線サンプルと比較することで、マウスバイオアッセイに近い感度で検体中のボツリヌス毒素の活性を定量します。マウスを用いた試験、バイオアッセイ、免疫学的測定法、およびその他の蛍光法などの他手法に対する本手法の主な利点は、動物の使用を必要としない点、および食品、環境、医薬品サンプルに含まれる極めて複雑なマトリックスへの適用が実証されている点にあります。一般的に、本手法を初めて行う方は、慎重なサンプル処理と希釈が必要であるため、習得に苦労する可能性があります。本手順のデモンストレーションは、Bio Sentinelの研究員であるDr. Mark Dunningが行います。テキストプロトコルに従って緩衝液を調製し、検体定量のための標準曲線を作成します。50 mLコニカルチューブに10 ± 0.01 gの固体食品試料を量り取り、取り分けておきます。この試料は希釈剤として使用します。2番目のチューブに2 ± 0.01 gの固体食品試料を量り取ります。この2 gの食品試料の表面に、食品1 gあたり30,000 MLD₅₀の最終濃度になるようにボツリヌス神経毒（BoNT）を添加します。希釈剤およびスパイク試料を室温または4 °Cで2時間インキュベートし、BoNTが食品マトリックスと反応する時間を設けます。自然な汚染を模倣するため、その他の試料タイプについてはテキストプロトコルを参照してください。次に、スパイク済みおよび未スパイク済みの試料に、食品1gあたり1mLのGPBを加え、ペッスルを用いて十分に混ざるまで均質化します。10gの希釈試料の概算総量から、2gのスパイク済み試料の総量を外挿します。次に、10 gの希釈剤試料および2 gのスパイク試料に対し、それぞれの全量に基づいた1/10量の10倍中和バッファーを加えます。試料を転倒混和で十分に混ぜ、6,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離して、両試料を部分的に清澄化します。その後、直ちに上清を回収し、スパイク試料をD1、非スパイク試料を希釈剤として新しいチューブに移します。残りの標準曲線用試料を1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で調製します。固形食品サンプルの調製には、まず未知の固形サンプル2 ± 0.01 gを50 mLコニカルチューブに量り取ります。2 mLのGPBを加え、ペッスルを用いてサンプルを均質化します。次に、サンプルの1/10量に相当する10x中和緩衝液を加え、転倒混和して十分に混ぜ合わせます。6,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離を行いサンプルを部分的に清澄化した後、直ちに上清を750 µL以上マイクロ遠心チューブに移します。これは未知試料希釈液1です。未知試料希釈液2および3とラベルを貼った2本のチューブに、希釈液を675 µLずつ加えます。希釈液には、標準曲線の作成に使用したものと同じ処理済みの材料を使用します。希釈液1を75 µL、希釈液2のチューブに移して混合し、連続希釈を行います。次に、希釈液2を75 µL、希釈液3のチューブに移して混合します。サンプルを清澄化するため、14,000 ×g 以上の遠心力で5分間遠心分離します。直ちに上清を除去して新しいチューブに移し、サンプルプレートを準備します。各未知サンプルおよび標準曲線のサンプルD1からD8には3ウェル、サンプルD9には6ウェルが必要であり、それぞれのウェルに10x結合バッファーを20 µLずつ加えます。各サンプルを対応するウェルに200 µLずつ加え、マイクロプレートミキサーを使用してプレートを10秒間混合します。IPAビーズを最高速度で10秒間、または完全に再懸濁するまでボルテックスします。次に、各サンプルウェルにビーズを 20 µL ずつ分注し、プレートを 30 秒間混合します。プレートを回転プレートインキュベーターに入れ、750 RPM、25 °C または室温で 2 時間インキュベートし、自動プレートウォッシャーを用いてプレートを洗浄します。プライミングプログラムを実行した後、プレートウォッシャー上の 96 ウェル磁気ビーズ分離プレートにプレートを設置します。次に、マスター洗浄プログラムを実行します。プログラムが完了したら、プレートをウォッシャーから取り出します。各サンプルウェルに1x反応バッファーを50 µL加え、30秒間ミキシングします。botテストマトリックスアッセイを開始するには、0.5 µMのAEレポーターを50 µLずつ添加します。エッジエフェクトを防ぐため、使用しない各ウェルに100 µLの水を添加します。シーリングテープでプレートを密閉し、遮光した状態で、750 RPM、25 °Cまたは室温でインキュベートします。各測定タイミングで、プレートをインキュベーターから取り出します。シーリングテープを剥がし、直ちにプレートを96ウェル磁気ビーズ分離プレートに設置して、ビーズを2分間分離させます。プレートをマイクロプレートリーダーにセットし、約434 nmで励起し、約470 nmおよび約526 nmで放出光を測定します。追加の読み取り時間を設定したい場合は、マイクロプレートミキサーでビーズを30秒間再懸濁させた後、プレートを再封印してインキュベーターに戻します。ここでは、PBSにスパイクしたbotおよびholo toinを用い、AEレポーターとともに2時間、4時間、および24時間インキュベートした後のアッセイ結果を示しています。botによるレポーターの切断は、プレートリーダーで測定される放出比の減少として測定され、未切断のレポーターでは約2.7、完全に切断されたレポーターでは約0.7となります。曲線の左方シフトに見られるように、具体的な数値はプレートリーダーによって異なります。レポーターとのインキュベーション時間が長くなると、レポーターの切断が増加します。3連（triplicate）で測定したデータポイントは、平均値の標準偏差が低く、毒素量の減少に伴いエミッション比が増加するという期待通りの傾向を示しています。アッセイがこの期待される傾向に従わない場合は、希釈系列の作成またはデータプロット時のエラーの可能性があります。また、bot Aを含まないコントロールのエミッション比はインキュベーション中も安定しており、非特異的なプロテアーゼ活性がないことが示されています。この図は、標準曲線を用いて未知試料を検出または定量するための一般的な手法を示し、医薬品bot a試料を定量しています。標準曲線は、精製bot（holo toin）を含むPBSで作成され、凍結乾燥Botoxの100 unitバイアルを0.9% salineで再溶解して作成した薬剤製品の希釈系列と並行して処理されました。本アッセイにおいて、標準曲線の直線部分はエミッション比2.11から1.05の間にあり、図中の点線枠で示されています。この直線範囲内に収まる3つの未知試料の濃度を、標準曲線から補間して算出しました。この実験では、固体および液体の食品マトリックスとして新鮮なトマトと2%牛乳を使用し、コア、ヘモライシン、およびニューロトキシン関連タンパク質からなる複合体であるbot Aを添加しました。この組み合わせを選択したのは、ここに示すように、自然なクストリジウム汚染時に生成される毒物に類似しているためです。bot Aの回収は、両方のマトリックスで確認されました。さらに、レポーターとのインキュベーション時間を延長するとアッセイの感度は向上しますが、毒素非含有コントロールの放出比が低下することはありません。このことは、観察された切断がbot Aによるものであり、アッセイに使用した食品からの非特異的なプロテアーゼの混入によるものではないことを示しています。示された各時点における、両方の食品のbot A-L-O-D-L-O-QおよびEC 50を本表にまとめます。LODおよびLOQは、それぞれ放出比が3標準偏差未満、および10標準偏差未満となる最低濃度の検体として定義されます。マトリックス効果が毒素のビーズへの結合や洗浄時のビーズの回収率に影響を及ぼす可能性があるため、LODおよびLOQにはマトリックス間で多少の変動が生じることが予想されます。データからは、トマトよりも2%ミルクからの毒素回収率が高いように見えますが、この差異の大部分は、トマト試料をGPBで均質化するために必要な追加希釈に起因しています。トマトは固体食品マトリックスであることに加え、アッセイを成功させるためにpHおよびイオン強度の調整が極めて重要となる特筆すべき試料タイプです。この図は、10倍中和バッファーを添加した場合と添加しなかった場合におけるトマトのアッセイ応答を示しています。バッファーを添加しなかった場合、サンプルからのbot Aの回収率が悪くなり、テストしたすべてのbot A濃度において放出比が一定であることが示されています。一方、10倍中和バッファーを添加すると、高感度な毒素検出が可能になります。非特異的プロテアーゼは、食品サンプルに内在しているか、あるいはClostridium培養液や上清などの精製されていないbot調製物を使用する際に導入される可能性があり、AEレポーターを切断して偽陽性の結果を招くことがあります。この例では、bot Aによって切断されない改変レポーターを用いて、Clostridium bot aの培養上清に見られる非特異的プロテアーゼ活性を実証しています。レポーターの高い切断レベルは、培養液であることを示しています。上清には顕著なプロテアーゼ活性が含まれていますが、これはプロテアーゼ阻害剤を添加することで効果的に打ち消すことができます。この手法を習得すれば、サンプルタイプや毒素量に応じて、アッセイの総所要時間を4時間から26時間の間に完了させることが可能です。このビデオを視聴することで、蛍光ベースのタンパク質リポーターシステムを用いた免疫沈降法により、複雑なサンプルからボツリヌス神経毒素を単離および定量する方法について十分な理解を得ることができます。ボツリヌス神経毒の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施に際しては、手袋の着用、研究室用白衣の着用、化学・生物安全キャビネットの使用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

競争力のある免疫化学的方法に基づいて新たに開発されたスクリーニング方法を用いてトリコテセン（ヒトの健康に対する懸念のマイコトキシン）を検出すると、最終的な電気化学的検出が実証されているプロトコル。...

ELIME（免疫磁気電気化学的にリンクされた酵素）マイコトキシンの検出方法

このレポートでは、我々は表面プラズモン共鳴は、ホストサイトゾルへ毒素のエントリを検出するために使用される方法について説明します。この高感度の方法は、細胞質毒素の量で定量的なデータを提供することができます、そしてそれは毒素の範囲に適用することができます。...

表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出

このビデオでは、サンプル中の複数のサイトカインターゲットを定量するためのマルチプレックスビーズベースのイムノアッセイを実演しています。サイトカイン特異的抗体に結合した異なるマイクロスフェアの混合物を使用して、サンプル中に存在するサイトカインに結合します。ストレプトアビジンタグ付きレポーターは、ビオチン化検出抗体を使用して結合サイトカインに固定化されます。フローサイトメトリーは、マイクロスフェアのユニークなサイズと内部蛍光強度に基づいて結合したサイトカインを同定し、レポーターの蛍光強度はサイトカインの数を示します。...

複数のサイトカインターゲットを定量するためのマルチプレックスビーズベースのイムノアッセイ

ボツリヌス神経毒A型軽鎖(BoNT/A LC)は、運動ニューロンに侵入し、その基質であるSNAP-25を切断し、神経伝達を妨害するメタロプロテアーゼであり、それによって弛緩性麻痺を引き起こします。ハイスループット対応のFRETベースのアッセイを利用することで、低分子の大規模なライブラリーをBoNT/A...

ボツリヌス神経毒軽鎖モジュレーターの同定と特性評価のためのハイスループット互換FRETベースプラットフォーム

ボツリヌス神経毒は、カテゴリーAの生物脅威物質の中で最も強力な毒素の一つですが、曝露後の治療薬は利用できません。ハイコンテントイメージングアプローチは、この毒素の主要な標的である生物学的に関連する運動ニューロンを用いたマルチパラメータースクリーニングを可能にするため、新規阻害剤を同定するための強力な方法論です。...

ボツリヌス神経毒素阻害剤の同定のためのハイコンテントイメージングアッセイ

マウスES細胞を、機能的なシナプスと創発的なネットワーク挙動を示す高純度ニューロンの集団に分化するためのカスタムプロトコルが記述されています。電気生理学的分析は、ボツリヌス神経毒血清型/ A-/...

幹細胞由来の中枢神経系ニューロンのネットワーク化培養における生物学的神経毒の機能評価

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

このプロトコルは、最近発表された欧州委員会規則(EU)2023/915に準拠して、食品中の麦角アルカロイドの存在を決定するための検証済みの液体クロマトグラフィー-イオン移動度-高分解能質量分析法を提供します。...

液体クロマトグラフィートラップイオン移動度分析飛行時間型質量分析による食品マトリックス中の制御された麦角アルカロイドの検出

このビデオプロトコルは、成体マウスの脳室周囲領域からの神経幹細胞を生成し、拡大するニューロスアッセイ法を示し、一方は再現性のニューロスフェア培養を達成できるように技術的な洞察を提供しています。...

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

中脳ドーパミン系と線条体からの外植片は、のためにコラーゲンマトリックスアッセイで使用されている...

三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

学ぶボツリヌス神経毒素の定量法。複雑なマトリックスから免疫沈降と蛍光タンパク質レポーターを用いて、食品や環境サンプル中のBoNT活性を高感度に検出・定量化する手法です。

BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

さらに動画を探す