BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

この手順の全体的な目標は、医薬品サンプル、環境サンプル、食品サンプルなどの複雑なマトリックス中のボツリヌス神経毒のタンパク質分解活性を定量化することです。これは、最初にテストサンプルと必要に応じて標準曲線サンプルを処理し、適切なpHと粘度の条件を確立することによって達成されます。次に、抗体被覆磁気ビーズを用いてサンプルからボツリヌス神経毒を免疫沈降させます。

次に、磁気ビーズを徹底的に洗浄して干渉化合物を除去し、最適化された反応バッファーに再懸濁します。最後に、洗浄したビーズをタンパク質レポーターとインキュベートし、レポーターの経時的な切断を分光学的に測定します。最終的には、試験サンプルと標準曲線サンプルのレポーター切断の比較を使用して、マウスからマウスに近いマウスまでのバイオアッセイ感度で試験サンプル中のボツリヌス毒素の活性を定量

マウス、バイオアッセイ、免疫学、およびその他の蛍光法などの他の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、このアッセイが動物の使用を必要とせず、食品、環境、および医薬品サンプルに見られる非常に複雑なマトリックスでの使用が実証されていることです。一般に、この分析法を初めて使用する人は、慎重なサンプル処理と希釈が必要なため、苦労する可能性があります。この手順を実演するのは、Bio Sentinelの科学者であるMark Dunning博士です。

テストサンプルを定量化するための標準曲線を生成するためにテキストプロトコルに従って緩衝液を準備し、10プラスまたはマイナス0.01グラムの固体食品サンプルを50ミリリットルの円錐形チューブに秤量し、このサンプルを脇に置きます2番目のチューブの希釈剤として使用され、2つのプラスマイナス0.01グラムの固体食品サンプルを計量します。ボツリヌス神経毒を添加するか、または2グラムの食品サンプルの表面に購入して、食品1グラムあたり30, 000 MLD 50の最終濃度にします。希釈液とスパイクしたサンプルを室温または摂氏4度で2時間インキュベートし、ボットが食品マトリックスと相互作用する時間を確保します。

自然汚染を模倣する場合は、追加のサンプルタイプについてテキストプロトコルを参照してください。次に、食品1グラムあたり1ミリリットルのGPBをスパイクサンプルとスパイクサンプルに添加し、完全にブレンドされるまで乳棒を使用して均質化します。10 グラムの希釈液サンプルのおおよその総体積から、スパイクされたサンプルである 2 グラムのボットの総体積を推定します。

次に、10 x 中和バッファーの 10 番目の容量を 10 グラムの希釈液サンプルに加え、合計容量に基づいて 2 グラムのスパイクサンプルを購入しました。反転によってよく混合されたサンプルは、重力と摂氏4度で6、000倍で10分間遠心分離することにより、両方のサンプルを部分的に透明にします。その後、直ちに上清を除去し、ボットを使用してスパイクされたサンプルをDとして、スパイクされたサンプルを希釈剤として非スパイクされたサンプルを新しいチューブに移し、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに残りの標準曲線サンプルを生成します。

固形食品サンプルを調製するには、まず、プラスマイナス0.01グラムの固体未知サンプルを2個、50ミリリットルの円錐管に計量します。2ミリリットルのGPBを加え、乳棒を使用してサンプルを均質化します。次に、サンプルに10 x中和緩衝液の10分の1の容量を加え、6,000倍の重力と摂氏4度の10分間の遠心分離によってサンプルを部分的に清澄化した後、反転してよく混合します。

これは希釈が不明なものです。希釈剤の675マイクロリットルを、不明の希釈2と3とラベル付けされた2つのチューブに加えます。希釈液は、標準曲線の生成に使用されるのと同じ処理材料になります。

希釈1を使用して、75マイクロリットルの希釈1を希釈2チューブに移し、混合することにより、段階希釈を行います。次に、75マイクロリットルの希釈2を希釈3チューブに移し、混合します。サンプルを明確にするために、少なくとも14, 000回、5分間遠心分離します。重力。

すぐに上清を取り除き、新しいチューブに移してサンプル用のプレートをセットアップし、各未知サンプルと各ウェルに20マイクロリットルの10 x結合バッファーを追加し、標準の湾曲したサンプルD1からD8には3つのウェルが必要であり、サンプルD9には6つのウェルが必要です。各サンプルを200マイクロリットルをそれぞれのウェルに加え、マイクロプレートミキサーを使用してプレートを10秒間混合します。IPAビーズを最高速度で10秒間、または完全に再懸濁するまでボルテックスします。

次に、20マイクロリットルのビーズを各サンプルウェルにピペットで入れ、プレートを30秒間混合します。回転プレートインキュベーターでプレートを750 RPMおよび摂氏25度または室温で2時間インキュベートし、自動プレートウォッシャーを使用してプレートを洗浄します。プライムプログラムを実行した後、プレートワッシャーの96ウェル磁気ビーズ分離プレートにプレートを置きます。

次に、マスターウォッシュプログラムを実行します。プログラムが完了したら、プレートをワッシャーから取り外します。各サンプルウェルに50マイクロリットルの1つのx反応バッファーを加え、30秒間混合します。

ボットテストマトリックスアッセイを開始するには、50マイクロリットルの0.5マイクロモルAEレポーターを追加します。エッジ効果を防ぐために、各サンプルウェルに未使用の水100マイクロリットルを追加します。天井テープをしっかりと使用してプレートを密閉し、光から遮蔽し、750 RPMおよび摂氏25度または室温でインキュベートします。

読み取り時間ごとに、プレートをインキュベーターから取り外します。天井テープをはがし、すぐにプレートを96ウェル磁気ビーズ分離プレートに置き、ビーズを2分間分離させます。プレートをマイクロプレートリーダーに置き、約434ナノメートルの励起下で約470ナノメートルと約526ナノメートルの放射を測定します。

追加の読み取り時間が必要な場合は、マイクロプレートミキサーでビーズを30秒間懸濁した後、プレートを再シールしてインキュベーターに戻します。ここに示されているのは、ボットを使用してホロトインをPBSにスパイクし、AEレポーターとの2時間、4時間、および24時間のインキュベーション後にテストしたアッセイ結果です。ボットによるレポーターの切断は、プレートリーダーで測定された放出比の減少として測定され、無傷のレポーターの約 2.7 から完全に切断されたレポーターの約 0.7 まで減少します。

特定の値は、曲線の左へのシフトからわかるように、プレートリーダー間で異なり、レポーターとのインキュベーション時間が長くなると、レポーターの切断が増加します。トリプリケートでテストされたデータポイントは、平均の標準偏差が低く、毒素負荷の減少に伴う排出比の増加という予想される傾向に従います。アッセイがこの予想される傾向に従わない場合は、希釈生成中のエラーを示している可能性があります。または、ボットAを含まないコントロールの発光比をプロットしたデータもインキュベーション中に安定しており、非特異的なプロテアーゼ活性の欠如を示しています。

この図は、標準曲線に対して未知のサンプルを検出または定量し、製薬ボットのサンプルを定量するために使用される一般的な方法を示しています。標準曲線は、精製ボット、ホロトインを使用してPBSで生成され、このアッセイでは0.9%生理食塩水で再水和された凍結乾燥ボトックスの単一の100ユニットバイアルから生成された医薬品の希釈と並行して処理され、標準曲線の線形部分は2.11と1.05の発光比の間にあり、図の破線のボックスで示されています。次に、この線形範囲内にある3つの未知数の濃度を標準曲線から補間しました。

この実験では、フレッシュトマトと2%ミルクを固体および液体の食品マトリックスとして使用し、コアホロ、トイン、および神経毒関連タンパク質で構成される複合体をボットでスパイクしました。この組み合わせは、ここに示すように、天然のクロストリジウム汚染中に生成される毒素に似ているため、選択されました。ボット A の回復は、両方の行列で観察されます。

さらに、レポーターとのインキュベーション時間が長くなると、アッセイの感度は向上しますが、毒素なしコントロールの放出比は低下せず、観察された切断結果はボットAからであり、アッセイ内の食品から非特異的プロテアーゼが持ち越されないことを示しています。この表には、示されている各時点における両方の食品のボット A-L-O-D-L-O-Q と EC 50 がまとめられています。LOD と LOQ は、放出比がバックグラウンドより 3 標準偏差と 10 標準偏差より低い、最も低濃度のサンプルとして定義されます。

マトリックス効果が毒素のビーズへの結合と洗浄中のビーズの回収に影響を与える可能性があるため、LODおよびLOQのマトリックス間の変動が予想されます。データからは、トマトよりも 2% 牛乳からの毒素回収量が多かったように見えますが、この差の多くは、GPB でトマトサンプルを均質化するために必要な追加の希釈に起因しています。トマトは、固形の食品マトリックスであるだけでなく、pHとイオン強度の調整がアッセイの成功に重要である注目すべきサンプルタイプです。

この図は、10 x 中和バッファーを添加した有無にかかわらずトマトを試験した場合のアッセイ反応を示しています。緩衝液の添加に失敗すると、サンプルからのボットAの回収不良が生じ、10倍中和緩衝液の添加により試験されたすべてのボットA濃度にわたって一定の放出比が実証されますが、高感度の毒素検出が生じ、非特異的プロテアーゼが食品サンプルに内因性であるか、またはクロストリジウム培養などの非精製ボット調製物を使用する場合に導入される可能性があります。 上清、およびAEレポーターを切断し、偽陽性の結果につながる可能性があります。この例は、Clostridium botに見られる非特異的プロテアーゼ活性を示しており、ボットAによって切断されなくなった修飾レポーターを使用した培養上清を使用しています。レポーターの切断が高レベルの場合は、培養を示しています。

上清には有意なプロテアーゼ活性が含まれており、これはプロテアーゼ阻害剤の添加によって効果的に打ち消されます。この手法を習得すると、サンプルの種類と毒素負荷にもよりますが、合計4時間から26時間のアッセイ時間で実行できます。このビデオを見れば、蛍光ベースのタンパク質レポーターシステムでの免疫沈降を使用して、複雑なサンプルからボツリヌス神経毒を単離および定量する方法を十分に理解できるはずです。

ボツリヌス神経毒の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、手袋、検査コード、化学的および生物学的安全キャビネットなどの予防措置を使用する必要があることを忘れないでください。