BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

この手順の全体的な目的は、医薬品、環境、食品サンプルなどの複雑なマトリックスにおけるボツリヌス神経毒素のタンパク質分解活性を定量することです。まず、必要に応じて試験サンプルおよび標準曲線サンプルを処理し、適切なpHおよび粘度条件を確立します。次に、抗体コーティング磁気ビーズを用いて、サンプルからボツリヌス神経毒素を免疫沈殿させます。

次に、干渉物質を除去するために磁気ビーズを十分に洗浄し、最適化した反応バッファーで再懸濁します。最後に、洗浄したビーズをタンパク質レポーターとともにインキュベートし、時間の経過に伴うレポーターの切断を分光法で測定します。最終的に、検体中のレポーター切断を標準曲線サンプルと比較することで、マウスバイオアッセイに近い感度で検体中のボツリヌス毒素の活性を定量します。

マウスを用いた試験、バイオアッセイ、免疫学的測定法、およびその他の蛍光法などの他手法に対する本手法の主な利点は、動物の使用を必要としない点、および食品、環境、医薬品サンプルに含まれる極めて複雑なマトリックスへの適用が実証されている点にあります。一般的に、本手法を初めて行う方は、慎重なサンプル処理と希釈が必要であるため、習得に苦労する可能性があります。本手順のデモンストレーションは、Bio Sentinelの研究員であるDr. Mark Dunningが行います。

テキストプロトコルに従って緩衝液を調製し、検体定量のための標準曲線を作成します。50 mLコニカルチューブに10 ± 0.01 gの固体食品試料を量り取り、取り分けておきます。この試料は希釈剤として使用します。2番目のチューブに2 ± 0.01 gの固体食品試料を量り取ります。この2 gの食品試料の表面に、食品1 gあたり30,000 MLD₅₀の最終濃度になるようにボツリヌス神経毒（BoNT）を添加します。希釈剤およびスパイク試料を室温または4 °Cで2時間インキュベートし、BoNTが食品マトリックスと反応する時間を設けます。

自然な汚染を模倣するため、その他の試料タイプについてはテキストプロトコルを参照してください。次に、スパイク済みおよび未スパイク済みの試料に、食品1gあたり1mLのGPBを加え、ペッスルを用いて十分に混ざるまで均質化します。10gの希釈試料の概算総量から、2gのスパイク済み試料の総量を外挿します。

次に、10 gの希釈剤試料および2 gのスパイク試料に対し、それぞれの全量に基づいた1/10量の10倍中和バッファーを加えます。試料を転倒混和で十分に混ぜ、6,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離して、両試料を部分的に清澄化します。その後、直ちに上清を回収し、スパイク試料をD1、非スパイク試料を希釈剤として新しいチューブに移します。残りの標準曲線用試料を1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で調製します。

固形食品サンプルの調製には、まず未知の固形サンプル2 ± 0.01 gを50 mLコニカルチューブに量り取ります。2 mLのGPBを加え、ペッスルを用いてサンプルを均質化します。次に、サンプルの1/10量に相当する10x中和緩衝液を加え、転倒混和して十分に混ぜ合わせます。6,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離を行いサンプルを部分的に清澄化した後、直ちに上清を750 µL以上マイクロ遠心チューブに移します。

これは未知試料希釈液1です。未知試料希釈液2および3とラベルを貼った2本のチューブに、希釈液を675 µLずつ加えます。希釈液には、標準曲線の作成に使用したものと同じ処理済みの材料を使用します。

希釈液1を75 µL、希釈液2のチューブに移して混合し、連続希釈を行います。次に、希釈液2を75 µL、希釈液3のチューブに移して混合します。サンプルを清澄化するため、14,000 ×g 以上の遠心力で5分間遠心分離します。

直ちに上清を除去して新しいチューブに移し、サンプルプレートを準備します。各未知サンプルおよび標準曲線のサンプルD1からD8には3ウェル、サンプルD9には6ウェルが必要であり、それぞれのウェルに10x結合バッファーを20 µLずつ加えます。各サンプルを対応するウェルに200 µLずつ加え、マイクロプレートミキサーを使用してプレートを10秒間混合します。IPAビーズを最高速度で10秒間、または完全に再懸濁するまでボルテックスします。

次に、各サンプルウェルにビーズを 20 µL ずつ分注し、プレートを 30 秒間混合します。プレートを回転プレートインキュベーターに入れ、750 RPM、25 °C または室温で 2 時間インキュベートし、自動プレートウォッシャーを用いてプレートを洗浄します。プライミングプログラムを実行した後、プレートウォッシャー上の 96 ウェル磁気ビーズ分離プレートにプレートを設置します。

次に、マスター洗浄プログラムを実行します。プログラムが完了したら、プレートをウォッシャーから取り出します。各サンプルウェルに1x反応バッファーを50 µL加え、30秒間ミキシングします。

botテストマトリックスアッセイを開始するには、0.5 µMのAEレポーターを50 µLずつ添加します。エッジエフェクトを防ぐため、使用しない各ウェルに100 µLの水を添加します。シーリングテープでプレートを密閉し、遮光した状態で、750 RPM、25 °Cまたは室温でインキュベートします。

各測定タイミングで、プレートをインキュベーターから取り出します。シーリングテープを剥がし、直ちにプレートを96ウェル磁気ビーズ分離プレートに設置して、ビーズを2分間分離させます。プレートをマイクロプレートリーダーにセットし、約434 nmで励起し、約470 nmおよび約526 nmで放出光を測定します。

追加の読み取り時間を設定したい場合は、マイクロプレートミキサーでビーズを30秒間再懸濁させた後、プレートを再封印してインキュベーターに戻します。ここでは、PBSにスパイクしたbotおよびholo toinを用い、AEレポーターとともに2時間、4時間、および24時間インキュベートした後のアッセイ結果を示しています。botによるレポーターの切断は、プレートリーダーで測定される放出比の減少として測定され、未切断のレポーターでは約2.7、完全に切断されたレポーターでは約0.7となります。

曲線の左方シフトに見られるように、具体的な数値はプレートリーダーによって異なります。レポーターとのインキュベーション時間が長くなると、レポーターの切断が増加します。3連（triplicate）で測定したデータポイントは、平均値の標準偏差が低く、毒素量の減少に伴いエミッション比が増加するという期待通りの傾向を示しています。アッセイがこの期待される傾向に従わない場合は、希釈系列の作成またはデータプロット時のエラーの可能性があります。また、bot Aを含まないコントロールのエミッション比はインキュベーション中も安定しており、非特異的なプロテアーゼ活性がないことが示されています。

この図は、標準曲線を用いて未知試料を検出または定量するための一般的な手法を示し、医薬品bot a試料を定量しています。標準曲線は、精製bot（holo toin）を含むPBSで作成され、凍結乾燥Botoxの100 unitバイアルを0.9% salineで再溶解して作成した薬剤製品の希釈系列と並行して処理されました。本アッセイにおいて、標準曲線の直線部分はエミッション比2.11から1.05の間にあり、図中の点線枠で示されています。この直線範囲内に収まる3つの未知試料の濃度を、標準曲線から補間して算出しました。

この実験では、固体および液体の食品マトリックスとして新鮮なトマトと2%牛乳を使用し、コア、ヘモライシン、およびニューロトキシン関連タンパク質からなる複合体であるbot Aを添加しました。この組み合わせを選択したのは、ここに示すように、自然なクストリジウム汚染時に生成される毒物に類似しているためです。bot Aの回収は、両方のマトリックスで確認されました。

さらに、レポーターとのインキュベーション時間を延長するとアッセイの感度は向上しますが、毒素非含有コントロールの放出比が低下することはありません。このことは、観察された切断がbot Aによるものであり、アッセイに使用した食品からの非特異的なプロテアーゼの混入によるものではないことを示しています。示された各時点における、両方の食品のbot A-L-O-D-L-O-QおよびEC 50を本表にまとめます。LODおよびLOQは、それぞれ放出比が3標準偏差未満、および10標準偏差未満となる最低濃度の検体として定義されます。

マトリックス効果が毒素のビーズへの結合や洗浄時のビーズの回収率に影響を及ぼす可能性があるため、LODおよびLOQにはマトリックス間で多少の変動が生じることが予想されます。データからは、トマトよりも2%ミルクからの毒素回収率が高いように見えますが、この差異の大部分は、トマト試料をGPBで均質化するために必要な追加希釈に起因しています。トマトは固体食品マトリックスであることに加え、アッセイを成功させるためにpHおよびイオン強度の調整が極めて重要となる特筆すべき試料タイプです。

この図は、10倍中和バッファーを添加した場合と添加しなかった場合におけるトマトのアッセイ応答を示しています。バッファーを添加しなかった場合、サンプルからのbot Aの回収率が悪くなり、テストしたすべてのbot A濃度において放出比が一定であることが示されています。一方、10倍中和バッファーを添加すると、高感度な毒素検出が可能になります。非特異的プロテアーゼは、食品サンプルに内在しているか、あるいはClostridium培養液や上清などの精製されていないbot調製物を使用する際に導入される可能性があり、AEレポーターを切断して偽陽性の結果を招くことがあります。この例では、bot Aによって切断されない改変レポーターを用いて、Clostridium bot aの培養上清に見られる非特異的プロテアーゼ活性を実証しています。レポーターの高い切断レベルは、培養液であることを示しています。

上清には顕著なプロテアーゼ活性が含まれていますが、これはプロテアーゼ阻害剤を添加することで効果的に打ち消すことができます。この手法を習得すれば、サンプルタイプや毒素量に応じて、アッセイの総所要時間を4時間から26時間の間に完了させることが可能です。このビデオを視聴することで、蛍光ベースのタンパク質リポーターシステムを用いた免疫沈降法により、複雑なサンプルからボツリヌス神経毒素を単離および定量する方法について十分な理解を得ることができます。

ボツリヌス神経毒の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施に際しては、手袋の着用、研究室用白衣の着用、化学・生物安全キャビネットの使用などの予防措置を講じることを忘れないでください。