Name: BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学ぶボツリヌス神経毒素の定量法。複雑なマトリックスから免疫沈降と蛍光タンパク質レポーターを用いて、食品や環境サンプル中のBoNT活性を高感度に検出・定量化する手法です。

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著者らは、貴重な議論やアドバイスをH·オリバーレスとDルーゲに感謝したいと思います。この研究は、NSFのSBIR賞（BioSentinel社へIIP-1127245）と国防省の契約（BioSentinel社へW81XWH-07-2から0045）によって部分的にサポートされていました。

FMの督促、TM広場、F. Zeytin、トイレタッカーはBioSentinel株式会社BioSentinelの従業員または所有者である現在、製造、本報告書で提示された試薬の一部を商品化しました。

このプロトコルは、複雑なマトリックス中のBoNT / A複雑、ホロ毒素、またはクロストリジウム培養上清を定量化するための手順について説明します。アッセイ感度は血清型およびアッセイ間で変化するが、56,60それぞれのマトリクスアッセイと他のBoNT血清型（ 例えばのBoNT / B、E、およびF）をテストする際のプロトコルは、しかし、同じです。このプロトコルは、可能な試料の種類毎に考慮していない、いくつかの改変は、特定のサンプル組成物および所望の用途に応じて必要とされ得る。マトリックスは、食品試料（ 例えば 、食品負荷試験）又は医薬賦形剤の緩衝液（ 例えばなBoNTベースの薬剤製品試験）を含むことができる。複雑な食料品以外（ 例えば動物の組織または環境的）液体と固体のサンプルは、食品サンプルとして扱う必要があります。このプロトコルは、200μl/ウェルのサンプルのボリュームを使用していますが、50μL/ウェル10倍バインディンの容量に対応する調整をテストすることができるように、わずかGバッファ。 50μLより小さいサンプルは、試...

ボツリヌス神経毒素（BoNTを）が知られている最も致命的な物質で、1〜3 NGと推定静脈人間の致死量に/ 1,2キロ。七つのBoNT血清型は構造的に類似し、Gを介して標識され、各々は、サイトゾルと亜鉛エンドペプチダーゼ3-5をコードする軽鎖への細胞結合、取り込み、および転座に関与する重鎖ドメインからなる、存在する。部分的には、その具体的な結合および神経筋接合部6での運動ニューロンへのエントリーからのBoNT結果の絶妙な毒性。一旦ニューロンの内部に、軽鎖エンドペプチダーゼを特異的に切断する可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質レセプター（SNARE）小胞融合に必要なタンパク質の1つ以上が、神経伝達物質放出を阻害し、弛緩性麻痺7-14をもたらす。一般的疾患」ボツリヌス中毒」のBoNTによる横隔膜や肋間筋の麻痺として知られ、最終的には、その結果早期診断と治療しない限り、呼吸不全や死を受けている。 人間の食品媒介性ボツリヌス症は、最も一般的なBoNT血清型A、B、Eに関連付けられており、通常は、F（BoNT / A型、のBoNT / B 等 ）とは汚染された食物15,16の摂取に起因される。たが、創傷ボツリヌス中毒のいくつかのケース静脈内薬物使用者の間で報告された17,18。米国では、1歳未満の子供によるクロストリジウム胞子の摂取による乳児ボツリヌス症は、ボツリヌス中毒19〜21の中で最も一般的な形式です。しかし、不適切な家庭缶詰食品加工に起因する食中毒のBoNTのアウトブレイクは、米国および海外の両方で報告された。 2000-2009の間、食品媒介性ボツリヌス症の少なくとも338例は6死亡例22を含め世界的に報告された。迅速かつ高感度に食中毒ボツリヌス中毒の発生を検出する能力は、早期診断を支援することができ、重要な指標である23,24。さらに、費用対効果の高い、日常食品検査できるように検出方法が改善された食料安全保障につながる。 のBoNTの神経細胞の特異性と生物学的半減期が長く、また、それ強力な治療になります。米国において、BoNT系薬剤は、化粧品の条件や眉間のしわ、頸部ジストニア、片頭痛、過活動膀胱、および斜視などの神経筋関連障害の治療のための食品医薬品局（FDA）によって承認されています。多数の「適応外」アプリケーションは、重度の筋機能不全のため25〜28高用量治療を含む、文書化されています。過剰投与が潜在的に有害な副作用のリスクがある患者を置くながら過少が無効治療につながる可能性がある正確な毒素定量化は、正しい投与のために重要である。残念ながら、標準化された効力アッセイプロトコルはなBoNTに基づく薬剤のprodu間の単位定義不平等で、その結果、製造業者間で共有されていないCTS 29〜31。 のBoNTのための標準的な試験は、のBoNT含有試料をマウスに腹腔内注射し、死亡者の数は1〜7日以上16,32,33が記録されたマウスのバイオアッセイである。マウスバイオアッセイは、5月10日PGのBoNT / A 34の検出限界（LOD）と非常に敏感であるが、動物使用上の倫理的な問題、高い人材育成のコストと動物施設、長いアッセイ時間、および欠如を維持標準化されたプロトコルは標準化された、アニマルフリーのBoNTテストおよび定量方法35-39を開発するために呼び出しされた。最近、いくつかの代替のBoNT定量法は、マウスまたはそれに近いマウスバイオアッセイ感度40-49を提供することが開発された。これらの方法には、一般的に、蛍光、質量分析、または免疫学的方法を使用し、動物を使用することなく、マウスのバイオアッセイよりもかなり短いアッセイ時間を提供します。免疫学的techniqと組み合わせた質量分析のアプローチUEは、食品やその他の複雑なサンプルに含まれているのBoNTを検出し、定量化することが示されたが、人材育成の必要条件と特殊な装置の制限これらのアッセイは、50〜55。他のほとんどの代替のアッセイは、複雑なサンプル試験に容易に適用できないか、日常的なBoNTのテストに必要なスループットを欠いている。のBoNTの極端な効力に一致するように感度のインビトロアッセイ法を開発しようとする食品サンプルの粘度、pH、塩分、およびマトリックス構成成分の高度に可変性は、特に困難な挑戦を提示する。さらに、このようなBoNT系医薬品の再懸濁に起因するものなどであっても、単純で、比較的良性の緩衝系は、有意にインビトロ効力のBoNT 56影響を及ぼす塩、アルブミン、および糖安定剤（ すなわち、賦形剤）を含有する。毒素精製は、サンプル56〜59の最も単純ますが、すべての正確な活性試験のために必要である。 ザ·BoTestマトリックスアッセイは迅速で高スループットのために設計されており、一般的に研究室56,60で見つかった機器を使用して、高度に複雑なサンプルからのBoNTの一貫した定量化された。これらのアッセイは、共有結合的に結合して、サンプルからのBoNTを封鎖した後、洗浄することによってマトリックス化合物を干渉除去して血清型特異的抗のBoNT抗体に連結常磁性ビーズを使用しています。洗浄後、結合したBoNTタンパク質分解活性は、その後のBoNT血清型は、試験されると互換性のレポーターを用いて最適化反応バッファー中で定量化される。これらのレポーターは、N末端シアン蛍光タンパク質（CFP）部分とを構成するBoNT基板、SNAP25残基141から206またはシナプトブレビン残基33から94で連結されたC末端黄色蛍光タンパク質誘導体（ヴィーナス）部分からなる蛍光性タンパク質であるBoTest A / EまたはB / D / F / Gの記者、それぞれ45。のBoNTによるレポーター切断は、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて監視される。ときはT彼記者は、CFPの励起はCFP発光と刺激的な金星発光が消光、金星にFRETの結果、無傷である。のBoNTによるレポーターの切断は、CFP発光と金星排出量の減少の増加につながる、FRETを防ぐことができます。活性のBoNT次いで定量的にCFPと金星の発光の比率を用いて測定することができる。 3視聴以下LODは、ハイスループットの96ウェルプレートフォーマットを使用して、食品56の広い範囲から可能である。アッセイは、ビーズ表面上の毒素の濃度を可能にするので、感度の増加は、より大きな試料体積を用いて得ることができる。 のBoNT A、B、E、およびFのためのBoTestマトリックスアッセイは、食品、製薬、環境試料56,60を使用して開発し、試験した。ここでは、（ 例えば 、食品、環境）のサンプル低複雑でのBoNTの検出のためのこれらのアッセイを実行するための手順（ 例えば医薬品、バッファ内のBoNT）と高い複雑性を説明しています。具体的な処理方法いくつかのサンプルタイプについて、このプロトコルで扱われており、ここでは説明しない試料の種類は、通常、提示される方法の組み合わせを使用して適合させることができる。プロトコルが開発され、テストのBoNT / Aであるが他の場所で56,60実証されたように、それぞれのアッセイを使用して他のBoNT血清型に適用可能であるした。

<table><tbody><tr><td>BoTest Matrix A ボツリヌス神経毒検出キット</td><td>BioSentinel</td><td>A1015</td><td>BoNT/BおよびF用の検出キットもご用意しています。</td></tr><tr><td>Varioskan Flash蛍光マイクロプレートリーダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>5250040</td><td>励起波長が434 nm、蛍光波長が470 nm、526 nmのモノクロメーターまたはフィルターベースのほとんどのユニットを使用することができます。</td></tr><tr><td>96ウェル磁気ビーズ分離プレート</td><td>V&P Scientific</td><td>VP771H</td><td>他の磁気プレートを使用することもできますが、プレートはビーズをウェルの側面に分離するように設計する必要があります。</td></tr><tr><td>磁気ビーズ対応プレートウォッシャー</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>オプション、自動プレート洗浄にのみ必要です。&nbsp;他の磁気ビーズ互換プレートワッシャーも使用できますが、使用前にテストする必要があります。</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td></td><td></td><td>オプションで、遠心分離が必要なサンプルにのみ必要です。</td></tr><tr><td>MixMate プレートミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td></td><td></td><td>室温または25°Cで使用。C 温度制御が可能な場合</td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠</td><td>ロシュ</td><td>4693132001</td><td>食品または環境試験にのみ必要です。プロテアーゼ阻害剤はEDTAフリーでなければなりません。</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>メタバイオロジクス</td><td></td><td>オプション、標準化および定量化の目的でのみ必要</td></tr><tr><td>ブラック、フラットボトム 96ウェルプレート</td><td>NUNC</td><td>237105</td><td>プレートは処理すべきではない</td></tr><tr><td>96ウェルプレートシーリングテープ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

botestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

複雑なマトリックス中のボツリヌス神経毒素（BoNT）の正確な検出および定量は、製薬、環境、食品サンプルのテストに必要とされる。正確な効力試験をするBoNTベースの薬剤製品の製造および患者の安全のために必要であるが、食品の急速なBoNT試験は流行フォレンジック、患者の診断、および食品の安全性試験の際に必要となります。のBoNTテストのための広く使用されているマウスのバイオアッセイは、高感度であるが、迅速かつ日常的なBoNTのテストに必要な精度とスループットを欠いている。さらに、動物のバイオアッセイの使用はのBoNTテストのためのマウスのバイオアッセイに代わる米国および海外での薬物製品の規制当局や動物の権利の支持者による通話をもたらしました。いくつかのインビトロ置換アッセイは、単純な緩衝液中で精製されたBoNTでうまく機能するよう開発されてきたが、ほとんどは、非常に複雑なマトリックス中の試験に適用可能であることが示されていない。ここで、検出のためのプロトコルBoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックス中のBoNTが提示されている。検定は3つの部分から構成されています。最初の部分はテストのためのサンプルの調製を含む、第二部は、マトリックスからのBoNTを精製する抗のBoNT抗体でコーティングされた常磁性ビーズを用いて免疫沈降ステップであり、3番目の部分は分離されたBoNTのタンパク質分解を定量化蛍光性レポーターを使用して、アクティビティ。プロトコルは、液体および固体の両方の行列を用いて96ウェルプレートでハイスループット試験のために書かれ4-26時間の合計アッセイ時間は、試料の種類、毒素負荷、および所望の感度に応じた手動製剤の約2時間を必要とする。データは、リン酸緩衝生理食塩水、医薬製品、培養上清を、2％ミルク、新鮮なトマトのBoNT / A試験のために提示され、アッセイの成功のための重要なパラメータの議論を含むている。

記載されたプロトコルにおけるステップを要約した図を図2に示されている。検定は、サンプルの種類と必要なアッセイ感度に応じて、完了するために4月26日時間の間が必要ですが、実践的な時間しか〜2時間。アッセイは、96ウェルプレート中で実施し、実行されるテストのタイプに依存している、プレート当たりの基準を含む最大20個のサンプルの三連の試験を可能にする。 図3は、BoNTを使用して代表的なアッセイの結果を示しています/ホロ毒素をPBSにスパイクおよびA / Eの記者と2、4、および24時間のインキュベーション後に記述されたプロトコルを使用してテスト。精製されたBoNT /ホロ毒素を〜150 kDaで、その定義された分子量は、毒素複合体のためのより広範に定義された700〜900 kDaのに比べので、この実験のために選択され、純度は、正確な濃度で非常に正確なスパイクを許可した。発光比、434での励起後470nmの場合と526 nmでの発光の比率以下、各時点でのBoNT /濃度（MLD <su...

BoTestマトリックスボツリヌス神経毒素（BoNT）検出アッセイは、急速にサンプルマトリックスの範囲からのBoNTを浄化し、定量化する。ここでは、固体と液体の両方の行列からのBoNTの検出および定量のためのプロトコルを提示し、BOTOX、トマト、ミルクを用いたアッセイを示す。

BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

この手順の全体的な目的は、医薬品、環境、食品サンプルなどの複雑なマトリックスにおけるボツリヌス神経毒素のタンパク質分解活性を定量することです。まず、必要に応じて試験サンプルおよび標準曲線サンプルを処理し、適切なpHおよび粘度条件を確立します。次に、抗体コーティング磁気ビーズを用いて、サンプルからボツリヌス神経毒素を免疫沈殿させます。次に、干渉物質を除去するために磁気ビーズを十分に洗浄し、最適化した反応バッファーで再懸濁します。最後に、洗浄したビーズをタンパク質レポーターとともにインキュベートし、時間の経過に伴うレポーターの切断を分光法で測定します。最終的に、検体中のレポーター切断を標準曲線サンプルと比較することで、マウスバイオアッセイに近い感度で検体中のボツリヌス毒素の活性を定量します。マウスを用いた試験、バイオアッセイ、免疫学的測定法、およびその他の蛍光法などの他手法に対する本手法の主な利点は、動物の使用を必要としない点、および食品、環境、医薬品サンプルに含まれる極めて複雑なマトリックスへの適用が実証されている点にあります。一般的に、本手法を初めて行う方は、慎重なサンプル処理と希釈が必要であるため、習得に苦労する可能性があります。本手順のデモンストレーションは、Bio Sentinelの研究員であるDr. Mark Dunningが行います。テキストプロトコルに従って緩衝液を調製し、検体定量のための標準曲線を作成します。50 mLコニカルチューブに10 ± 0.01 gの固体食品試料を量り取り、取り分けておきます。この試料は希釈剤として使用します。2番目のチューブに2 ± 0.01 gの固体食品試料を量り取ります。この2 gの食品試料の表面に、食品1 gあたり30,000 MLD₅₀の最終濃度になるようにボツリヌス神経毒（BoNT）を添加します。希釈剤およびスパイク試料を室温または4 °Cで2時間インキュベートし、BoNTが食品マトリックスと反応する時間を設けます。自然な汚染を模倣するため、その他の試料タイプについてはテキストプロトコルを参照してください。次に、スパイク済みおよび未スパイク済みの試料に、食品1gあたり1mLのGPBを加え、ペッスルを用いて十分に混ざるまで均質化します。10gの希釈試料の概算総量から、2gのスパイク済み試料の総量を外挿します。次に、10 gの希釈剤試料および2 gのスパイク試料に対し、それぞれの全量に基づいた1/10量の10倍中和バッファーを加えます。試料を転倒混和で十分に混ぜ、6,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離して、両試料を部分的に清澄化します。その後、直ちに上清を回収し、スパイク試料をD1、非スパイク試料を希釈剤として新しいチューブに移します。残りの標準曲線用試料を1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で調製します。

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このビデオでは、サンプル中の複数のサイトカインターゲットを定量するためのマルチプレックスビーズベースのイムノアッセイを実演しています。サイトカイン特異的抗体に結合した異なるマイクロスフェアの混合物を使用して、サンプル中に存在するサイトカインに結合します。ストレプトアビジンタグ付きレポーターは、ビオチン化検出抗体を使用して結合サイトカインに固定化されます。フローサイトメトリーは、マイクロスフェアのユニークなサイズと内部蛍光強度に基づいて結合したサイトカインを同定し、レポーターの蛍光強度はサイトカインの数を示します。...

複数のサイトカインターゲットを定量するためのマルチプレックスビーズベースのイムノアッセイ

ボツリヌス神経毒A型軽鎖(BoNT/A LC)は、運動ニューロンに侵入し、その基質であるSNAP-25を切断し、神経伝達を妨害するメタロプロテアーゼであり、それによって弛緩性麻痺を引き起こします。ハイスループット対応のFRETベースのアッセイを利用することで、低分子の大規模なライブラリーをBoNT/A...

ボツリヌス神経毒軽鎖モジュレーターの同定と特性評価のためのハイスループット互換FRETベースプラットフォーム

ボツリヌス神経毒は、カテゴリーAの生物脅威物質の中で最も強力な毒素の一つですが、曝露後の治療薬は利用できません。ハイコンテントイメージングアプローチは、この毒素の主要な標的である生物学的に関連する運動ニューロンを用いたマルチパラメータースクリーニングを可能にするため、新規阻害剤を同定するための強力な方法論です。...

ボツリヌス神経毒素阻害剤の同定のためのハイコンテントイメージングアッセイ

マウスES細胞を、機能的なシナプスと創発的なネットワーク挙動を示す高純度ニューロンの集団に分化するためのカスタムプロトコルが記述されています。電気生理学的分析は、ボツリヌス神経毒血清型/ A-/...

幹細胞由来の中枢神経系ニューロンのネットワーク化培養における生物学的神経毒の機能評価

このプロトコルは、最近発表された欧州委員会規則(EU)2023/915に準拠して、食品中の麦角アルカロイドの存在を決定するための検証済みの液体クロマトグラフィー-イオン移動度-高分解能質量分析法を提供します。...

液体クロマトグラフィートラップイオン移動度分析飛行時間型質量分析による食品マトリックス中の制御された麦角アルカロイドの検出

中脳ドーパミン系と線条体からの外植片は、のためにコラーゲンマトリックスアッセイで使用されている...

三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

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複雑な脳の地形を明らかにするためWholemount免疫組織化学

このビデオでは、10〜12日以内に、胚前脳からの内皮細胞の純粋培養を調製するための簡単​​で信頼性の高い戦略を示し、脳血管新生のさまざまな側面に焦点を当てた研究のために有用であろう。...

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

この記事は、生化学的および免疫細胞化学的分析のための純粋な軸索サンプルを大量に取得するために使用できるニューロン培養システムについて説明しています。この技術により、正常な軸索生理学と神経変性につながるシグナル伝達経路の理解を深めることができます。...

多孔質フィルタを使用した生化学分析のための感覚ニューロンからの軸索の産生および単離

神経細胞培養は、単一ニューロンまたはニューロンの人口への影響を通じて新興脳刺激技術を研究するための良いモデルです。ここに提示バス電極によって直接生成または時間変化する磁場によって誘起される電界によりパターニング神経細胞培養物の刺激のための異なる方法があります。...

電気を使用してニューロンと1次元と2次元培養における磁場の外部励起

学ぶボツリヌス神経毒素の定量法。複雑なマトリックスから免疫沈降と蛍光タンパク質レポーターを用いて、食品や環境サンプル中のBoNT活性を高感度に検出・定量化する手法です。

BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

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