ボツリヌス神経毒軽鎖モジュレーターの同定と特性評価のためのハイスループット互換FRETベースプラットフォーム

この手順の全体的な目標は、軽鎖阻害であるボツリヌス神経毒の小分子をスクリーニングすることです。これは、最初に高精度かつ高精度の化合物希釈シリーズを調製することによって達成されます。2番目のステップは、化合物の希釈液を黒色の96ウェルプレートに移すことです。

次に、希釈した軽鎖酵素をプレートに加え、この酵素を化合物と室温で5分間インキュベートします。最後のステップは、反応を開始するための軽鎖フレット基質の添加であり、これは蛍光プレートリーダーでモニターされます。最終的には、非蛍光ペプチド基質を利用する二次スクリーニングを使用して、化合物の活性を確認し、阻害剤解離定数やkiなどのより厳密な速度論定数を決定する必要があります。

このアッセイは、HPLCベースや細胞ベースの方法などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、実施が簡単で、自動化が容易で、多数の化合物の相対的な力価を比較するために使用できることです。この方法を初めて使用する場合、化合物希釈シリーズを調製し、すべての成分を添加した後にプレートを適切に混合する際に、個人は苦労するかもしれません。この手順は、テキストプロトコルで説明されているようにバッファーと試薬を準備することから開始します。

プレートリーダーを中速で10秒間振とうし、その後、キネティックモードで5分ごとに励起波長490ナノメートル、発光波長523ナノメートルの蛍光を室温で1時間30分監視するように構成します。化合物濃度範囲を決定した後、適切な化合物名と濃度でチューブをラベル付けし、Eloqua、100%ジメチルスルフオキシドまたはDMSOをすべてのチューブに使用して、化合物シリアル希釈のためにそれらを準備します。次に、標準的な1〜3希釈シリーズの化合物の段階希釈を調製します。

希釈シリーズの最初のチューブで4マイクロリットルのDMSOに2マイクロリットルの希釈化合物を加え、新しいピペットチップでよく混合します。最初の希釈液を2マイクロリットル取り出し、2番目のチューブミックスに4マイクロリットルのDMSOを追加します。残りの希釈液についてもよく繰り返します。

化合物の濃度が正確であることを確認するために、化合物の希釈液をよく混合してください。コンパウンドチューブを覆い、室温で脇に置きます 室温で、底が平らで不透明な黒色の96ウェルプレートを取得します。テキストプロトコルに記載されている推奨プレートセットアップを使用します。

ウェル1〜9の各対応するウェルの底に直接、それぞれの化合物希釈の1マイクロリットルを手動で分配し、ウェルにテストする化合物の最高濃度の1マイクロリットルを分配します.11。化合物の固有蛍光制御として機能します。この制御は、化合物自体が蛍光性であるかどうか、または基質の加水分解に影響を与えるかどうかを判断するためのものです。

10を自動ピペッター分注によるネガティブコントロールとして、79マイクロリットルのアッセイバッファーをウェルの側面に、10から100%DMSOの1マイクロリットルをウェルに手動で分注し、ウェルの側面に10マイクロリットルと12マイクロリットルと89マイクロリットルをウェルの側面に分配し、 11.

ウェルの相互汚染を避けるために、化合物が存在するウェルの底に先端が触れないように注意してください。希釈した軽鎖酵素であるVortexを自動ピペッターを使用して、ウェル11を除く各ウェルの側面に10マイクロリットルの酵素を追加します。プレートを軽くたたいて、添加した酵素の総量がウェルの底に行くことを確認し、プレートを静かに混合し、蓋をして、室温で5分間インキュベートします。

このインキュベーションは、化合物が軽鎖に結合するためのプリエ平衡ステップを提供します。基質を添加する前に、ボツリヌス神経毒を軽鎖基質に穏やかにボルテックスします。次に、自動ピペットを使用して、それぞれの側面に10マイクロリットルの基質を追加します。

さて、酵素が以前に追加された場所とは反対側のウェルの側に基質を必ず追加してください。プレートを軽くたたいて、すぐに試薬を混合します。プレートを蛍光マイクロタイタープレートリーダーにセットし、以前に設定したプログラムを開始します。

プログラムが終了したら、相対蛍光単位対時間をグラフ化し、反応の線形期間中の線の傾きを計算して、酵素速度を計算します。テキストプロトコルに記載されているように、ハイスループットスクリーニングの自動化操作に備え、ハイスループットスクリーニングプロトコルの一部をデモンストレーションすることは、私の研究室でポスドクになります。彼は、化合物が実験室の自動化装置を使用してハイスループットスクリーニングのためにプレートにどのように移動するかを示します 希釈したボツリヌス神経毒、軽鎖酵素をアッセイプレートに分注した後。

リキッドハンドラープラットフォーム上に、コンパウンドプレート、アッセイプレート、および洗浄液が入った容器用のエリアを割り当てます。コンパウンドプレートとアッセイプレートを指定の位置に配置し、スタンピング前にプレートの蓋を取り外すようにリキッドハンドラーをプログラムします。スタンピングプログラムソフトウェアをキャリブレーションし、スタンピングピンが水没しているが、アッセイプレートの底に傷が付いていないことを確認します。

50ナノリットルの化合物を、8マイクロリットルのボツリヌス神経毒を含むアッセイプレートに直接スタンプします。ライトチェーン。各プレートの後のピンをDMSOに浸し、吸い取り紙で乾燥させ、このプロセスをイソプロパノールとメタノールで繰り返して清掃します。

最後に、化合物が酵素でアッセイプレートにスタンプされた後、ファンの上のピンを乾かします。これとは別に、ストックコンパウンドプレートを積み重ね、アッセイプレートがスタック内の上部アッセイプレートを覆い、蒸発を防ぎ、脇に置きます。軽鎖を化合物と室温で少なくとも5分間インキュベートしてください。

多数のプレートをスタンピングする際には、より長いインキュベーション時間を使用できます。最後に、基質をアッセイプレートに分注し、テキストプロトコルに記載されているように蛍光を測定します。フレットベースのボツリヌス神経毒を軽鎖アッセイで低スループットまたは高スループットのいずれで実行する場合でも、ボツリヌス神経毒である軽鎖が基質とインキュベートされると、蛍光の増加が観察されます。

化合物の段階希釈をテストすると、傾きの異なる一連の線が得られることがよくあります。ここは。ヒドロキシ酸エステルベースの化合物の最終濃度は、マイクロモル単位でリストされています。さて、ここで説明するプレートレイアウトの10は、車両のみが追加されるネガティブコントロールとして機能します。

この反応の速度は100%と定義されます酵素活性と化合物の存在下での速度をこの速度に正規化して、相対的な速度またはパーセントの阻害を得ることができます。アッセイを化合物の段階希釈で実施する場合、反応速度と阻害剤濃度のグラフを使用して、半値阻害濃度またはIC 50を決定することができます。希釈範囲は、プロットが最適な曲線フィッティングのためにシグモイド形状に見えるように選択する必要があります。

IC 50値は、アッセイに存在する酵素の濃度に依存するため、見かけのKI値として最もよく説明される効力の相対的な尺度です。この値は、テストされた場合にいくつかの化合物の効力を比較し、ランク付けするために使用できます。並行して、各成分を添加した後のプレートの適切な混合は、経時的な蛍光の滑らかな線形増加を得るために重要であり、これは初期速度を正確に決定するために必要です。

このプロットは、混合が不十分で、生成物の形成速度が時間経過に伴って線形にならない代表的な実験を示しています。交絡データ解析 この手法を習得すれば、最大8つの化合物に対して2時間未満で行うことができます。この実験の後、非蛍光ペプチド基質を用いて他のアッセイを行い、化合物がボツリヌス神経毒、軽鎖、および体細胞活性を阻害することを確認することができます。

このビデオを見れば、ボツリヌス神経毒軽鎖阻害剤の相対的な効力を決定する方法についてよく理解できるはずです。このプロトコルは、3つのステップで完了しました。まず、化合物希釈系列の調製です。

第2に、組換え軽鎖酵素の添加、第3に、蛍光基質の添加とその後の蛍光プレートリーダーでの測定。