Name: ボツリヌス神経毒軽鎖モジュレーターの同定と特性評価のためのハイスループット互換FRETベースプラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶボツリヌス神経毒A型軽鎖阻害剤のハイスループットFRETベーススクリーニング法。蛍光プレートリーダーで酵素活性を測定し、化合物の同定と特性評価を行う効率的な薬剤探索プロトコルです。

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この研究は、国立衛生研究所(AI082190からT.J.D.)およびカリフォルニア再生医療研究所(TB1-01186およびCL1-00502)からの助成金によって支援されました。

手動スクリーニングまたはIC50決定
このプロトコルは、化合物の希釈系列を調製することにより、化合物の相対効力(IC50値)を決定するために、または単一濃度で低分子阻害剤を手動でスクリーニングするために使用できます。
1. バッファー、試薬、必要な器具の調製
<ol>
	<li>50 mLのアッセイバッファー(40 mM HEPES、pH 7.4および0.01% Tween-20)を調製し、滅菌をろ過します。バッファーは室温(RT)で数ヶ月間保存できます。</li>
	<li>組換えボツリヌス神経毒/A軽鎖(LC/A(1-425))17の70 nM使用希釈液をアッセイバッファーに調製し、穏やかにボルテックスし、氷上に保存します。各化合物の試験には、少なくとも120 μlのLC/A作業希釈液が必要です。</li>
	<li>10% DMSOを含むアッセイバッファーで7 μM FRETベースのBoNT/A LC基質を調製します。まず、基質の5 mMストック溶液を適切な容量の100% DMSOで希釈し、次にアッセイバッファーをゆっくりと(滴下して)加え、穏やかに混合します。ホイルで包み、氷の上に保存します。各化合物の試験には、少なくとも130 μlの基質作動希釈が必要です。</li>
	<li>蛍光マイクロタイタープレートリーダーを中速で10秒間振とうし、その後、励起波長490 nmと発光波長523 nmの蛍光をそれぞれ5分ごと(キネティックモード)に、RTで90分間モニターします。生成物の形成(蛍光の増加)は、この期間を通じて直線的であることに注意してください(図1A)。</li>
</ol>
2. 化合物希釈系列の調製
<ol>
	<li>化合物の濃度範囲(希釈系列の希釈数と希釈係数)を決定します。濃度範囲は、最適なカーブフィットを確保するために、予想されるIC50値に基づいて選択されます。不明なIC50の化合物については、原液の化合物ストックを最高濃度の化合物として使用します。</li>
	<li>チューブに適切な化合物名と濃度をラベル付けします。</li>
	<li>すべてのチューブに100% DMSOを分注して、化合物の段階希釈に備えます。最低2 μlの最終希釈量が推奨され、アッセイプレートのウェルごとに各濃度の1 μlを使用します。例えば、標準的な1:3希釈シリーズでは、チューブあたり2μlの化合物と4μlのDMSOを混合する必要があります。</li>
	<li>化合物とボルテックスの段階希釈液を調製するか、各希釈液の間に手動で完全に混合します。各希釈液の合間にピペットチップを交換します。標準的な1:3希釈シリーズでは、希釈シリーズの最初のチューブに2 μlの原液化合物を4 μlのDMSOに加え、よく混合します。新しいピペットチップを使用して、最初の希釈液を2 μl取り出し、2番目のチューブに4 μlのDMSOを加えます。よく混ぜます。残りの希釈液についても繰り返します。化合物の濃度が正確であることを確認するために、化合物の希釈液をよく混合してください。</li>
	<li>コンパウンドチューブを覆い、RTに置いておきます。</li>
</ol>
3. プレートの準備とスポッティング(表1)
<ol>
	<li>平底で不透明な黒色の96ウェルプレートを入手します。表 1 の推奨プレートセットアップでは、各化合物希釈シリーズが 96 ウェルプレートの行でフォーマットされています。各化合物希釈液1 μlを、対応する各ウェル(ウェル1〜9)の底に直接手動で分注します。試験する化合物の最高濃度の化合物1 μlをウェル11に分注します(化合物の固有蛍光制御)。</li>
	<li>既知の強力な阻害剤1 μlをウェル12に手動で分注し(ポジティブコントロール)、100% DMSO1 μLをウェル10に分注します(ネガティブコントロール)。</li>
	<li>自動ピペッターを使用して、79 μlのアッセイバッファーをウェル1-10および12の側面に分注し(化合物希釈およびポジティブコントロール)、89 μlをウェル11の側面に分注します(化合物固有蛍光コントロール)。ウェルを交差汚染しないように、化合物が存在するウェルの底に先端が触れないように注意してください。 </li>
	<li>LC/Aワーキング希釈液をボルテックスし、自動ピペッターを使用して、ウェル11を除く各ウェルの側面に10 μlを添加します(化合物固有蛍光制御)。プレートを軽くたたいて、追加されたすべての酵素がウェルの底に行くことを確認します。</li>
	<li>プレートを穏やかに混合し、蓋をし、室温で5分間インキュベートします。このインキュベーションは、基質を添加する前に化合物がLC/Aに結合するための事前平衡ステップを提供します。</li>
</ol>
4. 基板添加と蛍光測定
<ol>
	<li>BoNT/A LC基質を穏やかにボルテックスし、自動ピペッターを使用して各ウェルの反対側に10 μlの基質を加えます。必ず、酵素を以前に添加した場所とは反対側のウェルの側面に基質を追加してください。</li>
	<li>プレートを軽くたたいて試薬を混合し、すぐにプレートリーダーに入れて、ステップ1.4で指定した設定で蛍光測定を開始します。</li>
	<li>酵素の速度は、反応の線形期間中の相対蛍光単位(RFU)対時間をグラフ化することによって生成された線の傾きから計算されます。</li>
</ol>
表 1.アッセイプレートのレイアウトを推奨します。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>まあ #</th>
			<th>井戸の説明</th>
			<th>化合物</th>
			<th>アッセイバッファー</th>
			<th>基板</th>
			<th>LC</th>の
			<th>DMSOの</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>化合物用量1</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl </td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>化合物用量2</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>化合物用量3</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>化合物用量4</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>化合物用量5</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>化合物用量6</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>名
			<td>化合物用量7</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>名
			<td>化合物用量8</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>化合物投与量9</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>名
			<td>ネガティブコントロール 
			(100%LC活性)</td>
			<td>---</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>名
			<td>化合物固有蛍光制御</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>89μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>名
			<td>ポジティブコントロール 
			(LC活性0%)</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
ハイスループットスクリーニングのための自動操作
5. バッファー、試薬、コンパウンドプレート、バーコード、必要な機器の準備
<ol>
	<li>密封されたストックコンパウンドプレートを室温で少なくとも1時間解凍します。</li>
	<li>アッセイバッファー(40 mM HEPES、pH 7.4および0.01% Tween-20)を500 mL(またはスクリーニングする化合物の数によってはそれ以上)調製し、滅菌をろ過します。ろ過されたアッセイバッファーは、RTで数ヶ月間保存できます。</li>
	<li>組換えBoNT/A LC(1-425)の8.75 nMワーキング希釈液をアッセイバッファーで調製し、ボルテックスでボルテックスし、氷上に保存します。少量の384ウェルプレートの各ウェルには、8 μlが必要です。10〜15%の過剰分、または約3.7 mLまたは各低容量の384ウェルプレートを調製します。</li>
	<li>10% DMSOを含むアッセイバッファーで3.5 μM FRETベースのBoNT/A LC基質を調製します。まず、基質の5 mMストック溶液を適切な容量の100%DMSOで直接希釈し、次にアッセイバッファーをゆっくりと(滴下して)加え、穏やかに混合します。ホイルで包み、氷の上に保存します。低容量の384ウェルプレートの各ウェルには2μlが必要です。10〜15%の過剰分、または少量の384ウェルプレートごとに約1 mLを調製します。</li>
	<li>黒色の384ウェル小容量マイクロタイタープレート[assay plate]ごとにバーコードを用意し、バーコードスキャナが読み取れるプレートの側面に直接ラベルを貼付します。ラベルがプレート側からはみ出さないように注意してください。そうしないと、プレートの取り扱いや積み重ねの妨げになることがあります。プレートを番号順に積み重ねて脇に置きます。天板を覆います。このステップはオプションですが、複数のプレートを使用すると、対応するコンパウンドへの結果の追跡が容易になります。</li>
	<li>解凍して密封したストックコンパウンドプレートを200 x gでRTで30秒間遠心分離します。プレートシールを慎重に取り外し、残っている接着剤をすべて取り除き、蒸発を防ぐためにプレートを清潔なプラスチックの蓋で覆います。プレート表面に接着剤が付着していると、自動蓋転写やプレートの積み重ねに支障をきたす可能性があることに注意してください。蓋付きのプレートをリキッドハンドラーに取り付けられたホテルに置きます。プレートを覆わないままにしておくと、蒸発が発生します。</li>
	<li>積層型蛍光マイクロタイタープレートリーダーを構成して、励起波長490 nmおよび発光波長523 nmで、それぞれ30分ごと(キネティックモード)にRTで3〜6サイクル、各アッセイプレートの蛍光を読み取る</li>ように構成します。
</ol>
6. ピンツールの準備
<ol>
	<li>384ヘッドピンツールを目視検査し、反り、破片、大きな破片などの異常がないか確認します。</li>
	<li>3つの別々のトレイに、約1インチの100%メタノール(HPLCグレード)、100%イソプロパノール(HPLCグレード)、および超純水で希釈したピンツール洗浄液を充填します。</li>
	<li>リキッドハンドラーのクリーニングステーションに100%DMSOを充填します。</li>
	<li>清潔な新しいあぶらとり紙を2〜3枚トレイに積み重ねます。ピンがあぶらとり紙に接触するが、パンクしないように、Z軸でロボットをキャリブレーションすることが重要です。</li>
	<li>洗浄後のピンを乾燥させるために、作業領域にファンアタッチメントを固定します。</li>
	<li>ピンツールをリキッドハンドラーのロボットアームに取り付け、DMSOに浸し、あぶらとり紙で乾燥させ、洗浄液に2分間浸し、あぶらとり紙で乾燥させ、イソプロパノールに浸し、あぶらとり紙で乾燥させ、あぶらとり紙で乾燥させ、メタノールに浸し、あぶらとり紙で乾燥させ、最後にファンで乾燥させます。</li>
</ol>
7. 少量リキッドディスペンサーの調製
<ol>
	<li>少量(1〜10μl)のカセットをリキッドディスペンサーに取り付け、廃棄物ラインを適切な容器に接続します。</li>
	<li>カセットのディスペンスノズルを目視検査し、反ったり、破れたり、詰まったりしていないことを確認します。降水量や破片が液体の分布に影響を与えるため、チャネルとノズルを清潔に保つことが重要です。</li>
	<li>30 mlの超純水、30 mlの70%エタノール、次に30 mlの超純水を直接廃棄物容器に流して、チャネルをプライミングします。</li>
	<li>少量の384ウェルアッセイプレートを液体ディスペンサーにセットし、各ウェルに既知量の水を加えます。目視検査して、各ウェルが正しい量を受け取っていること、およびウェル間にこぼれたり溶液が分注されていないことを確認します。</li>
	<li>チューブを空気で約5秒間プライミングして、水を取り除き、チャネルを乾燥させます。</li>
</ol>
8. アッセイプレートへのBoNT/A軽鎖の分注
<ol>
	<li>リキッドディスペンサーのインテークラインをBoNT/A LCワーキング溶液に浸し、プライムして空気を除去し、少量の384ウェルアッセイプレートの各ウェルに8μlを分注します。プレートは、リキッドハンドラーの作業領域に手動で配置することも、付属のプレートホテルを使用して自動的に配置して再積み重ねすることもできます。</li>
	<li>各プレートを清潔なプラスチック製の蓋で覆い、リキッドハンドラーに取り付けられたプレートホテルの別の列に積み重ねます。プレートを密封しないままにしておくと、蒸発が発生します。</li>
	<li>30 mlの超純水、30 mlの70%エタノール、30 mlの超純水を再度廃棄物容器に直接流して、液体ディスペンサーを清掃します。</li>
	<li>チューブを空気で約5秒間プライミングして、チャネルを乾燥させます。</li>
</ol>
9. アッセイプレートへの化合物のスタンピング
<ol>
	<li>リキッドハンドラープラットフォーム上のエリアをコンパウンドプレート、アッセイプレート、洗浄液入り容器に割り当てます。</li>
	<li>コンパウンドプレートとアッセイプレートを指定の位置に配置し、スタンピング前にプレートの蓋を取り外すようにリキッドハンドラーをプログラムします。</li>
	<li>化合物50 nlを8 μlのBoNT/A LCを含むアッセイプレートに直接スタンプします。スタンピングプログラムを校正する際は、ピンが水没していることを確認してくださいが、アッセイプレートの底部を傷つけないでください。100% DMSOに化合物を添加すると、分散時に酵素変性の局所ゾーンが生じる可能性があることに注意してください。したがって、DMSOのみのコントロールと未処理のコントロール(つまり、DMSOを添加していない酵素)を比較することにより、酵素変性のレベルを評価するように注意する必要があります。.</li>
	<li>各プレートの後のピンは、DMSOに浸し、あぶらとり紙で乾燥させ、イソプロパノールに浸し、あぶらとり紙で乾燥させ、メタノールに浸し、あぶらとり紙で乾燥させ、最後にファンで乾燥させます。</li>
	<li>化合物を酵素でアッセイプレートにスタンプした後、ストック化合物プレートとアッセイプレートを別々に積み重ねます。蒸発を防ぐためにスタック内の上部アッセイプレートを覆い、脇に置きます。LCを化合物と室温で少なくとも5分間インキュベートしてください。多数のプレートをスタンピングする際には、より長いインキュベーション時間を使用できます。</li>
</ol>
10. アッセイプレートへの基質の分注
<ol>
	<li>リキッドハンドラーのインテークラインをBoNT/A LC基板の作動溶液に浸し、光から保護します。ディスペンス ノズルをチェックして、ノズルが乾燥していて詰まっていないことを確認します。チャネルをプライミングして、すべての気泡を取り除きます。</li>
	<li>アッセイプレートをアンスタックし、基質の作業希釈液2 μlを各ウェルに分注します。基質が各ウェルに直接分注されていることを確認します。プレートを積み重ね、空のアッセイプレートを1枚目のプレートの上に置き、空のプレートを1枚ずつ積み重ねて底面プレートの下に置き、プレートリーダーでの読み取りおよび再スタッキング中の蒸発を防ぎます。</li>
</ol>
11. 蛍光測定
<ol>
	<li>すぐにアッセイプレートのスタックを蛍光プレートリーダーにロードします。</li>
	<li>ステップ5.7で以前に指定した設定で蛍光測定を開始します。各化合物のアッセイレートは、相対蛍光単位(RFU)の経時的なグラフから計算されます。非抑制率を得るためには、ネガティブコントロール(DMSO)を含めることが重要であることに注意してください。既知の阻害剤によるポジティブコントロールも各プレートに添加することができます。1 つの時点からの代表的な出力を図 2 に示します。</li>
</ol>
12. クリーンアップ
<ol>
	<li>各コンパウンドストックプレートをローラーを使用してホイルシールでシールし、-80°Cで保存します。</li>
	<li>各アッセイプレートが読み取られた後、プレート、バイオハザード廃棄物に残っているLC / Aまたは基質希釈液を廃棄します。</li>
</ol>

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<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+discovery+of+potent+inhibitors+of+botulinum+neurotoxin+A%3A+development+of+a+robust+LC+MS+based+assay+operational+from+low+to+subnanomolar+enzyme+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations.</a> Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).</li>
<li>Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+proteins+as+enhanced+FRET-based+substrates+for+botulinum+neurotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity.</a> Toxicon. 53, 392-399 (2009).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明するFRETベースのBoNT/A LCアッセイは、BoNT/A LC活性を調節する小分子を同定および特徴付けるための魅力的な方法です。アッセイの溶液ベースの性質により、このプロトコルは、プロトコルテキストの自動操作セクションで説明されているハイスループットスクリーニングに適しています。Zファクターは、HTSキャンペーン18に対するアッセイの適合性を判断するためによく使用されます。Z = 1 – 3 (σp + σn)/(μp - μn) として決定され、Z ファクター 1 が理想的で、0.5-1 が優れており、0.5 未満が限界です。ここで説明するHTSプロトコルのZファクターは0.89です(ポジティブコントロールとネガティブコントロールの標準偏差は、それぞれp = 6.67 RFU / minおよびσn = 0.788 RFU / min σであり、ネガティブコントロールとポジティブコントロールの平均速度はμp = 196.1 RFU / minおよび...

ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)は、現在知られている最も強力な毒素(LD50 ~1 ng/kg)1)で、細菌Clostridium botulinumによって産生される強力な神経毒です。罹患した宿主内では、BoNT/Aは運動ニューロンに結合し、細胞質に内在化し、最終的にはアセチルコリンエキソサイトーシスに不可欠なニューロンタンパク質を切断することにより、神経筋接合部での神経伝達を妨害します。ニューロン内に入ると、BoNT/Aは数ヶ月も持続する可能性があります2。アセチルコリン放出の長期阻害は、正常な筋肉収縮を妨げ、 ?? 緩性麻痺を引き起こし、重症の場合、心不全および/または呼吸不全を引き起こす可能性があります。.その極めて高い効力、生産の容易さ、および宿主内での長期的な影響のために、CDCはすべてのBoNT血清型を高リスクのバイオテロ剤と分類しています。
毒素の作用機序には、ニューロン表面受容体への結合、受容体媒介性エンドサイトーシスによる細胞の取り込み、ニューロンサイトゾルへの転座など、多くのステップが含まれます。BoNT/Aは、重鎖と軽鎖の2つの鎖から構成されており、毒性には両方の鎖が必要です。重鎖(HC)には結合ドメインと転座ドメインが含まれ、軽鎖(LC)にはエンドソームから細胞質に移行する亜鉛依存性メタロプロテアーゼが含まれています。細胞質の内部に入ると、LC/Aメタロプロテアーゼは細胞質内膜に局在し、膜結合した宿主タンパク質SNAP-25を切断します。SNAP-25は、アセチルコリンエキソサイトーシスに重要な役割を果たすSNARE(可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体)タンパク質ファミリーのメンバーです(参考文献3でレビュー)。SNAP-25のLC/A切断はSNARE複合体の機能を損ない、アセチコリン神経伝達物質の放出を阻害し、筋肉の収縮を損ないます。
現在、ボツリヌス中毒の治療は限られており、多くの場合、馬の中和抗体4の投与が含まれますが、毒素は急速にニューロンに取り込まれるため、抗体は投与の時間枠が狭くなります。したがって、多くの研究者は、BoNT/A LCがより良い治療標的である可能性があると考えています。LCは亜鉛依存性メタロプロテアーゼであるため、LC/A活性を阻害するアプローチの1つは、活性部位の亜鉛イオンをキレート化する化合物を開発することでした。例えば、ヒドロキサメート化合物は活性部位の亜鉛をキレート化し、優れたin vitro効力を有します(これまでで最高のBoNT/A LC低分子阻害剤のKiは77 nMです)5。しかし、多くの低分子は、水溶性の低さ、代謝の速さ、細胞毒性の高さなど、ex vivoまたはin vivoでのさまざまな問題により、治療薬として進歩しません。したがって、改善された薬理学的および薬物動態学的特性を有する新しい化合物が必要である。低分子化合物の同定には、多くの場合、新規のスキャフォールドを同定するためのハイスループットスクリーニング(HTS)が含まれます。BoNT/A LC活性スクリーニングの初期方法は、短いペプチド基質切断のHPLC検出に基づいていましたが、これは時間がかかり、HTSアプリケーションには適していません6-8。その後、Schmidtら9は、マイクロタイタープレートに共有結合したフルオレセイン標識ペプチド基質を利用したハイスループットBoNT/A LC活性アッセイを開発しました。BoNT/A LCは基質を切断してフルオレセインを放出し、フルオレセインを放出しますが、これは蛍光光度計で定量できます。このアッセイのプレートフォーマットにより、多数の化合物を同時にスクリーニングできます。しかし、このアッセイでは、合成ペプチドをフルオレセインで標識し、アッセイプレートを誘導体化した基質分子でコーティングする必要がありますが、これは面倒な技術です。低濃度でBoNT/A LC活性を検出するためのはるかに簡単な方法は、後にSchmidtらによって説明され、一連の蛍光性基質を使用してBoNT LC活性をリアルタイムでモニターしました10。文献に記載されている追加の技術には、粗抽出物中のBoNT活性を検出および定量するための共鳴エネルギー移動ベースのアッセイ後の脱分極が含まれます。この方法は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)および偏光信号を測定するための高度な機器が必要ですが、ハイスループットアプリケーション10,11に使用できます。最後に、BoNT中毒のいくつかの細胞ベースのモデルが報告されており(参考文献11でレビュー)、研究者は細胞毒性、細胞透過性、安定性など、前述の化合物のしばしば制限的な特性を研究することができます。しかし、既存の細胞ベースのアッセイのほとんどはHTSに適しておらず、労力と時間を大量に消費します。
ここでは、市販のFRETベースのBoNT/A LC基板を利用したHTS法の詳細なプロトコールについて説明します。この基質は、SNAP-25切断配列に基づいており、末端フルオロフォアとクエンチャーを含む合成13-merペプチドです。BoNT/A切断により、蛍光色素とクエンチャーが分離されるため、FRETがなくなり、蛍光測定が増加するため、蛍光光度計プレートリーダーで連続的に測定することができます。このアッセイは、新しいクラスのBoNT/A LC阻害剤を同定するため、または以前に同定された化合物5,12-15の相対的な効力を決定するために、当社および他の研究室で日常的に使用されています。このアッセイは、その簡便さ、自動化の可能性、低コストの材料、および多数の化合物を同時にスクリーニングする能力から、HTSに適しています(参考文献16;Caglič et al.、提出;Bompiani et al., 準備中)。HTSに加えて、このアッセイは、化合物のIC50値(BoNT/A LC活性の50%を阻害するために必要な濃度)を決定することにより、化合物の相対力価を比較するために使用できます。アッセイは、96ウェル形式で手動で実行することも(プロトコルテキストの手動スクリーニングセクション)、HTS用の384ウェル形式で自動化することもできます(プロトコルテキストの自動運転セクション)。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Teknova</td><td>H1021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>メタノール(HPLCグレード)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール(HPLCグレード)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル ブラックアッセイプレート</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>384ウェル 少量ブラックアッセイプレート</td><td>Greiner</td><td>788076</td><td></td></tr><tr><td>SNAPtide FITC/Dabcyl substrate</td><td>List Biological Laboratories</td><td>521</td><td>FRETベースのBoNT/A LC基板</td></tr><tr><td>ピン洗浄液</td><td>V&P Scientific</td><td>VP 110</td><td></td></tr><tr><td>糸くずの出ないあぶらとり紙</td><td>V&P Scientific</td><td>VP 540DB</td><td></td></tr><tr><td>Biomekシールとサンプルアルミホイル蓋ベ</td><td>ックマンコールター</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

ボツリヌス神経毒軽鎖モジュレーターの同定と特性評価のためのハイスループット互換fretベースプラットフォーム

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

ボツリヌス神経毒(BoNT)は、宿主の運動ニューロンに結合し、細胞内に取り込まれ、神経伝達物質の放出に不可欠な細胞内タンパク質を切断する強力で潜在的に致死的な細菌毒素です。BoNTは、宿主細胞の結合と内在化を媒介する重鎖(HC)と、アセチルコリン放出に必須の細胞内宿主タンパク質を切断する軽鎖(LC)で構成されています。毒素の結合/内在化を阻害する治療法は投与時間が短いのに対し、細胞内LC活性を標的とする化合物は投与時間がはるかに長く、毒素の半減期が非常に長いことを考えると特に関連性があります。近年、低分子は、より大きな治療薬(ペプチド、アプタマーなど)と比較して細胞透過性が高いことに基づいて、潜在的なLC阻害剤として大きく分析されています。リードの同定には、多くの場合、治療標的機能を調節する能力に基づいて低分子の大規模なライブラリをスクリーニングするハイスループットスクリーニング(HTS)が含まれます。ここでは、市販のBoNT/A LC基質と、潜在的なBoNT阻害剤のHTS用に自動化できる組換えLCを使用したFRETベースのアッセイについて説明します。さらに、フォローアップの二次スクリーニングや、いくつかの候補化合物の効力の比較に使用できる手動技術についても説明します。

FRETベースのBoNT/A LCアッセイは、既知の阻害剤の特性評価や小規模なライブラリーのスクリーニングを目的として、低スループットな手法で手動で実施できます。あるいは、新規のBoNT/A LC阻害剤の同定を目的として、プロトコルをダウンスケールし、大規模ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニング（HTS）用に自動化することも可能です。いずれの手法を採用した場合でも、BoNT/A LCを基質とともにインキュベートすると、時間の経過とともに蛍光強度の増加が観察されるはずです。図1A （蛍光強度の経時変化を示す代表的なプロット図）。化合物を連続希釈して試験した場合、多くの場合、傾きの異なる一連の直線が得られます（図1B）。本稿で説明するプレートレイアウトにおいて、ウェル10は溶媒のみ（DMSO）を添加するため、陰性対照として機能します。この反応速度を「100%酵素活性」（または非抑制活性）と定義し、化合物存在下での速度をこの速度で正規化することで、相対速度または阻害率を算出できます。ウェル11（化合物の固有蛍光対照）およびウェル12（陽性対照）では、水平な曲線が示...

ボツリヌス神経毒A型軽鎖(BoNT/A LC)は、運動ニューロンに侵入し、その基質であるSNAP-25を切断し、神経伝達を妨害するメタロプロテアーゼであり、それによって弛緩性麻痺を引き起こします。ハイスループット対応のFRETベースのアッセイを利用することで、低分子の大規模なライブラリーをBoNT/A LC酵素活性への影響についてスクリーニングできます。

ボツリヌス神経毒軽鎖モジュレーターの同定と特性評価のためのハイスループット互換FRETベースプラットフォーム

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

この手順の全体的な目標は、軽鎖阻害であるボツリヌス神経毒の小分子をスクリーニングすることです。これは、最初に高精度かつ高精度の化合物希釈シリーズを調製することによって達成されます。2番目のステップは、化合物の希釈液を黒色の96ウェルプレートに移すことです。次に、希釈した軽鎖酵素をプレートに加え、この酵素を化合物と室温で5分間インキュベートします。最後のステップは、反応を開始するための軽鎖フレット基質の添加であり、これは蛍光プレートリーダーでモニターされます。最終的には、非蛍光ペプチド基質を利用する二次スクリーニングを使用して、化合物の活性を確認し、阻害剤解離定数やkiなどのより厳密な速度論定数を決定する必要があります。このアッセイは、HPLCベースや細胞ベースの方法などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、実施が簡単で、自動化が容易で、多数の化合物の相対的な力価を比較するために使用できることです。この方法を初めて使用する場合、化合物希釈シリーズを調製し、すべての成分を添加した後にプレートを適切に混合する際に、個人は苦労するかもしれません。この手順は、テキストプロトコルで説明されているようにバッファーと試薬を準備することから開始します。プレートリーダーを中速で10秒間振とうし、その後、キネティックモードで5分ごとに励起波長490ナノメートル、発光波長523ナノメートルの蛍光を室温で1時間30分監視するように構成します。化合物濃度範囲を決定した後、適切な化合物名と濃度でチューブをラベル付けし、Eloqua、100%ジメチルスルフオキシドまたはDMSOをすべてのチューブに使用して、化合物シリアル希釈のためにそれらを準備します。次に、標準的な1〜3希釈シリーズの化合物の段階希釈を調製します。希釈シリーズの最初のチューブで4マイクロリットルのDMSOに2マイクロリットルの希釈化合物を加え、新しいピペットチップでよく混合します。最初の希釈液を2マイクロリットル取り出し、2番目のチューブミックスに4マイクロリットルのDMSOを追加します。残りの希釈液についてもよく繰り返します。化合物の濃度が正確であることを確認するために、化合物の希釈液をよく混合してください。コンパウンドチューブを覆い、室温で脇に置きます 室温で、底が平らで不透明な黒色の96ウェルプレートを取得します。テキストプロトコルに記載されている推奨プレートセットアップを使用します。ウェル1〜9の各対応するウェルの底に直接、それぞれの化合物希釈の1マイクロリットルを手動で分配し、ウェルにテストする化合物の最高濃度の1マイクロリットルを分配します.11。化合物の固有蛍光制御として機能します。この制御は、化合物自体が蛍光性であるかどうか、または基質の加水分解に影響を与えるかどうかを判断するためのものです。10を自動ピ

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Research

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ボツリヌス神経毒素の軽鎖モジュレーターの同定と特性評価のための高スループット対応型FRETベースのプラットフォーム

BoTestマトリックスボツリヌス神経毒素（BoNT）検出アッセイは、急速にサンプルマトリックスの範囲からのBoNTを浄化し、定量化する。ここでは、固体と液体の両方の行列からのBoNTの検出および定量のためのプロトコルを提示し、BOTOX、トマト、ミルクを用いたアッセイを示す。...

BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

ボツリヌス神経毒は、カテゴリーAの生物脅威物質の中で最も強力な毒素の一つですが、曝露後の治療薬は利用できません。ハイコンテントイメージングアプローチは、この毒素の主要な標的である生物学的に関連する運動ニューロンを用いたマルチパラメータースクリーニングを可能にするため、新規阻害剤を同定するための強力な方法論です。...

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インビトロ法とインシリコ法を用いた第IV族ウイルスSSHHPSの解析

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学ぶボツリヌス神経毒A型軽鎖阻害剤のハイスループットFRETベーススクリーニング法。蛍光プレートリーダーで酵素活性を測定し、化合物の同定と特性評価を行う効率的な薬剤探索プロトコルです。

ボツリヌス神経毒軽鎖モジュレーターの同定と特性評価のためのハイスループット互換FRETベースプラットフォーム

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