複数のサイトカインターゲットを定量するためのマルチプレックスビーズベースのイムノアッセイ

ベースにフィルターが付いたマルチウェルプレートを取ります。

異なるサイトカインを含むテストサンプルを追加します。

サイズと内部蛍光強度によって区別されたさまざまなミクロスフェアのセットを追加します。

各セットは、特定のサイトカインを標的とする抗体に結合します。

撹拌下で暗所でプレートをインキュベートします。

抗体は標的サイトカインに結合し、マイクロスフェアに固定化します。

真空を適用して、結合していないサイトカインを除去します。ミクロスフェア結合サイトカインは、膜の細孔サイズが小さいため

マイクロスフェア結合サイトカインに結合するビオチン結合検出抗体のカクテルを追加します。

蛍光レポーター結合ストレプトアビジンを加え、暗所で撹拌してインキュベートします。ストレプトアビジンはビオチンに結合し、レポーターをマイクロスフェア複合体に固定化します。

結合していない分子を除去し、マイクロスフェアを再懸濁します。

フローサイトメトリーを使用して、マイクロスフェアのサイズと内部蛍光を決定することにより、結合したサイトカインを同定します。

特定のサイトカインの量を決定するには、レポーターの蛍光強度を測定します。

アッセイを実行するには、使用前にすべての試薬を室温まで温めます。

このデモンストレーションでは、ポリプロピレンフィルタープレートが使用されています。ビーズの損失を避けるために、洗浄ステップを含むアッセイ手順全体を通してプレートを直立させておくことが絶対に不可欠です。

各ウェルに100マイクロリットルの1x洗浄バッファーを加えてろ紙を事前に湿らせ、プレートを室温で1分間放置します。バキュームマニホールドを使用してバッファーボリュームを取り除きます。清潔なペーパータオルの束にプレートを押して、プレートの底から余分な洗浄バッファーを吸い取ります。次に、逆さまのプレートカバーの上にプレートを置きます。

細胞培養上清サンプルの場合は、すべてのウェルに25マイクロリットルのアッセイバッファーを追加します。各標準液を標準ウェルに25マイクロリットル加えます。最後に、各サンプルを25マイクロリットルをサンプルウェルに加えます。混合ビーズを30秒間渦にします。次に、25マイクロリットルの混合ビーズを各ウェルに加え、ビーズの沈殿を防ぐためにビーズボトルを断続的に振ってください。

プレートシーラーでプレートをシールします。密封したら、逆さまのプレートカバーを含むプレート全体をアルミホイルで包みます。プレートをプレートシェーカーに置き、固定し、室温で約500RPMで2時間振とうします。反転せずに、プレートを真空マニホールドに置き、以前と同じように真空をかけます。次に、200マイクロリットルの1x洗浄バッファーを各ウェルに加えます。

真空ろ過によりアッセイプレートウェルの内容物を除去します。このステップをもう一度繰り返す前に、プレートの底から余分な洗浄バッファーを吸収パッドまたはペーパータオルで吸い取ります。次に、各ウェルに25マイクロリットルの検出抗体を追加します。新しいプレートシーラーでプレートを密封した後、逆さのプレートカバーを含むプレート全体をアルミホイルで包みます。

プレートをプレートシェーカーに置き、室温で約500RPMで1時間振とうします。真空にせずに、25マイクロリットルのストレプトアビジンフィコエリトリン試薬を各ウェルに直接加えます。先ほどと同じようにプレートを密封して包みます。そうしたら。プレートをプレートシェーカーに置き、室温で約500RPMで30分間振とうします。

真空ろ過ステップを2回繰り返した後、200マイクロリットルの1x洗浄バッファーを各ウェルに加えます。ビーズをプレートシェーカーに1分間再懸濁します。マルチチャンネルピペットを使用して、フローサイトメーターでサンプルを読み取るために、フィルタープレートからFACSチューブにサンプルを移します。