蛍光ベースの氷面アフィニティーによる不凍タンパク質の氷結合平面の決定

次の実験の全体的な目標は、蛍光標識された不凍タンパク質によって結合した氷の平面を視覚化することです。これは、不凍タンパク質が第2のステップとして結合できる単一の氷結晶を成長させることによって達成されます。各結晶は、交差した偏光子を通して観察され、その特異点と配向を確立します。

次に、温度制御されたコールドフィンガーに氷の結晶を取り付け、半球に成形します。次に、蛍光標識された不凍タンパク質の溶液に浸して、成長する半球の特定の結合面に不凍タンパク質を吸収します。氷の結果は、蛍光標識された不凍タンパク質によって結合した氷を、暗い冷蔵室で波長特異的な光とフィルターを使用して視覚化およびイメージングすることによって得られます。

氷のエッチングのような既存の方法上のこの技術の主な利点は、不凍タンパク質が蛍光でラベル付けされていることです タンパク質結合氷面の即時の視覚化を可能にするために マイナス0.5°Cで温度制御されたエチレングリコール浴を準備し、それに収まり、浮かぶことができるきれいな金属鍋を見つけることにより、結晶成長を開始します。結晶は型で形成されます。ポリ塩化ビニルパイプから切り出した高さ3〜4センチの円筒形の型を使用します。

各金型には、片側に幅 1 mm、高さ 2 mm のノッチが必要です。ノッチがカットされたリングの側面に真空グリースの薄いフィルムを塗布します。このグリースを塗ったノッチ面を金属パンに密封し、ノッチをパンの中心から離すようにします。

ノッチにグリースを充填したり、邪魔にしたりしないように注意してください。鍋に収まるだけの型を用意します。次に、ろ過したデガスと脱イオン水を型の外側のパンの中央に追加します。

気泡が入らないように注意してください。水層が5ミリメートルに上昇すると、水はノッチを通ってゆっくりと型に入るはずです。完了したら、鍋をエチレングリコール浴に完全水平に置きます。

鍋と水が摂氏マイナス0.5度に達したら、型の外側の鍋の中央に小さな氷を加えます。一晩インキュベートして、次の3日間で氷の層を形成します。お風呂に戻って型に水を加えます。

各金型に摂氏4度の13ミリリットル、ドガ、脱イオン水を堆積させます。水を加えた後、1日1回、エチレングリコール浴の温度を下げます。4日目までに、型は完全に氷で満たされるはずです。

型を取り出し、氷の表面をきれいに準備します。各型を鍋から引き抜き、氷の結晶を押し出します。型を入れたきれいな表面をマイナス20°Cの冷凍庫に1時間置きます。

取り扱い前に。氷の準備ができたら、冷凍室または冷蔵室に持って行き、単結晶であるかどうかを判断します。交差した2つの偏光子の間に氷を置きます。

氷が単結晶の場合、亀裂や不連続性は見られず、結晶内で光の方向が変わらないはずです。偏光子を所定の位置に残したまま、氷が回転したときに透過する光を観察して、C軸の向きを決定します。A AEの向きを決定するには、氷をアルミホイルでしっかりと包みます。

針を海軸に垂直に向け、ホイルを通して氷に小さな穴を開けます。次に、氷を0.5ミリバールの真空に20分間置きます。クリスタルが回収されたら、冷蔵室でそれを発見します。

基底面上の六角形のエッチングを観察します。A AEは、6つの尖った星の頂点を通ります。この結晶は、星の反対側の点に平行な線に沿って半分にカットされます。

一次プリズム面を露出させるには、クリスタルをベンチにしっかりと保持します。弓のこを使ってクリスタルを半分に切ります。冷たい指に取り付けるためのピースを集めます。

氷の結晶は、コールドフィンガーに取り付けるためにさらに準備する必要があり、直径がわずかに異なるが、コールドフィンガーに匹敵するサイズの2本のアルミニウムロッドを見つけます。コールドフィンガーが収まる可能性のある空洞がある場合は、ロッドを使用してキャビティをクリスタルストップの上部に溶かす方法を交互に行います。冷やした指をマイナス0.5°Cに冷やし、氷の空洞に入れます。

クリスタルが金属に凍結するまで、クリスタルを所定の位置に保持します。次に、氷の結晶の約2倍の直径の半球形のカップに、摂氏4度に冷却されたろ過された脱イオン水を満たします。冷たい指で結合した氷の結晶をカップに沈め、余分な水を取り除き、氷の結晶の上部が液体とほぼ同じ高さになり、氷が触れないようにします。

カップの壁はカップを断熱材で覆い、温度を摂氏マイナス5度まで下げます。氷が約1時間かけて半球を形成するのを待ちます。蛍光タンパク質を追加する準備をします。

半球の準備ができたら。カップから氷の結晶を取り出し、カップから水を取り除きます。次に、予め冷却した蛍光標識タンパク質溶液を所望の濃度で25〜30ミリリットル加えます。

総液量を変わらぬまま、氷の結晶をカップに沈めます。又。クリスタルの上部が液体と同じ高さで、カップの壁に触れていないことを確認してください。コールドフィンガーの温度を摂氏マイナス8度に下げ、タンパク質溶液を結晶に2〜3時間凍結させます。

タンパク質溶液から少なくとも5ミリメートルの氷が形成されたら、氷の成長を止めます。冷たい指を付けたまま、氷の結晶をカップから取り出します。クーラントを摂氏0度のすぐ上に温めて、冷たい指を外します。

氷の結晶が溶けるまで待ちます。クリスタルが冷たい指から溶けたら、平らな面を下にしてきれいな面に置きます。新しくできた氷に触れないように注意してください。

結晶を摂氏マイナス20度で少なくとも20分間保管します 暗くなる可能性のある冷蔵室で蛍光作業を視覚化する前に。蛍光標識フィルターとカメラ発光フィルターを励起するための波長特異的励起フィルターを備えたランプを準備します。非特異的な光を遮断するには、氷を平らな面を下にしてランプの下に置き、部屋を暗くして、照らされた氷のパターンを観察します。

不凍タンパク質によって結合している氷面を推定するには、従来の氷エッチング画像と対応する蛍光ベースの氷面のアフィニティ分析の画像を比較します トリクシーを使用したアフィニティ分析 どちらも、冬のヒラメの偽のペクタスアメリカーナによって生成されたタイプ1の不凍タンパク質を示しています。この手法は、異なる不凍タンパク質の氷結合パターンを同時に比較するために使用できます。この場合、Pacific Blueはタイプ3を標識し、NFEA FP 8を標識し、trixyはタイプ1の不凍タンパク質を標識しました。

これは、タイプ3のN-F-E-A-F-Pの8のみを視覚化した結果であり、ここではタイプ1の不凍タンパク質のみがこの画像で視覚化されています。この 2 つが一緒に視覚化されます。C 軸は各イメージで同じであることに注意してください。

このビデオを見れば、単一の氷の結晶を成長させて配向させる方法と、蛍光ベースのアイスプレーン親和性分析を使用して蛍光標識不凍タンパク質のアイスプレーン結合パターンを評価する方法について十分に理解できるはずです。