蛍光ベースの氷面アフィニティーによる不凍タンパク質の氷結合平面の決定

本実験の目的は、蛍光標識された抗凍結タンパク質によって拘束された氷の面を可視化することです。これは、まず単一の氷結晶を成長させ、次にそこに抗凍結タンパク質を結合させることで達成されます。各結晶は、単一であることおよびその配向を確認するために、直交ニコルを用いて観察します。

次に、温度制御されたコールドフィンガーに氷晶を装着し、半球状に形成します。その後、蛍光標識された不凍タンパク質の溶液に浸し、成長する半球状の氷の特定の結合面に不凍タンパク質を吸着させます。暗室化した低温室において、波長特異的な光とフィルターを用いて、蛍光標識不凍タンパク質が結合した氷を可視化およびイメージングすることで、氷に関する結果を得ます。

この手法の既存の方法（アイスエッチングなど）に対する主な利点は、不凍タンパク質が蛍光標識されており、タンパク質が結合した氷平面を即座に可視化できることです。まず、−0.5 °Cに温度制御されたエチレングリコールバスを準備し、その中に適合し、かつ浮かせておける清潔な金属製パンを用意して、結晶成長を開始させます。結晶は型を用いて形成します。ポリ塩化ビニル管から切り出した高さ3〜4 cmの円筒形型を使用してください。

各モールドの片側に、幅1 mm、高さ2 mmの切り欠きを設けます。切り欠きを設けたリングの側面に、真空グリースを薄く塗布します。このグリースを塗布した切り欠き面を、切り欠きがパンの中心とは反対方向を向くようにして、金属製パンに密着させて密封します。

切り欠き部分にグリースが入ったり、塞がったりしないように注意してください。パンに収まるだけの数の型を準備します。次に、型の外側のパンの中央に、ろ過したDegasおよび脱イオン水を加えます。

気泡が混入しないよう注意してください。水層を5 mmまで上げると、水が切り込みからゆっくりと型の中に入ります。完了後、パンをエチレングリコールバスの中に完全に水平に配置してください。

パンと水が-0.5 °Cに達した後、モールドの外側のパン中央に少量の氷を加えます。一晩インキュベートし、その後3日間かけて氷の層を形成させます。バスに戻し、モールドに水を加えます。

各モールドに、4 °Cで脱気・脱イオン化した水を13 milliliters注入します。加水後、1日ごとにエチレングリコールバスの温度を下げます。4日目までに、モールド内が完全に氷で満たされている必要があります。

型を取り出し、氷を置くための清潔な表面を準備します。各型をパンから剥がし、氷晶を押し出します。型を置いた清潔な表面を-20°Cのフリーザーで1時間冷やします。

取り扱う前に、氷の準備が整ったら、フリーザー室またはコールドルームに運び、単結晶であるかを確認します。氷を2枚の直交ニコル（クロスニコル）の間に置きます。

氷が単結晶である場合、亀裂や不連続部は見られず、結晶内で光の方向が変化することはありません。偏光板を装着したまま、氷を回転させたときの透過光を観察して、C軸の方向を決定します。A軸の方向を決定するには、氷をアルミホイルでしっかりと包みます。

針を海軸（sea axis）に対して垂直に配向させ、フォイルを貫通して氷に小さな穴を開けます。次に、氷を0.5 millibarの真空状態で20分間保持します。結晶を取り出した後、コールドルーム内で開封します。

基底面上の六角形のエッチングを観察します。A AEは6つの頂点を持つ星の頂点を通過しています。この結晶は、星の向かい合う頂点に平行な線に沿って半分に切断されます。

一次プリズム面を露出させるため、ベンチ上で結晶をしっかりと固定します。ハックソーを用いて結晶を半分に切断してください。切断した破片を回収し、コールドフィンガーに装着します。

氷晶をコールドフィンガーに取り付けるためのさらなる準備として、コールドフィンガーと同等で、直径がわずかに異なる2本のアルミニウム棒を用意します。これらの棒を交互に使用して、結晶の上部に空洞を溶かして作り、コールドフィンガーが収まる程度の空洞ができたところで停止します。コールドフィンガーを-0.5 °Cまで冷却し、氷の空洞内に設置します。

氷結晶が金属に凍り付くまで固定します。次に、氷結晶の直径の約2倍の大きさの半球形カップに、4 °Cまで冷却したろ過済み脱イオン水を満たします。コールドフィンガーに結合した氷結晶をカップの中に浸し、氷結晶の上端が液面とほぼ同じ高さになり、かつ氷が底に触れないように余分な水を取り除きます。

カップの壁面に断熱材を巻き、温度を−5°Cまで下げます。約1時間かけて、氷が半球状に形成されるまで待ちます。蛍光タンパク質を添加する準備をしてください。

ヘミスフィアの準備が整ったら、カップから氷晶を取り除き、カップ内の水を除去します。次に、目的の濃度の、あらかじめ冷却した蛍光ラベル付きタンパク質溶液を25～30 mL加えます。

液体の総量を維持したまま、氷晶をカップに浸します。このとき、氷晶の上端が液面と水平であり、カップの壁面に接触していないことを確認してください。コールドフィンガーの温度を-8 °Cまで下げ、タンパク質溶液を2〜3時間かけて氷晶内で凍結させます。

タンパク質溶液から少なくとも5 mmの氷が形成された時点で、氷の成長を停止させます。コールドフィンガーを装着したまま、カップから氷晶を取り出します。冷却材を0 °Cのわずかに上の温度まで温めて、コールドフィンガーを切り離します。

氷晶が溶け落ちるまで待ちます。氷晶がコールドフィンガーから溶け落ちたら、平らな面を下にして清潔な表面に置きます。新しく形成された氷に触れないよう注意してください。

結晶を-20 °Cで少なくとも20分間保存します。蛍光を可視化する前に、遮光可能な低温室で作業を行ってください。蛍光ラベルを励起するための波長特異的な励起フィルターを備えたランプと、カメラ用のエミッションフィルターを準備します。非特異的な光を遮断するため、氷の平らな面を下にしてランプの下に置き、室内の光を遮った状態で、照明された氷の中のパターンを観察します。

不凍タンパク質によって拘束されている氷平面を推定するために、従来の氷エッチング画像と、それに対応する蛍光ベースの氷平面親和性解析画像を比較します。どちらの画像も、冬ふらpounder（Pseudopleuronectes americana）によって産生されるタイプ1不凍タンパク質を示しています。この手法を用いることで、異なる不凍タンパク質の氷結合パターンを同時に比較することが可能です。本例では、Pacific Blueで標識したタイプ3 NFEA FP8と、trixyで標識したタイプ1不凍タンパク質を用いています。

これはタイプ3 N-F-E-A-F-Pのみを可視化した結果です。ここではタイプ1不凍タンパク質のみが可視化されています。これら2つが同時に可視化されています。各画像のC軸が同一であることに注意してください。

このビデオを視聴することで、単結晶氷の育成と配向方法、および蛍光ベースの氷面親和性解析を用いて、蛍光標識された不凍タンパク質の氷面結合パターンを評価する方法について十分に理解することができます。