蛍光異方性に基づくタンパク質間相互作用の検出

蛍光異方性ベースのタンパク質間相互作用検出では、適切な異方性バッファー中でC末端テトラシステインモチーフでタグ付けされた組換え標的タンパク質から始めます。

蛍光色素を含む色素を加え、テトラシステインモチーフを介して標的タンパク質に結合します。異方性バッファーで透析し、結合していない色素を除去します。混合物を石英キュベットに移します。吸光度を測定し、標識に成功した標的タンパク質の割合を決定します。

蛍光キュベットで、蛍光色素標識された標的タンパク質と非標識タンパク質を混合します。蛍光分光計を使用して、蛍光異方性を測定します。

標的タンパク質がバッファー中に自由に懸濁すると、それらに結合した蛍光色素は、ブラウン運動により軸を中心にランダムに回転します。適切な波長の垂直偏光で励起されると、蛍光色素は垂直面と水平面で偏光した光を放出します。垂直偏光と水平偏光の蛍光強度の比率(異方性)が測定されます。

標識されていないタンパク質が蛍光色素標識標的に結合すると、タンパク質複合体の分子サイズが大きくなり、その回転運動が減少します。その結果、放出された光は偏光が強くなり、水平面よりも垂直面での発光が高くなり、異方性が増加します。

標識されていないタンパク質の濃度を増加させ、異方性測定を繰り返します。

標識タンパク質の添加の増加を伴う異方性の非線形増加は、蛍光色素タグ付き標的タンパク質上の複数の同一の結合部位での非標識タンパク質の結合を示しています。

3ナノモルのSBDS-FlAsHタンパク質と3ナノモルのルミオグリーン色素を5マイクロリットルの異方性バッファーに混合します。摂氏4度で8時間反応を進めます。8時間後、サンプルを異方性バッファーに対して一晩透析し、遊離色素を除去します。石英キュベットを使用して、分光光度計で280ナノメートルと508ナノメートルの吸光度を測定します。次に、ランバート・ビールの法則を使用して、テキストプロトコルに記載されている標識タンパク質の割合を定量化します。

方性値を測定する前に、タンパク質リガンドの各滴定ステップを慎重に実行し、サンプル全体が溶液に分注され、均一になるようにする必要があります。

蛍光キュベットに、200マイクロリットルの30ナノモルSBDS-FlAsHを異方性バッファーに入れ、2マイクロリットルの30マイクロモルEFL1を滴定します。完全に混合し、反応を3分間放置してから、異方性と蛍光値を測定します。総量40マイクロリットルのEFL1が添加されるまで、このプロセスを繰り返します。最後のステップとして、テキストプロトコルで説明されているように、データを推定バインディングモデルに当てはめます。