タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

この手順の全体的な目的は、標的タンパク質における原形質連絡局在化シグナルを同定することです。この手法は、タンパク質を原形質連絡へと導くシグナル内の重要な構成要素を特定することで、植物の細胞間接続の研究における重要な疑問への回答に寄与し、ひいては巨大分子の細胞間輸送を促進します。本技術の主な利点は、手順の信頼性が高く、ほとんどの原形質連絡標的タンパク質における原形質連絡局在化シグナル配列の探索に容易に適応できる点にあります。

植え付け後のろ過および共焦点観察に向けた準備ステップは、一般的な印刷ベースの出版物では習得が困難であるため、本手法のビデオデモンストレーションが極めて重要となります。Nicotiana benthamianaの種子を湿った土壌に高密度で播種します。育成中は、温度20から25 °C、1日16時間の光照射（光量子束密度 約75 µmol photons/m²/s）に制御された環境チャンバー内で管理してください。

u. filの直径が0.5 cmに達した後、苗を慎重に大きなポットに移植し、同じチャンバー内で同一条件にて育成を継続します。4週間以内に、植物が4〜8枚の葉を持つ段階まで成長するまで維持します。

この時点で、最大の葉の直径が4〜6 cmになっているはずです。識別と分析を容易にするため、付属のテキストプロトコルに従って発現系を選択し、各発現タンパク質に蛍光タグを付加します。記載通りにpPZP-RCS2ベースのプラスミドを調製し、1 $\mu\text{g}$のプラスミドを100 $\mu\text{L}$のAgrobacterium tumefaciensコンピテントセル培養液に加えます。

細胞を氷上で30分間インキュベートします。次に、液体窒素中で細胞を1分間急速凍結させます。その後、細胞を28°Cで15分間温め、コンピテントセルの混合液にLB培地を1 mL加えます。

LB培地を添加した後、細胞を28°Cで2時間培養します。次に、細胞を3,000 ×gで1分間遠心分離します。細胞ペレットを0.2 mLのLB培地で再懸濁し、抗生物質選択LB寒天プレートに播種します。

プレート上の細胞を28 °Cで48時間、単一コロニーが視認できるまで培養します。次に、いくつかの単一コロニーをピックアップして新しいLB寒天プレートにストリークし、28 °Cで48時間培養します。その後、各プレートから少量の細菌を回収して解析に供し、コロニーPCRを用いて目的の特定のバイナリーコンストラクトが存在することを確認します。

目的のコンストラクトを持つアグロバクテリウムの各コロニーを、適切な抗生物質を添加した5 mLのLB培地に接種します。28 °Cで一晩培養します。次に、細胞を3,000 ×gで遠心分離します。得られたペレットをアグロインフィルトレーションバッファーで再懸濁し、OD600を0.5に調整します。

懸濁液を室温で2時間インキュベートし、その後、接種液を1 mLのプラスチック製シリンジに充填します。手袋を着用した指でN.Benthamianaの完全に成熟した葉の向軸面を保持し、シリンジのノズルを葉の下表皮に押し当てます。次に、浸潤用培地を用いてアグロバクテリウムをゆっくりと注入し、浸潤させます。

浸潤させた植物を、観察時まで維持します。浸潤から24〜48時間後、ブレードを用いて各葉の葉脈の間を断片状に切り分けます。葉の切片を、葉の背軸面を上にして物玻子の上に配置します。

次に、葉の切片の上に水滴を1滴落とし、カバーガラスで覆います。カバーガラスの両端に小さなテープを貼って固定します。スライドを共焦点レーザー走査顕微鏡にセットし、10倍の対物レンズを用いて、最も信号が強い細胞を特定します。

次に、より詳細な観察を行うため、63倍の対物レンズを使用して画像を記録します。さらに、適切な蛍光波長を用いて、発現した蛍光タンパク質を励起させます。実験間の整合性を維持するため、画像取得に使用したすべての設定を保存しておきます。

各実験条件につき、平均100〜120個の細胞を観察します。共焦点顕微鏡画像を用いて、テストしたタンパク質の局在を診断します。これらの画像は、カーゴ分子であるCFPに融合させたフルレングスのTMV移動タンパク質、およびCFPに融合させた同定済みの原形質連絡局在シグナル、さらにDsRedに融合させて共発現させた原形質連絡局在タンパク質PDCB1において観察される、特徴的な周辺部の点状の原形質連絡局在パターンを示しています。

コントロール条件下では、CFPを融合させたフルレングスのTMV移動タンパク質およびCFPを融合させたTMV移動タンパク質内の局在化シグナルの原形質連絡社へのターゲティングは、ここに示すように、CFPの細胞内局在およびマーカーであるDsRed2の核細胞質局在として現れます。4番目のアミノ酸であるバリンをアラニンに置換すると、フルレングスのTMV移動タンパク質および同定されたTMV移動タンパク質の局在化シグナルの両方において、原形質連絡社へのターゲティングが消失します。このことは、この残基が原形質連絡社局在化シグナルの構造または機能にとって重要であることを示しています。

この手法を習得すれば、適切に行うことで50時間以内に完了させることができます。この手順を実施する際は、植物が非常に健全な状態で、かつ適切な葉の成長段階にあることを確認することが重要です。このビデオを視聴することで、原形質連絡局在化タンパク質シグナルの同定方法だけでなく、植物タンパク質における他の特定のシグナルの同定方法についても十分に理解できるはずです。