タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定
August 15th, 2017
植物の細胞間の接続、原形質 (Pd)、生理学と植物ウイルスの相互作用工場で中心的な役割を果たしてください。Pd 輸送に重要なは、Pd にタンパク質を直接信号を並べ替えています。しかし、これらのシーケンスに関する知識はまだ始まったばかりで。Pd Pd ターゲット蛋白質のローカリゼーションのシグナルを識別するための戦略について述べる。
この手順の全体的な目標は、標的タンパク質のplasmodesmata局在シグナルを特定することです。この方法は、タンパク質をプラスモデスマタに向けるシグナルの批判的思考を特定することにより、植物の細胞間接続を研究する際の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、この手順が信頼性が高く、ほとんどのプラスモデスマタ標的タンパク質におけるプラスモデスマタ局在シグナル配列の発見に容易に適応できることです。
この方法のビデオデモンストレーションは、植栽のろ過と共焦点観察ステップの準備は、一般的な印刷ベースの出版物では習得が難しいため、非常に重要です。Nicotiana benthamianaの種子を湿った土壌に高密度で植えます。成長中は、摂氏20〜25度で、1日あたり16時間未満の光が当たる制御された環境チャンバーに保管します。これには、1メートルあたり約75マイクロモルの光子が1平方メートルあたり1秒あたり約75マイクロモル含まれています。
u. filの直径が半センチメートルに達した後、苗を大きな鉢に慎重に移し、同じ条件下で同じチャンバー内で成長を続けます。4週間以内に4〜8枚の葉の段階に成長するまで植物を維持します。
この時点で、最大の葉は直径4〜6センチメートルである必要があります。同定と解析を容易にするために、発現系を選択し、付属のテキストプロトコルに記載されているように、発現した各タンパク質に蛍光タグを付けます。記載されているようにpPZP-RCS2ベースのプラスミドを調製し、Agrobacterium tumefaciens由来のコンピテントセルの100マイクロリットルの培養物に1マイクログラムを加えます。
細胞を氷上で30分間インキュベートします。次に、細胞を液体窒素中で1分間急速凍結します。次に、細胞を摂氏28度で15分間温め、次に1ミリリットルのLB培地をコンピテントセル混合物に加えます。
LB培地を加えた後、細胞を摂氏28度に2時間戻します。次に、細胞をGの3,000倍で1分間スピンダウンします。細胞ペレットを0.2ミリリットルのLB培地に再懸濁し、抗生物質選択的LB寒天プレートにプレートします。
プレート上の細胞を摂氏28度で48時間増殖させ、個々のコロニーが見えるまで待ちます。次に、いくつかの個々のコロニーをピッキングして新鮮なLB寒天プレートに播種し、細胞を摂氏28度で48時間増殖させます。次に、各プレートから少量の細菌を採取して分析し、Colony PCRを使用して、目的の特定のバイナリコンストラクトの存在を確認します。
目的のコンストラクトを含む各アグロバクテリウムコロニーを、適切な抗生物質を添加した5ミリリットルのLB培地に加えます。細胞を摂氏28度で一晩成長させます。次に、細胞を3, 000倍G.Repaluteで遠心分離し、ペレットを0.5のOD600にアグロインフィルトレーションバッファーで再懸濁します。
懸濁液を室温で2時間インキュベートし、次いで接種物を1ミリリットルのプラスチックシリンジに装填する。完全に成熟したN.Benthamianaの葉を手袋をはめた指で同軸面に持ち、注射器のノズルを葉の下表皮に押し付けます。次に、培地を注入することにより、アグロバクテリウムを浸潤培地にゆっくりと導入します。
浸潤した植物は、観察されるまで維持します。浸潤後24〜48時間で、刃を使用して各葉を静脈間で断片に切ります。アバキシャルリーフサーフェスを上に向けて、リーフスライスをオブジェクトスライドに置きます。
次に、葉のスライスに水を一滴垂らし、カバーガラスで覆います。カバーガラスの両側に小さなテープを貼って固定します。スライドをレーザー走査型共焦点顕微鏡の下に移し、10倍の主観レンズを使用して、最適なシグナルを持つ細胞を同定します。
次に、63X主観レンズを使用して画像を記録し、より詳細な観察を行います。さらに、適切な蛍光灯を使用して、発現した蛍光タンパク質を励起します。実験間の一貫性を維持するために、画像取得に使用されるすべての設定を保持します。
各実験条件について、平均して100〜120個の細胞を調べます。共焦点顕微鏡画像を使用して、試験したタンパク質の局在を診断します。これらの画像は、カーゴ分子CFPに融合した全長TMV移動タンパク質、CFPに融合した同定されたplasmodesmata局在シグナル、およびDsRedに融合した共発現したplasmodesmata局在タンパク質PDCB1で観察された特徴的な末梢点状plasmodesmata局在パターンを示しています。
対照条件下では、CFPに融合した全長TMV移動タンパク質のplasmodesmata標的化とCFPに融合したTMV移動タンパク質の局在シグナルは、CFPの細胞内局在とマーカーDsRed2の核細胞質局在を伴って、ここに示すように現れます。4番目のアミノ酸であるバリンがアラニンに変異すると、完全長TMV移動タンパク質とTMV移動タンパク質で同定された局在シグナルの両方によって標的とされるプラスモデスマタは失われます。これは、この残渣がplasmodesmata局在化シグナルの構造または機能にとって重要であることを示しています。
このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば50時間で完成させることができます。この手順を試みる際には、植物が非常に健康な状態にあり、植物が正しい葉の段階にあることを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、plasmodesmata局在タンパク質シグナルの同定方法だけでなく、植物タンパク質の他の特定のシグナルの同定方法についてもよく理解しているはずです。
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概要
この研究は、植物の細胞間接合を理解する上で重要な、標的タンパク質におけるプラズモデスマの局在化シグナルを特定することに焦点を当てています。説明されている方法は、様々なプラズモデスマ標的タンパク質においてこれらのシグナルを発見するのに信頼性が高く適応性があります。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 植物生理学
- 細胞生物学
- 植物ウイルス相互作用
背景
- プラズモデスマ（Pd）は植物の細胞間輸送に不可欠です。
- 分類シグナルはタンパク質をPdに誘導し、輸送を促進します。
- これらの配列に関する現在の知識は限られています。
- これらのシグナルを理解することで、植物生理学の知識を深めることができます。
研究の目的
- 標的タンパク質におけるプラズモデスマの局在化シグナルを特定すること。
- 植物の細胞間接合の理解を深めること。
- タンパク質輸送メカニズムの研究を促進すること。
使用した方法
- 制御された条件下でのニコチアナ・ベンサミアナ種子の播種。
- 最適な成長条件の維持（20-25掳C, 16時間の日光）。
- 分析のための共焦点観察技術の利用。
- 複雑な手順のビデオデモンストレーションの提供。
主な結果
- この方法はタンパク質の局在化シグナルを効果的に特定します。
- 様々なプラズモデスマ標的タンパク質に適応可能です。
- ビデオリソースは手順の理解を深めます。
- 信頼できる結果は植物生物学の分野に貢献します。
結論
- この研究はPd局在化シグナルを特定するための貴重な技術を提供します。
- これらのシグナルを理解することで、植物生理学研究の進歩につながる可能性があります。
- この方法の信頼性は研究者にとって有用なツールとなります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Identifying plasmodesmata localization signals enables mechanistic de-risking of plant-based expression systems used in recombinant protein production. This approach supports target validation by clarifying subcellular trafficking pathways critical for biologics manufacturing in plant hosts. The method enhances predictive confidence in protein localization, informing go/no-go decisions for plant-derived therapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates protein-sorting mechanisms to validate functional targeting signals necessary for plasmodesmata transport.
- Operational Value: Provides a reliable, adaptable strategy to identify necessary and sufficient localization signals directly in living plant cells.
- Predictive Value: Enables functional confirmation of targeting motifs through mutagenesis, such as valine-to-alanine substitution disrupting localization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescent tagging and confocal microscopy to generate quantitative, reproducible localization readouts.
- Scalability: Supports screening of multiple protein variants via Agrobacterium-mediated transient expression in Nicotiana benthamiana.
- Platform Reuse: The workflow can be applied to diverse plasmodesmata-targeted proteins beyond viral movement proteins.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery of localization signals to downstream evaluation of protein mobility and intercellular transport efficiency.
- Disease-Relevant System: Utilizes a well-established plant model system compatible with transient expression for rapid signal validation.
- Mechanistic De-risking: Reduces uncertainty in protein trafficking by defining cis-acting elements required for plasmodesmata targeting.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where subcellular localization informs protein engineering and construct design for plant-based expression platforms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of targeting sequences via direct visualization of protein localization in planta.
- Screening: Enables assessment of signal functionality through co-localization with plasmodesmata markers like PDCB1-DsRed.
- Analytics: Generates imaging-based quantitative data on subcellular distribution patterns under controlled expression conditions.
- Translational Research: Provides mechanistic insight into intercellular transport, relevant for optimizing protein yield and mobility in plant bioproduction.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized pipeline for localization signal discovery applicable across multiple protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by defining minimal functional sequences required for plasmodesmata localization.
- Operational Value: Delivers a reproducible, video-supported protocol reducing variability in localization assays.
- Strategic Value: Informs construct optimization to enhance intracellular trafficking in plant expression systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of protein candidates based on validated subcellular targeting.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant transient expression, confocal microscopy, and fluorescent protein tagging.
- Dependent on Agrobacterium infiltration infrastructure and controlled plant growth chambers.
- Necessitates standardization of imaging settings and analysis criteria across experimental conditions.
- Adaptation to different plant species may require optimization of infiltration and growth parameters.
- Limited to proteins that can be stably expressed and fluorescently tagged in planta without disrupting native function.
