タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

この手順の全体的な目標は、標的タンパク質のplasmodesmata局在シグナルを特定することです。この方法は、タンパク質をプラスモデスマタに向けるシグナルの批判的思考を特定することにより、植物の細胞間接続を研究する際の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、この手順が信頼性が高く、ほとんどのプラスモデスマタ標的タンパク質におけるプラスモデスマタ局在シグナル配列の発見に容易に適応できることです。

この方法のビデオデモンストレーションは、植栽のろ過と共焦点観察ステップの準備は、一般的な印刷ベースの出版物では習得が難しいため、非常に重要です。Nicotiana benthamianaの種子を湿った土壌に高密度で植えます。成長中は、摂氏20〜25度で、1日あたり16時間未満の光が当たる制御された環境チャンバーに保管します。これには、1メートルあたり約75マイクロモルの光子が1平方メートルあたり1秒あたり約75マイクロモル含まれています。

u. filの直径が半センチメートルに達した後、苗を大きな鉢に慎重に移し、同じ条件下で同じチャンバー内で成長を続けます。4週間以内に4〜8枚の葉の段階に成長するまで植物を維持します。

この時点で、最大の葉は直径4〜6センチメートルである必要があります。同定と解析を容易にするために、発現系を選択し、付属のテキストプロトコルに記載されているように、発現した各タンパク質に蛍光タグを付けます。記載されているようにpPZP-RCS2ベースのプラスミドを調製し、Agrobacterium tumefaciens由来のコンピテントセルの100マイクロリットルの培養物に1マイクログラムを加えます。

細胞を氷上で30分間インキュベートします。次に、細胞を液体窒素中で1分間急速凍結します。次に、細胞を摂氏28度で15分間温め、次に1ミリリットルのLB培地をコンピテントセル混合物に加えます。

LB培地を加えた後、細胞を摂氏28度に2時間戻します。次に、細胞をGの3,000倍で1分間スピンダウンします。細胞ペレットを0.2ミリリットルのLB培地に再懸濁し、抗生物質選択的LB寒天プレートにプレートします。

プレート上の細胞を摂氏28度で48時間増殖させ、個々のコロニーが見えるまで待ちます。次に、いくつかの個々のコロニーをピッキングして新鮮なLB寒天プレートに播種し、細胞を摂氏28度で48時間増殖させます。次に、各プレートから少量の細菌を採取して分析し、Colony PCRを使用して、目的の特定のバイナリコンストラクトの存在を確認します。

目的のコンストラクトを含む各アグロバクテリウムコロニーを、適切な抗生物質を添加した5ミリリットルのLB培地に加えます。細胞を摂氏28度で一晩成長させます。次に、細胞を3, 000倍G.Repaluteで遠心分離し、ペレットを0.5のOD600にアグロインフィルトレーションバッファーで再懸濁します。

懸濁液を室温で2時間インキュベートし、次いで接種物を1ミリリットルのプラスチックシリンジに装填する。完全に成熟したN.Benthamianaの葉を手袋をはめた指で同軸面に持ち、注射器のノズルを葉の下表皮に押し付けます。次に、培地を注入することにより、アグロバクテリウムを浸潤培地にゆっくりと導入します。

浸潤した植物は、観察されるまで維持します。浸潤後24〜48時間で、刃を使用して各葉を静脈間で断片に切ります。アバキシャルリーフサーフェスを上に向けて、リーフスライスをオブジェクトスライドに置きます。

次に、葉のスライスに水を一滴垂らし、カバーガラスで覆います。カバーガラスの両側に小さなテープを貼って固定します。スライドをレーザー走査型共焦点顕微鏡の下に移し、10倍の主観レンズを使用して、最適なシグナルを持つ細胞を同定します。

次に、63X主観レンズを使用して画像を記録し、より詳細な観察を行います。さらに、適切な蛍光灯を使用して、発現した蛍光タンパク質を励起します。実験間の一貫性を維持するために、画像取得に使用されるすべての設定を保持します。

各実験条件について、平均して100〜120個の細胞を調べます。共焦点顕微鏡画像を使用して、試験したタンパク質の局在を診断します。これらの画像は、カーゴ分子CFPに融合した全長TMV移動タンパク質、CFPに融合した同定されたplasmodesmata局在シグナル、およびDsRedに融合した共発現したplasmodesmata局在タンパク質PDCB1で観察された特徴的な末梢点状plasmodesmata局在パターンを示しています。

対照条件下では、CFPに融合した全長TMV移動タンパク質のplasmodesmata標的化とCFPに融合したTMV移動タンパク質の局在シグナルは、CFPの細胞内局在とマーカーDsRed2の核細胞質局在を伴って、ここに示すように現れます。4番目のアミノ酸であるバリンがアラニンに変異すると、完全長TMV移動タンパク質とTMV移動タンパク質で同定された局在シグナルの両方によって標的とされるプラスモデスマタは失われます。これは、この残渣がplasmodesmata局在化シグナルの構造または機能にとって重要であることを示しています。

このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば50時間で完成させることができます。この手順を試みる際には、植物が非常に健康な状態にあり、植物が正しい葉の段階にあることを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、plasmodesmata局在タンパク質シグナルの同定方法だけでなく、植物タンパク質の他の特定のシグナルの同定方法についてもよく理解しているはずです。