組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ
July 23rd, 2013
植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告アグロバクテリウム·ツメファシエンスタンパク質一過性発現のための植物へ。
この実験システムでは、アグロ浸潤を使用して、遺伝子コンストラクトを葉に効果的に送達し、高レベルの組換えタンパク質を産生します。まず、浸透の3日前から6週間、制御された環境でエンドハマナを育てます。浸潤日に植物に発現する標的遺伝子を含むアグロバクテリウム培養物を調製します。
アグロバクテリウム培養物をシリンジまたは真空浸潤のいずれかによって植物組織に導入します。紫外線下でのタバコの葉におけるGFPの緑色蛍光の強度などの結果は、現在の哺乳類の細菌や昆虫ベースの発現システムに匹敵する、植物における組換えタンパク質の強力な発現を示しています。アグロインフィルトレーションは、トランス遺伝子を植物細胞に導入する効果的な方法であり、組換えタンパク質の高レベルの発現につながります。
幅広い植物種にお使いいただけます。最も重要なことは、医薬品タンパク質の商業生産のためにスケールアップできることです。したがって、この方法はGFPの動態と発現に関する洞察を提供し、サブユニットワクチン、組換えモノクローナル抗体などの他のタンパク質に適用でき、がんや感染症の治療に使用できます。
実験を成功させるには、細菌の培養と植物材料の両方に最適な条件が必要です。この潜入プロセスは、視覚的なデモンストレーション後に簡単に再現できます。まず、最大 60 個のピート ペレットを増殖トレイに入れます。
4リットルの水道水を追加し、エンドウ豆のペレットに2時間水を吸収させます。次に、各ピートペレットに2つとハマナの種を追加し、発芽のためにトレイを透明なプラスチックドームで覆います。種子を摂氏25度、湿度84%の環境に置きます。
播種から2週間後、ドームを取り外し、植物を新しいトレイに移します。次に、1リットルあたり1.48グラムの2リットルを追加します。ジャックの肥料 摂氏25度で植物を育て続けます。
2日ごとに湿度50%の環境。トレイごとに2リットルのジャックの肥料を供給します。4週目に、泥炭ペレットを入れた植物を新しいトレイに移し、6つの植物をホストしてさらに6週間齢まで成長させます。
4つ、6週齢のハママ植物とハママ植物を選び、各3枚の葉に5〜6枚の葉があり、目的の遺伝子を保有するアグロ細菌株に完全に浸透します。1枚の葉はネガティブコントロール用、もう1枚の葉はスポット浸潤用です。葉の裏側の表皮に針で小さな切り傷を作り、葉が両側に突き刺さないように注意してください。
首にやさしく逆圧をかけながら、最初の葉の表側をしっかりとつかみます。片手の親指で。浸潤緩衝液中のアグロバクテリウム混合物を注射器、針で首に注入します。
濃い緑色の円が拡大を停止するまで、アグロバクテリウム混合物をニックに注入し続けます。次に、別のニックを作成し、葉全体が浸透し、葉全体が濃い緑色に変わるまで注入を繰り返します。各植物の最初の3枚の葉と4枚目の葉の最後の葉の完全な浸潤は、4つのGeminiウイルスベクターすべてまたは3つのmagconベクターのいずれかのベクターの組み合わせで浸潤します。
また、アグロバクテリウム株の組み合わせごとに1つのニックを作成し、1つの組み合わせで各ニックに浸透します。浸潤後、植物を成長室に戻し、2〜15日間タンパク質の発現を監視します。浸潤後、浴槽を真空乾燥剤に入れ、アグロバクテリウム株を含む3リットルの浸潤緩衝液に移します。
次に、乾燥剤を真空ブランドのダイヤフラム真空ポンプに接続します。次に、植物を乾燥プレートの上に逆さまに置き、プレートを浴槽の上に置いた状態で葉と茎のシステム全体が浸透バッファーに沈むまで、植物と一緒にプレートを下げます。次に、乾燥Oリングをリムに沿って配置します。
チャンバーに乾燥蓋をした後、真空ポンプをオンにし、真空が100ミリバールに達したときにタイミングを開始します。真空ポンプをオフにした後、1分後に乾燥剤の放出バルブを100ミリバールでゆっくりと開き、水中の植物組織の間質腔にアグロバクテリアが侵入できるようにします。この侵入を繰り返します。
ステップ1で良好な浸透を確保します。次に、植物を乾燥剤から取り出し、直立位置に戻します。植物を成長室に戻し、浸潤後2〜15日でタンパク質の発現を監視します。
シリンジの有効性を実証するために、アグロバクテリウムの植物組織への浸潤、2つの異なる分解植物ウイルスベクター、Gemini、viral、magconによる2つの蛍光タンパク質GFPとDs redの発現をテストしました。ジェミニウイルスベクターを含むアグロバクテリアが全面的に浸透したハマナの葉。GFP発現は、UV光下で葉の全領域にわたって観察され、2D PIという早い時期から始まり、4DPIでピーク蓄積に達しました。
対照的に、アグロバクテリウムの組み合わせを含むマグコンベクターを浸潤させた葉は、5DPI後にのみGFP蛍光を示し、7DPIで最大蓄積に達しました。EP one 10 plus P 19のネガティブコントロールアグロバクテリア混合物が浸潤した葉からは緑色蛍光は観察されず、蛍光はGFP遺伝子に特異的であり、葉からのバックグラウンド蛍光の結果ではなかったことを示しています。GFPに発現したmagconベクターの蛍光は、その蓄積のピーク時にGeminiウイルスベクターの蛍光よりも強くなります。
GFPコンストラクトを浸潤させた葉に両方の蛍光タンパク質をシリンジスポット浸潤を伴うGeminiウイルスベクターを介して同じ葉に発現させた場合、大きな壊死は観察されず、浸潤したスポットで予想される蛍光色で検出されました。興味深いことに、GFPとDS REDの共浸潤は黄色がかった蛍光をもたらしました。また、植物の一過性発現系による組換えタンパク質の大規模生産に使用できるスケーラブルなアグロ浸潤法を開発するために、真空浸潤法も検討されました。
予想通り、シリンジ浸潤と比較して、浸潤した植物のすべての葉でGFP蛍光が観察されました。より堅牢で、はるかに短い時間枠で各プラントへの浸透を達成できます。一度習得すれば、このテクニックは48時間で実行できます。
ほとんどの場合、実際の浸潤時間は数分しかないため、アグロ細菌の培養用です 最適なアグロ浸潤効率と標的タンパク質発現のために。プロトコルに従ってください。植物バイオテクノロジーの分野では、植物の成長条件、農嚢細菌濃度、真空圧、持続時間などの重要なパラメータを制御することを忘れないでください。
この実験的アプローチは、広範囲の植物種における新規医薬品タンパク質の開発と生物生産を調査するために使用できます。このビデオを見れば、アグロインフィルトレーションを使用して標的遺伝子コンストラクトを植物に送達し、植物の一過性発現システムが哺乳類の細菌や昆虫の細胞培養物に匹敵する組換えタンパク質を産生できるようにする方法について、よく理解できるはずです。
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概要
この研究は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用して植物内で医薬品タンパク質を生産するスケーラブルな方法を提示します。このアプローチは、植物組織に遺伝子構築物を送達するためにアグロ浸透を利用し、高レベルの組換えタンパク質発現を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 植物バイオテクノロジー
- タンパク質発現システム
- 医薬品生産
背景
- 現在のタンパク質発現システムには、スケーラビリティとコストに制限があります。
- 植物は医薬品タンパク質を生産するための安全な代替手段を提供します。
- アグロバクテリウム・ツメファシエンスは植物における遺伝子送達のための確立されたツールです。
- 一時的発現システムは迅速に高タンパク質レベルを生み出すことができます。
研究の目的
- 植物におけるタンパク質発現のためのシンプルでスケーラブルな方法を開発すること。
- 遺伝子構築物の送達のためのアグロ浸透の有効性を示すこと。
- 植物ベースの発現を従来のシステムと比較すること。
使用した方法
- 遺伝子送達のためのアグロ浸透技術。
- 管理された環境で栽培されたend hamana植物の使用。
- 標的遺伝子を含むアグロバクテリウム培養物の準備。
- 蛍光イメージングによるタンパク質発現の評価。
主要な結果
- 植物組織内で高レベルの組換えタンパク質が成功裏に発現しました。
- 蛍光イメージングによりタバコの葉でのGFPの堅固な発現が示されました。
- この方法は哺乳類および細菌システムに対する利点を示しました。
- アグロ浸透は効果的な遺伝子導入方法であることが証明されました。
結論
- この研究は植物を用いた大規模タンパク質生産の実現可能性を確認します。
- アグロ浸透は一時的遺伝子発現のための有望な技術です。
- このアプローチは医薬品タンパク質生産の効率を高める可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Plant-based transient expression systems address scalability and cost limitations of mammalian cell culture for recombinant protein production. Agroinfiltration enables rapid, high-level expression of therapeutic proteins such as subunit vaccines and monoclonal antibodies. This approach supports early-stage target validation and lead identification by providing a scalable, low-cost platform for protein expression and functional screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of therapeutic targets through high-level recombinant protein expression in planta.
- Operational Value: Provides a rapid, scalable system for protein production to support hypothesis testing and pathway analysis.
- Predictive Value: Facilitates comparative assessment of protein variants, vectors, or expression kinetics for lead selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts (e.g., GFP, DsRed) for assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Supports multi-target screening on single leaves via syringe infiltration for vector or construct comparison.
- Scalability: Vacuum infiltration enables scale-up for larger leaf areas and species not amenable to syringe methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Produces recombinant proteins in disease-relevant plant systems for preclinical evaluation.
- Mechanistic De-risking: Allows co-expression of multiple proteins (e.g., GFP and DsRed) to study interactions or fusion constructs.
- Continuity: Bridges discovery to preclinical work by providing scalable protein supply for functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
The agroinfiltration method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical protein supply, enabling rapid iteration and comparative analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via transient expression of gene constructs to assess protein function and localization.
- Screening: Enables reproducible, quantitative protein production for screening campaigns using fluorescence-based readouts.
- Analytics: Fluorescence intensity measurements under UV light provide quantitative data for comparing expression levels across conditions.
- Translational Research: Generates sufficient protein yields for downstream preclinical testing in vaccine or therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for protein expression across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-level transient expression reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Syringe infiltration offers simplicity and flexibility; vacuum infiltration enables robustness and scalability.
- Strategic Value: Low-cost, scalable production supports better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on protein yield, expression kinetics, and functional output.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant growth, Agrobacterium handling, and infiltration techniques.
- Needs controlled growth environments, infiltration buffers, and vacuum or syringe equipment.
- Standardization across teams requires consistent plant age, bacterial concentration, and infiltration parameters.
- Adaptation across species (e.g., tobacco, lettuce, Arabidopsis) may require optimization of vacuum pressure and incubation time.
- Practical limitations include species-specific infiltration efficiency and the need for fluorescence detection equipment.
