Name: 事前のmRNA基質の3 末端切断：無細胞系を用いたRNAプロセシング反応の解析 in vitroで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶmRNAの3'末端切断in vitro法。転写活性核抽出物と放射性標識RNA基質を用いて切断反応を解析し、RNAプロセスメカニズムの理解に貢献する実験手法を習得できます。

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SVは、NIH K22AI077353とランデンバーガー財団からの資金援助に感謝しています。 KRは感謝NIH（5SC1GM083754）から資金提供を認めている。

<ol><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
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<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li>
<li>Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27-Fluoro-+and+2%27-amino-2%27-deoxynucleoside+5%27-triphosphates+as+substrates+for+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).</li>
<li>Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+polyadenylation+factor+CPF+specifically+interacts+with+the+pre-mRNA+3%27+processing+signal+AAUAAA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA.</a> EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).</li>
<li>Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+factors+are+required+for+3%27-end+cleavage+of+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).</li>
<li>Takagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multisubunit+factor%2C+CstF%2C+is+required+for+polyadenylation+of+mammalian+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).</li>
<li>Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pre-mRNA+cleavage+factor+Im+is+related+to+spliceosomal+SR+proteins+and+can+be+reconstituted+in+vitro+from+recombinant+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits.</a> Mol Cell. 1, 243-253 (1998).</li>
<li>Vries, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pre-mRNA+cleavage+factor+II%28m%29+contains+homologs+of+yeast+proteins+and+bridges+two+other+cleavage+factors%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors.</a> EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).</li>
<li>Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ordered+pathway+of+assembly+of+components+required+for+polyadenylation+site+recognition+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing.</a> Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3%27+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Mol Cell. 33, 365-376 (2009).</li>
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<li>Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+accurate+and+efficient+mRNA+3%27+end+cleavage+and+polyadenylation+of+a+simian+virus+40+early+pre-RNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro.</a> Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).</li>
<li>Hirose, Y., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+phosphate%2C+not+ATP%2C+is+required+for+3%27+end+cleavage+of+mammalian+pre-mRNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro.</a> J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).</li>
<li>Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+activators+of+pre-mRNA+3%27+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage.</a> RNA. 15, 483-492 (2009).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

HeLa細胞核抽出物又はこれらの抽出物から分画し切断因子を用いて行わインビトロプレ-mRNAの3 &#39;切断反応は、コア切断因子の同定とその主な複合体16-21が可能となった。これらの要因に関連するより多くのタンパク質が、最近22を同定されており、in vitroでの反応は、これらのタンパク質が反応に寄与どのように光を当てるし続けることができる。おそらくので、インビボでの反応は、23 cotranscriptionalであるように見える、またはいくつかの要因が抽出および透析中に失われる可能性があるため、効率が悪く、しばしばず、まれに切断が達成される30％以上である。また、反応効率が急に明確な理由もなく日々低下することがあります。そのため、手順が変更またはウイルス感染HeLa CELへの反応を適用しようとする場合は特に、最も重要である理解することが重要であるlsの、他の細胞型または新規基質に関する。 綿密にRNaseフリーの条件下で作業す...

最も成熟した真核生物のメッセージ性RNA（mRNAの）の生合成は、キャッピング、スプライシングおよびポリアデニル化など、いくつかの転写後の修正が必要になります。これらの修飾は、一般に、正しい処理1を確認し、強くmRNAの安定性を増加させるために結合される。 3 &#39;哺乳類プレmRNAの末端形成は5にアデニル酸残基の付加、続いて新生RNAのヌクレオチド鎖切断によって生成される「ポリ（A）ポリメラーゼ（PAP）2-4により生成物を切断した。哺乳類では、切断は、特定のプリRNA配列にアセンブルし、約800 kDaの多成分のタンパク質複合体によって達成される。ポリ（A）シグナル配列、高度に保存された標準的なヘキサヌクレオチド配列AAUAAAは、少なくとも約10〜30塩基下流の切断部位を指示する。このサイトは、特に切断およびポリアデニル化特異性因子（CPSF）との73 kDのサブユニットによって認識されているCSPFは、エンドヌクレアーゼ活性が含まれています。切断刺激因子（CSTF）が下流のポリ（A）サイトの複数の縮重GU-またはU-リッチエレメント配列に特異的に結合する。また、哺乳動物の切断因子I（CFIm）、および哺乳類の切断因子II（CFII）は切断のためにある必要がありました。 CFImは遺伝子の数のために定義された上流の配列要素（使用する）の特定UGUA（N）のサイトを結合し、重要な生理的プロセス5-8に関与していると思われる。 インビトロにおいて 、RNAのプロセシング反応は、一般に放射性標識RNA基質9-12を用いて分析される。これらには、バクテリオファージT7プロモーターまたはSP6からランオフ転写によって合成することができる。以前に特徴付けられていないポリアデニル化部位を研究するとき、それは重要な下流の配列がcDNA中に存在しないかもしれないように、RNA基質を生成するために、ゲノムDNAよりもむしろのcDNAを使用する必要がある。少なくとも150のNT upstreaを含むように設計基板Mおよび50ヌクレオチド下流成熟mRNA上の切断部位/端から。切断産物は、基板よりも速く移動し、;他のフラグメントは、非特異的なヌクレアーゼ作用によって生成することができるのでしかし、反応の特異性は、正しいプロセシングシグナル配列への依存性によって検証されなければならない。したがって、AAUAAA配列（ 例えば AAGAAA）中の点突然変異を有するRNA基質を開裂反応の陰性対照として役立つ。 放射性標識RNAの少量の切断反応に使用されることを考えると、ほとんどの核抽出物中の高い存在量で存在するRNaseが問題となり、抽出調製のための出発材料の選択を制限することができる。 HeLa細胞は、内因性のRNaseを低レベルで含有し、従って、これらのアッセイで良好に機能する傾向がある。 in vivoおよびin vitroでの RNA基質のヌクレオチド鎖切断をすぐにポリ（A）付加、木が続き、切断された中間体は、検出可能な量で存在していないよ。したがって、特定のRNA配列又は切断反応に関与するタンパク質のいずれかを研究するために、実験が発生ポリアデニル化を妨げる条件で行われる。 1は、切断反応を損なうことなく、ポリアデニル化を停止することができますので、何ポリアデニル上の切断の依存性、またはその逆はありません。したがって、ATPは、単一のヌクレオチドがポリ（A）部位に組み込むことができるだけ切断さRNAを検出することができるように、3 &#39;ヒドロキシル基を欠く連鎖停止類似体で置換されている。 複雑さとこのタイプのアッセイの特殊性の高い考えると、我々は、in vitroでのmRNA前駆体の劈開/ポリ（A）機構によりヌクレオチド鎖切断を研究するために、詳細なビデオプロトコルを記載している。我々は、有能な核抽出物を調製放射性標識されたRNA基質を生成、切断反応を行い、その結果を分析し、解釈する方法について説明しますING製品。 図1は、切断アッセイに使用するHIV-1プレmRNAの3 &#39;末端をコードする基質RNAの一例を示している。 HIVのRNAゲノムの3 &#39;末端は、ポリ（A）部位、G+ Uリッチ領域、および全てのウイルスmRNA転写物13の効率的な成熟のために必要であるUSE素子などの多くの重要な調節配列から構成されている。この例では、入力されたRNA基質が338 NTおよびNT切断237に依存することを期待する。ポリアデニルが発生した場合は、製品の汚れは、NT 237と437の間で観察されるであろう。

<table><tbody><tr><td>1 L セルスターフラスコ</td><td>ウィートン</td><td>356884</td><td>さまざまなサイズが利用可能</td></tr><tr><td>4 ポジション低速スターラー</td><td>VWR</td><td>12621-076</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケット遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>アレグラ x-15R SX4500 ローター</td></tr><tr><td>付き 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>オプティマ L-100 XP ウルトラ SW41 ローター</td></tr>付き <tr><td>テーブルトップ遠心分離機 5417R</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>冷蔵サー</td></tr><tr><td>モミキサーインキュベーター</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml コニカルチューブ</td><td>コーニング</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>BD ファルコン</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラクリア遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>JOKLIK モディファイド MEM</td><td>ロンザ</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトラス</td><td>F-0500-A</td><td>熱不活性化</td></tr><tr><td>L-glut:pen:strep</td><td>ジェミニバイオプロダクツ</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Mediatech</td><td>46-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>フィッシャー</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>MP バイオメディカル 194844</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャー</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Alexis Biomedicals</td><td>280-001-G-010</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>5 M 塩化ナトリウム溶液</td><td>Mediatech</td><td>46-032-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889-100ml</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャー</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>フィッシャー</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>ロシュ</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>スライド・A・ライザー透析カセットキット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>66372</td><td>MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml</td></tr><tr><td>15 ml デュースティッシュグラインダーセット</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D9938-1SET</td><td>さまざまなサイズが利用可能</td></tr><tr><td>ハイフィデリティPCRキットを展開</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>Y02256</td><td>各ヌクレオチド</td></tr><tr><td>MaxiScript SP6/T7 kit</td><td>Ambion</td><td>AM1322</td><td></td></tr><tr><td>m7G(5')ppp(5') G RNA cap</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td></td></tr><tr><td>Century Marker Template Plus</td><td>Ambion</td><td>AM7782</td><td></td></tr><tr><td>イージータイズ UTP [&alpha;-32P] 250 &mu;Ci</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU507H250UC</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングバッファー II</td><td>Ambion</td><td>8546G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 処理水</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Fisher</td><td>BP13354</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Ameresco Life Sciences</td><td>0658-4L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>フィッシャー</td><td>BP169-212</td><td></td></tr>過<tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>フィッシャー</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>フィッシャー</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>40% 19:1 アクリルアミド:ビスアクリルアミド</td><td>バイオ・ラッド</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>ロシュ</td><td>10.901.393 001</td><td></td></tr><tr><td>100% 無水エタノール 200 プルーフ</td><td>アクロス</td><td>61509-0040</td><td></td></tr><tr><td>酸性フェノール:RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シンチレーション流体</td><td>フィ</td><td>ッシャーSX18-4</td><td></td></tr><tr><td>Rnase阻害剤</td><td>プロメガ</td><td>N261B</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール-PVA</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>クレアチンリン酸</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>100mM dATP</td><td>フィッシャー</td><td>BP2560-4</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>アクロス</td><td>23042-5000</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>フィッシャー</td><td>BP1700-100</td><td></td></tr><tr><td>調整可能なシーケンシングユニット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351881-1EA</td><td></td></tr><tr><td>バインダークリップ</td><td>オフィスデポ</td><td>838-056</td><td></td></tr><tr><td>20 cm x 42 cm ガラスプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352543</td><td>1 セット</td></tr><tr><td>20 cm x 22 cm ガラスプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35252-7</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>20 cm x 42 cm アルミニウム冷却プレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352667</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>0.4 mm x 22 cm スペーサー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35230-6</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>0.4 mm x 42 cm スペーサー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352314-1</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>8-well comb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35195-4</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>16ウェルコーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351962</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>32ウェルコーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351970</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>ゲルはじくコーティング</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>SGR-0401</td><td>または SGR-0101 (個々のボトル用</td></tr><tr><td>) ゲルローディングのヒント</td><td>レイニン</td><td>GT-10-4</td><td>0.1-10 &mu;l</td></tr><tr><td>シーケンシング PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>PowerPac HV</td><td>5,000 V/500 mA/400 W</td></tr><tr><td>ゲルドライヤー モデル 583</td><td>Bio-Rad</td><td>モデル 583</td><td></td></tr><tr><td>Hydrotech ゲルドライヤー用真空ポンプ</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glogos II グロー・イン・ザ・ダークマーカー</td><td>Agilent</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Film 8 x 10</td><td>Midsci</td><td>BX810</td><td></td></tr><tr><td>Film 14 x 17</td><td>フェニックス</td><td>F-BX1417</td><td></td></tr><tr><td>オートラジオグラフィーカセット</td><td>フィ</td><td>ッシャーFBCA 1417</td><td>8×10サイズ対応</td></tr></tbody></table>

事前のmrna基質の3 &#39;末端切断：無細胞系を用いたrnaプロセシング反応の解析<em&gt; in vitroで</em

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

哺乳動物のmRNAの3 &#39;末端はRNAポリメラーゼII（RNPII）による転写の突然の終了により形成されていない。その代わり、RNPII、成熟RNAの終わりを超えて前駆体mRNAを合成し、エンドヌクレアーゼ活性のアクティブ·プロセスは、特定のサイトで必要とされる。前駆体RNAの切断は、通常、CAジヌクレオチドの後にコンセンサスポリA部位（AAUAAA）から下流にNT 10月30日に行われます。切断複合体、約800 kDaの多因子のタンパク質複合体からのタンパク質は、この特定のヌクレアーゼ活性を達成する。特定のRNA配列の上流および下流のポリA部位のは、切断複合体の動員を制御します。すぐに切断した後、プレmRNAは成熟し、安定したRNAのメッセージを生成するためのポリAポリメラーゼ（PAP）でポリアデニルている。 RNA転写物の3 &#39;末端の処理は、特定の放射性標識RNA基質と細胞の核抽出物を用いて研究することができる。要するに、長い32 &lt;/ SUP&gt; P-標識した未切断前駆体RNAは、インビトロで核抽出物とインキュベートされ、そして切断は、ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによって評価される。適切な切断が発生した場合、より短い5 &#39;切断された生成物を検出および定量する。ここでは、一例として用いて詳細にHIV-1 mRNAの3 &#39;末端プロセシングを切断アッセイを記述する。

RNAのポリ（A）HIV-1の部位（ 図2）の切断アッセイの代表的な結果。我々は、ゲルの上部に最も遅いマイグレーションの帯域で切断されていないRNA基質を、観察することができる。具体的な切断産物が予想されたサイズでゲルに高速に実行され、最も強烈な短い断片のバンドであり、mutpoly（A）の切断アッセイから、特に存在しないポリA配列（mutPolyA）RNA中の点変異を含むコントロール基板。入力基板の分解産物は、時々観察することができる。切断活性の定量化は、切断されていないRNAを100％に正規化し、切断されたRNAの非切断の比のプロットトメトリーによって決定することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51309/51309fig1highres.jpg" width="600" /> 図1 HIV-前の概略図</s...

RNAポリメラーゼIIは、成熟mRNAの3 &#39;末端を越えて延びる前駆体RNAを合成する。成熟したRNAの末端が切断複合体のエンドヌクレアーゼ活性を経由して、RNA配列によって決定されるサイトで、cotranscriptionally生成されます。ここでは、in vitroでの切断反応を研究する方法を詳細に私たち。

事前のmRNA基質の3 &#39;末端切断：無細胞系を用いたRNAプロセシング反応の解析<em&gt; in vitroで</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

本手順の全体的な目的は、3'末端のmRNA切断をin vitroで正常に検討することです。まず、浮遊培養細胞から転写活性を持つ核抽出液を調製します。次に、in vitro転写を用いて放射性標識RNA基質を作製します。第3の手順は、標識したRNA基質をゲル精製することです。最終ステップでは、核抽出物と標識RNA基質を含む切断反応系を構築します。最終的に、垂直放射活性ゲル電気泳動により、3'末端mRNA、切断されていない基質、および切断産物を確認することができます。この手法は1980年代から実施されていますが、手順全体にわたって困難な特定ステップが多く、容易に実行できるものではないため、視覚的な実演が重要となります。洗浄済みでペレット化され、溶解可能な状態の細胞を用意してください。このプロトコルを開始するには、細胞ペレットに新鮮なDTTを含むバッファーを添加します。推定CPVの5倍量の緩衝液を加え、ピペットを用いてペレットを分散させ、懸濁液を氷上で冷却します。10分後、スイングバケットローターを用いて4 °Cで細胞を遠心分離します。遠心後、上清を慎重に吸引除去します。ペレットは溶液を一部吸収し、サイズが膨張します。次に、バッファーAを1 CPV加え、ピペットチップでペレットを穏やかに解砕します。この懸濁液を冷却したホモジナイザーに注ぎ、密着したペッスルで5〜12回ストロークして細胞を溶解させます。少量の分注液を取り出し、トリパンブルーを加えて細胞を確認し、溶解が完全に行われたか判断します。必要に応じて、細胞が90%溶解するまでホモジナイズを続けますが、過剰に行わないようにしてください。その後、溶解物を超清澄超遠心管に移します。全量を記録し、前述の手順と同様に遠心分離を行います。濁った上清を吸引し、氷上で保存します。細胞質分析を行う場合は、ペレットを乱さないように注意してください。ここには核が含まれています。次に、ペレットを高速で15分間遠心分離します。少量の残存上清を除去し、細胞質回収分と合わせてまとめます。次に、PACT核容積を決定します。ペレットに同量のバッファーCを加えます。その後、クリーンダウンホモジナイザー内でピペットを用いてペレットを分散させます。ペッスルで5〜10回強くすり潰し、ペレットを再懸濁させます。ホモジネートを冷却したチューブに移し、転倒混和で30分間混合します。4 °Cでスターラープレートを使用しても構いません。液量が多い場合は、溶解物をUltraClear超遠心管に移し、4 °Cで30分間遠心分離します。約25,000 ×gで遠心した後の上澄みが核抽出物となります。テキストプロトコルに従い、わずか1 µgのテンプレートを用いてダイアリシスを完了させます。SP6またはT7互換プロモーターを含むキットを用いて、in vitro転写によりプロ

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学ぶmRNAの3'末端切断in vitro法。転写活性核抽出物と放射性標識RNA基質を用いて切断反応を解析し、RNAプロセスメカニズムの理解に貢献する実験手法を習得できます。

事前のmRNA基質の3 '末端切断：無細胞系を用いたRNAプロセシング反応の解析

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