事前のmRNA基質の3 '末端切断：無細胞系を用いたRNAプロセシング反応の解析 in vitroで

この手順の全体的な目標は、in vitroで3つの主要なmRNA切断を成功裏に調べることです。これは、まず懸濁液中で増殖した細胞から転写活性核抽出物を作製することによって達成されます。手順の2番目のステップは、in vitro転写を介して放射性標識RNA基質を作成することです。

3番目のステップは、標識されたRNA基質をゲル精製することです。最後のステップは、核抽出物と標識RNA基質を含む切断反応を組み立てることです。最終的に、結果は、垂直放射性ゲル電気泳動による3つのプライムmRNA、UNC切断された基質、および切断された生成物を示すことができます。

この方法の視覚的なデモンストレーションは重要ですが、1980年代から実行されていますが、手順全体に困難な特定のステップが多数あるため、簡単には実行できません。細胞を洗浄し、ペレット化し、溶解の準備ができている。このプロトコールを細胞ペレットに開始するには、新鮮なDTTを含むバッファーを添加します。

推定CPVの5容量を追加し、ピペットを使用してペレットを分解し、懸濁液を氷の上で冷やします。10分後、スイングバケツで細胞を摂氏4度でスピンダウンします。上清を慎重に吸引します。

ペレットはいくらかの溶液を吸収し、サイズが膨らんでいます。次に、バッファーAのCPVを1つ加え、ピペットチップでペレットを静かに砕きます。懸濁液を冷やしたホモジナイザーに注ぎ、5〜12回のストロークで細胞をしっかりと動かします。

少量のアリコートを取り出し、トライアンブルーを塗布し、細胞をチェックして溶解の完全性を判断します。必要に応じて、細胞が90%溶解されるまで細胞の均質化を続けますが、無理をしないでください。次に、ライセートを超透明の超遠心チューブに移します。

総ボリュームを記録し、前と同じように回転させます。曇った上清を吸引し、氷の上に保存します。また、サイトゾル分析では、ペレットを乱さないように注意してください。

それは核を含んでいます。次に、ペレットを高速で15分間スピンダウンします。少量の残った上清を取り除き、サイトゾルコレクションとプールします。

次に、PACTの核体積を決定します。緩衝液Cに相当する容量をペレットに加えます。次に、ピペットを使用して、クリーンダウンホモジナイザーでペレットを取り出します。

蘇生するには、5〜10回のタイトな杵のストロークを使用します。ペレットを吊り下げます。ホモジネートを冷やしたチューブに移し、反転して30分間混合します。

摂氏4度では、攪拌板を使用できます。容量が十分に大きい場合は、ライセートをUltraClear超遠心チューブに移し、摂氏4度で30分間スピンダウンします。約25, 000 gsで、上清は核抽出物です。

テキストプロトコルに従って、わずか1マイクログラムのテンプレートから透析を完了します。SP 6またはT 7適合プロモーターを含むキットを使用して、in vitro転写によりプローブを調製します。ページを読み込むときは、各RNA基質について、3マイクロリットルのマーカーと25マイクロリットルの反応液すべてを使用してください。

また、同様のサイズの転写産物のレーンを間隔を空けることで、相互汚染を防ぎます。600ヌクレオチドプローブが約2時間後に25ワットで動作するようにゲルを泳動させます。ゲルバンドの位置をマークするには、露光したフィルムをライトボックスで照らし、包んだゲルを上に置きます。

オートレーダーマーカーと露光マーカーをフィルムに合わせます。次に、バンドの位置を黒いマーカーでマークして、ゲルをアンラップするバンドを削除します。また、きれいなブレードでゲルのバンド切片を切除し、各切片を独自のチューブに移し、標準的な手順に従ってRNAを溶出します。

すべての試薬を調製した後、標識RNAを摂氏80度に2分間加熱します。次に、RNAを氷の渦である10%PVAに移し、数分間高速でスピンダウンして気泡を取り除き、各反応のマスターミックスの作成に進みます。反応ごとに、5.25マイクロリットルのマスターミックス1を分注します。

次に、6.25マイクロリットルの核抽出物混合物を追加します。次に、全部で50アノモルに希釈した標識RNA基質のマイクロリットルを追加します。各反応は、5つ未満のアノモル標識RNAを使用します。

次に、反応混合物を穏やかにボルテックスし、すばやくスピンダウンします。反応が摂氏30度で最大2時間行われるようにします。反応の時間経過を取ると、最良の結果が得られます プロテイナーゼKを使用して反応中のタンパク質を消化し、その後反応を精製した後 フェノールクロロホルム法を使用して、6%ページの読み込み、マーカーの3マイクロリットルまたはレーンあたりの反応生成物あたり5マイクロリットルで製品を実行します。

次に、ゲルを流し、後でゲル装置を慎重に分解します。ジェルを集めるには、濾紙をしっかりと押し付けて裏返します。ガラスをしっかりと押して、ゲルが紙にしっかりとつかまれていることを確認します。

その後、ジェルを貼ったまま濾紙をゆっくりとはがします。ゲルの露出面をプラスチックで包み、ラップを反対側の濾紙にテープで貼り付けます。濾紙を掃除機に向けてゲルを乾燥機に15分間入れて仕上げます。

その後、ゲルをフィルムまたはリン酸化イメージャーに露光して分析します。切断された。RNA基質は、ゲルの上部で最もゆっくりと移動するバンドです。

太い矢印でマークされた特定の切断生成物は、予想されるサイズでゲル中をより速く移動します。この製品は、ポリーター配列に点変異があるコントロールには存在しません。切断活性の定量化は、DS メトリックプロットで決定しました。

cleavedとcleavedの比率を比較し、RNA、cleavedに正規化されたRNAコントロール。この手順に続いて、ポリアデニル化アッセイなどの他の方法を実行して、ポリAポリメラーゼの活性などの追加の質問に答えることができます。このアッセイは、マグネシウムの添加やEDTAの除去などの反応条件を変更することによって行われます。