3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

この方法の全体的な目標は、mRNAの3つのプライムエンドを捕捉して配列決定することで、mRNAプロセシング、特に3つのプライムエンドの切断とポリアデニル化の研究、および遺伝子発現の定量化を可能にすることです。ここで紹介するA-seq2プロトコールとデータ解析パッケージは、さまざまな細胞タイプや組織における転写産物アイソフォームの生成と機能に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。A-seq2法の主な利点は、長いポリ(A)ストレッチによるシーケンシングを回避し、アダプターダイマーを生成しないことです。

この手順では、80%のコンフルエント度まで増殖した細胞を使用します。増殖培地を取り出し、細胞をPBSで一度洗浄します。ウェルあたり1ミリリットルの溶解バッファーを添加し、ゴムベラを使用して細胞材料をプレート表面から完全に剥離することにより、プレート上の細胞を直接溶解します。

1ミリリットルのピペットチップを使用して、各ウェルからの粘性溶解液を15ミリリットルのプラスチックチューブに移します。23ゲージの皮下注射針に取り付けられた1ミリリットルの注射器でDNAを共有します。プランジャーの上下に激しい動きを数回行い、ライセートが粘性なくなるまで行います。

ライセートを1.5ミリリットルのチューブに移します。20, 000倍g、摂氏4度で5分間回転させ、破片を取り除きます。溶解液から透明な上清を収集します。

オリゴd(T)25磁気ビーズに加え、混合物を再懸濁します。チューブを回転ホイールに10分間置きます。次に、チューブを磁気ラックに2分間置きます。

透明な液体を取り除きます。各チューブに0.8ミリリットルのバッファーAを追加し、チューブを180度2〜3回します。2回目の洗浄からバッファーAを取り出します。

各チューブに0.8ミリリットルのバッファーBを追加し、ラックに2分間放置します。ビーズから結合したmRNAを溶出するには、バッファーBを取り出し、各チューブに33マイクロリットルの水を加え、ビーズを再懸濁します。ハートブロックで摂氏75度に5分間加熱します。

すぐに、チューブを1秒間回転させ、磁気ラックに置きます。上清を新しいチューブに移します。各チューブに66マイクロリットルのアルカリ加水分解バッファーを加え、混合して95°Cで加熱ブロックで正確に5分間加熱します。

すぐに、チューブを氷の上で冷やします。その後、テキストプロトコルに記載されているように、RNAクリーンアップキットを使用してRNA単離を行います。この手順を開始するには、各RNAサンプルにポリヌクレオチドキナーゼマスターミックスの14マイクロリットルを追加します。

摂氏37度で30分間インキュベートします。30分後、調製したスピンカラムにキナーゼ反応をロードします。カラムを735倍gで2分間回転させます。

カラムを廃棄し、回収した反応の入ったチューブを氷上に置きます。RNAフラグメントの3つの主要な末端をブロックして、その後のライゲーション反応での連結を避けるために、各サンプルに17.5マイクロリットルのポリ(A)ポリメラーゼマスターミックスを添加します。混ぜ合わせて1秒間紡ぎます。

37°Cで30分間インキュベートします。30分後、各反応に32.5マイクロリットルの水を加え、テキストプロトコルに記載されているようにRNAを精製します。この手順を開始するには、反応液を真空濃縮器に10分間入れ、容量を6マイクロリットルに減らします。

次に、各反応に24マイクロリットルのRNAリガーゼマスターミックスを加えます。24°Cの加熱ミキサーで反応を16時間インキュベートし、1000RPMで断続的に混合します。翌日、各反応に17マイクロリットルの水を加えて混合します。

テキストプロトコルに記載されているように、RNAを精製します。溶離石を真空濃縮器に3分間入れ、容量を11マイクロリットルに減らします。逆転写反応のために、反応を200マイクロリットルのPCRチューブに移します。

プライマーを1マイクロリットル追加します。PCRサイクラーで摂氏70度で5分間加熱した後、室温で5分間放置します。8マイクロリットルの逆転写マスターミックスを各チューブに加え、混合します。

チューブをPCRサイクラーに入れます。摂氏55度に10分間、さらに80度に10分間加熱します。氷の上を保ってください。

テキストプロトコールに記載されているように、ストレプトアビジンビーズを調製します。逆転写反応をビーズ溶液に加え、回転ホイール上で摂氏4度で20分間インキュベートします。磁気ラックを使用して、ビーズをビオチン結合バッファーで2回、TENバッファーで2回洗浄します。

ビーズを50マイクロリットルのTENバッファーに再懸濁します。2マイクロリットルのウラシルDNAグリコシラーゼ酵素混合物を加え、37°Cでミキサーで1時間インキュベートし、間欠的に混合します。各反応に50マイクロリットルの水、11マイクロリットルのRNase Hバッファー、および1マイクロリットルのRnase Hを加えます。

摂氏37度で20分間インキュベートします。チューブを磁気ラックに置き、切断されたcDNAを含む液体を新しいチューブに移します。テキストプロトコルに記載されているように、PCR精製キットを使用して切断されたcDNAを精製します。

精製したcDNAを真空濃縮器に8分間入れて、7マイクロリットルの容量に濃縮します。単離されたcDNAの5つのプライム末端に5つのプライムアダプターをライゲーションするには、各サンプルに23マイクロリットルのRNAリガーゼマスターミックスを添加し、摂氏24度で20時間インキュベートします。最後に、各反応に70マイクロリットルの水を追加します。

パイロットPCRは、指数関数的位相内でライブラリ増幅に到達するための最適なPCRサイクル数を決定するために実行されます。200マイクロリットルのPCRチューブに以下をピペットで移します:25マイクロリットルのDNAポリメラーゼミックス、20マイクロリットルのライゲーション反応、2マイクロリットルの水、1.5マイクロリットルのフォワードPCRプライマー、1.5マイクロリットルのリバースPCRインデックスプライマー。次のプログラムでサイクラーを実行します:摂氏95度で3分、続いて摂氏98度で20秒、摂氏67度で20秒、摂氏72度で30秒のサイクルが続きます。

指示されたサイクルの後、サイクラーから直接7マイクロリットルのアリコートを収集します。2%アガロースゲル上で産物を分離し、PCR産物の移動を可視化します。指数増幅の開始時のサイクル数(この例では12サイクル)を決定し、このサイクル数を大規模なPCR反応に使用します。

2%アガロースゲルでの大規模PCR反応から生成物を分離し、200〜350ヌクレオチドDNA生成物を含むゲルスライスを切り取ります。続いて、テキストプロトコルに記載されているように、ゲル抽出キットを用いてゲルスライスからDNAを抽出します。このビデオでは、最も重要な計算手順のみを示します。

詳細については、テキストプロトコルを参照してください。まず、Git リポジトリをクローンし、新しく作成したディレクトリに変更します。ソフトウェアを含む環境を作成し、この環境をアクティブ化します。

A-seq2データが取得された生物のゲノム配列をダウンロードしてください。設定ファイルを開き、テキストプロトコルに示されているように入力パラメータを設定します。解析を開始します。

HNRNPCタンパク質のノックダウンに対する特定の遺伝子NUP214の応答は、コントロールの低分子干渉RNAまたはHNRNPCの低分子干渉RNAのいずれかで処理されたHEK-293細胞の2つのサンプルからのa-seq2リードを分析することによって調べられました。解析パイプラインによってアノテーションされたポリ(A)サイトを文書化したリードはBAM形式で保存され、IGDゲノムブラウザへの入力として使用されました。読み取られたピークの 3 つのプライムエンドは、アンサンブルでアノテーションされた mMRNA でマッピングされた 3 つのプライムエンドです。

プロファイルは、HNRNCRノックダウン時に長い3プライムUTRアイソフォームの使用が増加したことを示しています。A-seqプロトコールを習得すると、細胞培養と夜間のライゲーションの時間は含まず、8時間のハンズオン時間または約2〜3日かかります。プロトコールを試みるときは、まず、お客様の場所で使用されているシーケンシングプラットフォームに準拠したプライマルセットを設計することが重要です。

mMRA 3プライムエンドを取得したら、架橋や免疫沈降などの他の方法を準備して、プレmRNAの3プライムエンドプロセシングの調節因子を同定することができます。A-seq2は、RNAプロセシングの分野の研究者が、個々の細胞タイプにおける選択的ポリアデンリル化の調節と結果を探求する道を開きました。このビデオを見れば、mRNAの3つのプライムエンドのライブラリを作製する方法、シーケンシングデータの解析方法、新しいポリ(A)サイトの同定方法、使用量の定量化方法について十分に理解できるはずです。

A-seq2がmRNAプロセシングの制御を開始する際の作業を容易にし、多くの新しい洞察につながることを願っています。