Name: 3 末端配列 A seq2 とライブラリの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: 学ぶA-seq2プロトコルによるmRNA 3'末端の捕捉・シーケンス法。mRNA処理、ポリアデニル化、遺伝子発現定量の研究に応用可能。アダプターダイマー生成を回避し、高品質ライブラリを構築する。

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著者らは、細胞培養のヘルプについて夫人 Béatrice Dimitriades をありがとうございます。この作品は、スイスの全米科学財団の補助金 #31003A_170216 と 51NF40_141735 によって支持された (国立がん RNA &#38; 病)。

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

コアや mRNA の 3' 終わり処理に関与している補助要因の多くは、それに応じて複雑な起こる風景に反映されます。また、起こるも転写、スプライシングなど他のプロセスの変化に敏感です。Mrna の 3' 終わり胸の谷間サイトは通常 5' 開裂製品に追加される特性多尾に基づいて識別されます。ほとんどのメソッドを使用して、ポリ (A) の特定の変換を許可する変数の長さのランダムプライマー プライマー-逆転写反応の Cdna に Mrna を含みます。このアプローチの一般的な問題は、人工胸の谷間サイトの結果の豊富なシーケンスに内部起爆剤です。サンプル準備の段階でこのアーティファクトを回避することを目指す 2 つの方法が提案されています。3 P seq の方法1のアダプターが具体的にポリ a の尾の部分の RNase T1 消化し、唯一の deoxynucleotide として反作用で TTP と逆のトランスクリプションが続くスプリント oligo の助けを借りての両端に組み合わされて。結果 poly(A)-poly(dT) heteroduplexes は、RNase H で消化され、残りの RNA のフラグメントの分離、アダプターに結紮およびシーケンスします。シンプルでエレガントな方法、2 P seq、シーケンシング反応で残りのランダムプライマー ストレッチは同じ作者2によって報告されたスキップ カスタム シーケンス プライマーを使用します。関連メソッドで 3' 35 の異常に長いプライマー私たちと読み取り 45 Ts、また、ビオチンを含む 50 以上のヌクレオチドのポリ a の尾を持つ RNA 分子を選択する厳しい洗浄に続いて、断片化された RNA に焼鈍します。3' 読み取り内部プライミングの周波数を大幅に短縮、なくなるわけでなく完全にそれ3。直接 RNA 配列のためのプロトコルも提案されているが、結果の読み取りエラー率が高いをして、短いとこのアプローチされていないさらに先進18,19,20。ポリア Seq と製品化のクオンツ Seq プロトコル cDNA の第 2 鎖合成20のランダムなプライミング手順に基づくランダムプライマー プライミングを兼ね備えています。モロニー マウス白血病ウイルス (MMLV) 逆転写酵素とテンプレート スイッチの逆転写反応の使用単一ステップのリンカーと Cdna の生成につながるし、それにより PAS Seq および SAPAS メソッドでないアダプター ダイマーが表示21,22。
A seq2 メソッドは、ビオチン化ランダムプライマー プライマー内劈開ヌクレオチド (dU) の活用で際立ってを紹介しました。この変更を組み合わせたランダムプライマーを交配、ライブラリを準備する前に孤立した断片からオリゴ (dT)25シーケンスのほとんどの除去と polyadenylated ターゲットおよび 3 Ts の保全の充実のユーティリティをポリ a の尾の前の存在を示します。対照的に、ランダムに RNA 分子からポリ a を削除するリボヌクレアーゼ H を利用する方法をいくつかとして残します。A seq2、シーケンスはアンチセンス鎖の 3' 末端から行われる、ので、胸の谷間のサイトは塩基配列読み取りの先頭 NNNNTTT モチーフの後に位置する予測されます。無作為化のテトラマー PCR 増幅アーティファクトの除去も呼び出す基本を許可するだけではなくサービスを提供します。長い行政にも対応できます。内部プライミングの可能性 A seq2 内に残りますと負荷に対処は、最初 3' を破棄して終了で内部のプライミングによって説明することができる 3' 側クラスターを破棄して、genomically でエンコードされた、A 豊富な下流のシーケンスと、A 豊富な多信号自体。多数のプロトコルによって一意に推論多サイトの最近の分析は、A seq2 に固有のサイトが予想されるヌクレオチドの分布とシーケンス プロトコルを終了し遺伝子のような他の 3' 内の場所をいるを示します。
A seq2 の重要なステップは、polyadenylated RNA の選択とリボソーム Rna と様々 な低分子 Rna の除去です。オリゴ (dT)25磁気ビーズの mRNA 分離キットでこれは最も簡単です。原則として、ソリューションも含むフェノールで分離された総 RNA は、高品質の mRNA 分離キットまたはオリゴ (dT) agarose によって選択をさらに受けることが RNA を与えます。A seq2 に変化するステップは、短縮または拡張サイズの異なる RNA のフラグメントを取得することができるアルカリ加水分解による治療です。重要なは、3' 3' ポリ a ポリメラーゼによって RNA のフラグメントの端に dATP 添加効率がよいこともです。ここで説明したプロトコルで、この治療法は ligation の反作用の間に concatemerization を避けるために、すべての RNA のフラグメントに適用されます。最後に、我々 はここで cDNA 分子の 5' 端にアダプターを縛ること事がある、RNA リガーゼ 1 は RNA リガーゼとして通常使用されますが、また効率的に単一の鎖の DNA を郭を注意します。
したがって、A seq2 は、効率的で mRNA 3' 末端処理サイトの識別のためのプロトコルを実装する簡単です。今後の展開は、プロトコルと必要な材料の量の量をさらに削減を含めることができます。さらの計算データ解析ツールの関連するセットは、3' 末端のさまざまなプロトコルを用いての読み取りをシーケンスの均一処理を有効にします。

キャプチャと mRNA の 3' 端のシーケンスは、mRNA プロセシングの研究と遺伝子の発現定量をことができます。真核生物 Mrna がポリ a の尾のためビードを固定化したオリゴ チミジン (cDNA 合成の主なことができます oligo(dT)) 分子と合計セル lysates から効率的に精製することができます。ただし、このアプローチには、2 つ欠点があります。最初、トラン スクリプト内部にある A の伸張できる cDNA 合成、スプリアス多サイトの結果の主要なも。第二に、均質多ストレッチは、トラン スクリプト識別のための情報されていない別のシーケンスの特定課題を提起します。ポリ a を逆転写など、これらの制限を回避するために様々 なアプローチが提案されているツインテール RNase H 消化 (3 P seq 1)、続いて 20 で終わるカスタム配列のプライマーの使用 Ts (2 P seq 2) の選択基準RNase H 消化 (3' 読み取り3)、そしてヘアピン (A seq 4) で 3' アダプターを含むオリゴ dT プライマーの使用によって続いて CU5T45プライマーで 50 以上のヌクレオチドのポリ a の尾を持つ RNA 断片。
最近開発された A seq2 方法5は多と特に発生するアダプターの自己 ligation によって生成されるダイマーの割合を最小限に抑えるために同時にシーケンスをバイパスすることを目的とするときのアダプターのモル濃度挿入濃度を上回る。この問題は、両方のアダプターが、seq2、3' アダプターが逆転写後の RNA のフラグメントと Cdna の 5' 末端に 5' アダプターの 5' 端に結紮がようにポリヌクレオチド終了の同じ型に組み合わされてときに排除できます。方法は当社従来 - seq - シーケンスが、5'-に - 3 年より便利な ' により、正確に方向制御 RNA 断片化-、ポリ a サイトの識別の高精度を維持しながら。典型的なサンプルのシーケンス処理された読み取りの約 80% はゲノムに一意にマップし、以上 20,000 多サイト クラスター、注釈付き 3' UTRs と重複の 70% 以上の識別に 。
簡単に言えば、A seq2 プロトコルは mRNA の断片化と逆の補数 3' 5' RNA のフラグメントの端にアダプターの ligation から始まります。ポリ (A)-含む Rna は、リバース 3' 末端、位置 4 dU および 5' 端、ビオチンでアンカー ヌクレオチドを含む 25 のヌクレオチド (nt) 長いランダムプライマー プライマーと転写磁気ストレプトアビジン ビーズに cDNA のバインディングが可能です。、ビオチンを含むプライマーのほとんどはウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) と DNA グリコシラーゼ リアーゼ エンドヌクレアーゼ VIII を含むユーザー酵素ミックスによるデュで胸の谷間で cDNA から削除されます。胸の谷間に残るポリ a テールの位置をマークするこの反応 5' アダプター、および 3 つの Ts 左の結紮のためそのまま終了を残します。受信者の 5' 端に結紮 5' と 3' の両方のアダプターが添付されているので、アダプターの二量体は生成されません。4 ヌクレオチド ランダム-mers 読み取りの初めに導入された最新のシーケンシングの楽器のクラスター分解能を可能し、検出と PCR 増幅アーチファクト除去のため分子意識 (UMI) としても利用できます。UMI のサイズは、他の研究6ではさらに増加することができます。プロトコルすべて無作為化の四量体で、5' 端始まるによって PCR 増幅デジタルアーティファクトの補正で 3 診断 Ts を持っている読み取りの 3 ts 処理に続いて始まる mRNA 3' 端に相補的な逆が読み取りを生成します。行政、3' アダプター配列除去を悪用し、逆に補完。A 豊富なサイトは内部でランダムプライマー プライミングから由来している可能性があります読み取りまた計算識別、破棄されます。偽のサイトは一般的に 18 の特徴の一つを欠いているとする必要があります保存された多信号 〜 21 ヌクレオチド上流明らか胸の谷間サイト7の。
プロトコル細胞培養と一晩をカウントされません約 8 h の実践的な時間が必要です。解析ソフトウェアで高精度な多サイト id を関連付けられている読みます。ポリ a サイトからクラスターが作成この注釈付きの遺伝子とこれらの原稿 (コントロール siRNA と si HNRNPC 処理細胞の 2 つの生物学的複製) 84% 重複と 3' UTR、75% の重複、86% どちらかとさらに強調表示 4 のサンプルに基づいて、3' UTR またはターミナル エクソン。3' 端レプリケートのサンプルでの発現のピアソンの相関係数は 0.92 と、0.9 以上の値は、通常、メソッドで取得します。したがって、A seq2、非常に再現性のある結果を与える便利な方法です。

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース、超高純度</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー</td><td>アジレント</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>コルジセピン三リン酸 (3' dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>DNA 低結合バイアル、1.5 ml</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&rsquo;S リン酸緩衝生理食塩水</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-Green 色素</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>1:10,000 dillution</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 または NextSeq 500 次世代シーケンサー</td>を使用 <td>Illumina</td><td>サプライヤーにお問い合わせください</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA ポリメラーゼミックス</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, yeast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Polynucleotide kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNAリガーゼ1、高濃度</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0437M</td><td>には、PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute RNAクリーンアップキットが含まれています</td><td>キアゲン</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus、リボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV 逆転写酵素</td><td>Thermo Fisher Scientiific 18090050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER enzyme mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 磁気ラック</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>加熱式ふた付き加熱ミキサー</td></tr><tr><td>MicroSpin カラム</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline加水分解バッファー、1.5 x</td><td></td><td></td><td>Mix 1 1 部 0.1 M Na2CO3 および 9 部 0.1 M NaHCO3。EDTAを1 mMに加えます。pHを9.2に調整します。アリコートは-20°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>5x ポリ(A)ポリメラーゼ緩衝液</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl、pH 7.0、3 mM MnCl2、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、0.5 mg/ml アセチル化 BSA、50% グリセロール</td></tr><tr><td>ビオチン結合緩衝液</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris&shy;Cl pH 7.5、2 M NaCl、0.1% NP&shy;40</td></tr><tr><td>TENバッファー10</td><td></td><td></td><td>mM Tris&shy;Cl、pH 7.5、1 mM EDTA、0.02% NP&shy;40</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>Sequence</td></tr><tr><td>Oligonucleotides according to Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, for GA-IIx and Hiseq2000/2500 sequencers</td><td>strong><Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>マイクロシンセ</td><td></td><td>5' amino&shy;CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&shy;3フィート</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>マイクロシンセ</td><td></td><td>5' amino&shy;GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3'</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25、RTプライ</td><td>マーMicrosynth</td><td></td><td>5 'ビオチン-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3 '(V = G、AまたはC)</td></tr><tr><td>PCRプライマーフォワード、RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5 'AATGATACGGCGGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG TCCGA 3'PCR</td></tr><tr><td>プライマーリバース、RPI1、太字のMicrosynth</td><td></td><td></td><td>のバーコード5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT 
TGGCACCCGAGAATTCCA 3'</td></tr><tr><td>名称</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>strongComments</strong<></td></tr>Strong<tr><td>>Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, for HiSeq2000/2500 and NextSeq500 sequencers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>マイクロシンセ</td><td></td><td>5'-アミノ-GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
CTCTTCCrGrAUrC-3'HT-rev5A</td></tr> <tr><td></td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' アミノ-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
CTTCCGATCTNNNN</td></tr> <tr><td>3'Bio-dU-dT25, RT プライマー</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3'PCR</td></tr> <tr><td>プライマー フォワード (D501-506)</td><td>Microsynth または Illumina</td><td></td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA CGACGCTCTTCCGATCT -3'PCR</td></tr> <tr><td>プライマー リバース (D701-D712)</td><td>Microsynth または Illumina</td><td></td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3'</td></tr><tr><td>イルミナ多重化のドキュメンテーション:</td><td>イルミナ</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' 末端配列 a seq2 とライブラリの準備

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

過去 10 年間の研究は、複雑で動的なさまざまな mRNA の開裂と起こる反応を明らかにしました。長い 3' 非翻訳領域 (UTRs) の Mrna は、細胞の増殖は優先的に短い 3' UTRs と成績証明書を表現に対し分化した細胞で生成されます。今起こるサイト ゲノムのマップ、mRNA の 3' 終わり処理の規制を検討し開発された、2 番目のバージョンでは seq プロトコルについて述べる。また現在このプロトコルを活用 polyadenylate (豊かに完全に処理された mRNAs のためにほとんどの哺乳類の mRNAs の器官の中に追加される poly(A)) 尾。4 番目の位置にある deoxyuracil の DNA アダプター mRNA 3' 端フラグメントの配列のための精密加工が可能します。細胞培養、一晩を含まないプロトコルは約 8 h ハンズオン時間を必要があります。それに伴い派生シーケンス データの分析のための簡単に使用できるソフトウェア パッケージを提供しています。A seq2 と関連付けられた解析ソフトウェア 10 から、条件の広い範囲で最終的に、mRNA 3' のマッピングに効率的かつ信頼性の高いソリューションを提供する6または少ないセル。

ポリ (A)-アルカリ加水分解による断片化の培養細胞から分離された RNA を含むと Cdna のランダムプライマー プライマーが付いているトランスクリプションを逆で作られました。結果として得られる cDNA はストレプトアビジン ビーズに固定化した、ウラシル特定切除反応でデュ開裂、5 ' アダプターを結紮、3' 端に裂かれたフラグメントの挿入されました。図 1は、実験のグラフィカルな概要を示しています。
Hela 細胞 HEK293 細胞の 10 の6セルされたプロシージャの終わりに蛋白質のコーディングの遺伝子の大半のためのポリ a サイトを特定するのに足りる。ただし、他の種類の細胞や組織の識別された多サイト数実験で使用されているセルの数と彩度をテストする必要があります増加します。パイロットの PCR の代表の結果のステップし、DNA のフラグメントのシーケンスの前にサンプルの分析は、図 2に示します。
シーケンサーから得られるゲノムにマップする準備ができている品質チェック、アダプターによりトリミングされた読み取りで終わる fastq ファイルから始まって計算の分析の前処理のステップを図 3に示します。図 4は、mRNA 3' 末端処理特定のサンプルで特定されたサイトのカタログに対応するゲノムと末尾に読み取りのマッピングで始まる解析手順を示します。複数のサンプルを分析するときの追加手順が個々 のサンプルで発見されたサイトを処理して、3' 末端に一致し、サンプルの間で彼らの余剰を報告する実行されます。これらの手順は、図 5のとおりです。
したがって、サンプル化されている、利用可能な処理パイプラインを通じて (fastq 形式) のファイルを読み取り結果のシーケンスの分析は簡単です。サンプルについての情報を構成ファイルに追加すると、パイプラインの実行は出力ファイルの 2 つの主なタイプになります: 1) ベッド-ファイルとすべて 3' 終了 (は例えば「個々 のサンプルの識別処理サイトsample1.3pSites.noIP.bed.gz「)、2) 研究のすべてのサンプルの間ですべてのポリ a サイト クラスター (clusters.merged.bed) とベッド ファイル。出力では、すべての読み取り (例: "sample1 それぞれの個々 のサンプルからのゲノム座標も含まれています。STAR_out/Aligned.sortedByCoord.out.bam") その後 IGV16のようなゲノムのブラウザーで表示できます。読み取りのプロファイルの外観検査は一般的にポリ a ゲノムの研究で実施された特定の摂動によって発生する変更サイトで配信の最初の一見を提供します。たとえば、図 6の HNRNPC 蛋白質のノックダウンする特定の遺伝子の応答が表示されます。
これらのゲノム広い分布の概要は (表 1) を設けています。具体的には、"カウント/annotation_overlap"ディレクトリ内の出力ファイルを含む特定の注釈機能と重複サイトの分数 (gtf ファイルから入力として提供; 注釈: 3' UTR、ターミナルのエクソン、エクソン、イントロン、遺伝子間)。最後に、各サンプルは、個別の処理ステップの結果は、("sample1.summary.tsv"など) をも保存されます。これの数が含まれています: ゲノムに一意に対応する各サンプル、5' 末端の予想される構造の読み取り、読み取りにおける PCR 重複を崩壊した後で、読み取り、高品質 9.2 のステップで定義されている条件に従って読む読み取り(シーケンス エラーに起因するそれらを崩壊した後手順 9.5 を参照)、複数のマッピングを読み取り (シーケンス エラーに起因するそれらを崩壊した後手順 9.5 を参照)、生 (クラスター化されていない) 3' 端の各サンプルでは、raw 3' 末端処理サイトのサイトを処理候補内部プライミングすることがなくユニークな 3' 終了処理サイト内部プライミング候補と最終的なポリ a サイトのクラスターのセットなしすべてのサンプルから。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
図 1: A seq2 プロトコルの主な手順です。個々 のステップは、図の左側に示されます。挿入の RNA のフラグメントは、逆のトランスクリプション; 後の cDNA の赤く緑の線として描かれています。アダプターは、明るい青またはオレンジに着色されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
図 2: パイロット PCR および最終製品プロファイル。PCR の反作用から (、) の因数は異なるサイクルで収集された、2% アガロースゲル上区切られます。左に数字は、ヌクレオチド DNA の梯子のそれぞれのバンドのサイズを示します。この実験で 12 サイクル (*) は、大規模な PCR の反作用のため選ばれました。サイズの後サンプルの例 (b) 選択は、明らかに平均サイズは約 280 のヌクレオチドのフラグメント サイズ アナライザーで実行します。[FU] 左に数字は相対的な信号強度を示します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
図 3: 読み取りをシーケンシングの前処理のアウトライン。シーケンサー機器関連ソフトウェアによって生成される読み取り fastq ファイルは、対応するゲノムにマップする高品質の読み取りを識別するために処理されます。「データ処理」に記載されているプロトコル個々 手順へのリンクが、パイプライン個々 ステップの入力/出力仕様を示します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
図 4: シーケンスの概要読んで処理、個別 3' 末端の世代にゲノムにマッピングの手順から処理サイト。図は i へのリンクと、パイプラインの個々 のステップの入力/出力仕様「データ処理」に記載されているプロトコル個々 手順を実行。ユーザーに配信される主な出力ファイルは、太字で示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
図 5: 共同規制 3' 末端配列サイトのクラスターを生成する撮影されている手順の概要です。「データ処理」に記載されているプロトコル個々 手順へのリンクが、パイプライン個々 ステップの入力/出力仕様を示します。メイン出力ファイルは、太字で示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
図 6: 3' のプロファイルの例の結果終了 IGV 16ゲノム ブラウザーに表示される NUP214 遺伝子のターミナルのエクソンに沿って処理読み取ります。A seq2 読み取り HEK 293 細胞、コントロール siRNA または HNRNPC siRNA との 2 つのサンプルの調製。解析パイプラインによって注釈が付けられる多サイト記載されている読み取り IGV のゲノムのブラウザーへの入力として使用された BAM 形式で保存されました。MRNA 3' にマップ読み取りピークの 3' 端 Ensembl で注釈が終了します。プロファイルは、HNRNPC ノック ダウン時に長い 3' UTR アイソの使用の増加を示します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>si コントロール複製 1</td>
			<td>si コントロール複製 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>id: 29765</td>
			<td>id: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>raw 読み取りの数</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>トリミングとフィルタ リングは有効な読み取りの数</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>一意にマッピングの読み取り数</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多遺伝子座にマップの読み込み回数</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>個別 3' 末端処理サイトの数</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: 解析パイプラインの出力例。個々 のステップで得られた読み取りの概要。

このプロトコルでは、マッピング mRNA 3' 末端のサイトを処理する方法について説明します。

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

本手法の全体的な目的は、mRNAの3'末端を捕捉してシーケンシングすることであり、これにより、mRNAプロセシング（特に3'末端の切断およびポリアデニル化）の研究や、遺伝子発現の定量化が可能になります。ここで提示するA-seq2プロトコルおよびデータ解析パッケージは、異なる細胞型や組織における転写産物アイソフォームの生成と機能に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。A-seq2法の主な利点は、長いポリ(A)鎖を通り抜けてのシーケンシングを回避でき、またアダプターダイマーを生成しないことです。本手順では、コンフルエンシー80%まで育成させた細胞を使用します。育成培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。各ウェルに1 mLの溶解バッファーを加え、ゴム製スパチュラを用いて細胞物質をプレート表面から完全に剥離させることで、プレート上で直接細胞を溶解させます。1 mLのピペットチップを使用して、各ウェルから粘性のある溶解物を15 mLプラスチックチューブに移します。23ゲージの皮下注射針を装着した1 mLシリンジを用いて、DNAを分注します。溶解物の粘性がなくなるまで、プランジャーを数回激しく上下に動かします。溶解物を1.5 mLチューブに移します。20,000 ×g、4 °Cで5分間遠心分離し、デブリを除去します。溶解物から透明な上清を回収します。oligo d(T)25 磁気ビーズを加え、混合物を再懸濁させます。チューブを回転ホイールに載せ、10分間回転させます。次に、チューブをマグネットラックに2分間置きます。上澄みの液体を除去します。各チューブに緩衝液Aを0.8 milliliters加え、チューブを180度に2〜3回回転させます。2回目の洗浄後、緩衝液Aを除去します。各チューブに0.8 mLのバッファーBを加え、ラックに置いたまま2分間放置します。ビーズから結合したmRNAを溶出させるため、バッファーBを除去し、各チューブに33 µLの水を加えてビーズを再懸濁します。ヒートブロックを用いて75 °Cで5分間加熱します。直ちにチューブを1秒間遠心分離し、マグネットラックに置きます。上清を新しいチューブに移します。各チューブに66 µLのアルカリ加水分解バッファーを加え、混合して、ヒーティングブロックを用いて95 °Cで正確に5分間加熱します。直ちに、チューブを氷上で冷却します。続いて、テキストプロトコルに記載されている通り、RNAクリーンアップキットを用いてRNA抽出を行います。この手順を開始するために、各RNAサンプルに14 µLのポリヌクレオチドキナーゼマスターミックスを加えます。37°Cで30分間インキュベートします。30分後、キナーゼ反応液を調製済みのスピンカラムにロードします。カラムを735×gで2分間遠心分離します。カラムを廃棄し、反応液を回収したチューブを氷上に置きます。その後のライゲーション反応でRNA断片がコンカテマー化するのを防ぐため、各サンプルにpoly(A)polymerase Master Mixを17.5 µL加えます。混合後、1秒間スピンダウンします。37 °Cで30分間インキュベートします。30分後、各反応液に32.5 µLの水を加え、テキストプロトコルに記載されている通りにRNAを精製します。まず、真空濃縮機に反応液を10分間置き、液量を6 µLまで減少させることからこの手順を開始してください。次に、各反応系にRNAリガーゼマスターミックスを24 µL加えます。加熱ミキサーを用いて24 °Cで16時間インキュベートし、その間、1,000 RPMで断続的に混合します。翌日、各反応系に17 µLの水を加えて混合します。テキストのプロトコルに従ってRNAを精製します。溶出液を真空濃縮機に3分間置き、液量を11 µLまで減少させます。逆転写反応を行うため、反応液を200 µL PCRチューブに移します。プライマーを1 µL加えます。PCRサイクラーを用いて70 °Cで5分間加熱し、その後室温で5分間静置します。各チューブに逆転写マスターミックスを8 µL加え、混合します。チューブをPCRサイクラーに入れます。55 °Cで10分間、次いで80 °Cでさらに10分間加熱します。その後、氷上で保持します。テキストプロトコルに記載されている通り、ストレプトアビジンビーズを準備します。逆転写反応液をビーズ溶液に加え、回転ホイールを用いて4 °Cで20分間インキュベートします。マグネットラックを使用し、ビーズをビオチン結合バッファーで2回、TENバッファーで2回洗浄します。ビーズを50 µLのTENバッファーで再懸濁します。2 µLのウラシルDNAグリコシラーゼ酵素ミックスを加え、ミキサーを用いて37 °Cで1時間、時々混ぜながらインキュベートします。各反応液に50 µLの水、11 µLのRNase Hバッファー、および1 µLのRNase Hを加えます。37 °Cで20分間インキュベートします。チューブをマグネットラックに設置し、切断されたcDNAを含む液を新しいチューブに移します。テキストプロトコルに記載されている通り、PCR精製キットを用いて切断されたcDNAを精製します。精製したcDNAを真空濃縮機に8分間置き、7 µLまで濃縮します。単離したcDNAの5'末端に5'アダプターをライゲートするため、各サンプルに23 µLのRNAリガーゼマスターミックスを加え、24 °Cで20時間インキュベートします。最後に、各反応液に70 µLの水を加えます。ライブラリ増幅を指数増殖期内で行うための最適なPCRサイクル数を決定するために、パイロットPCRを実施します。200 µLのPCRチューブに、25 µLのDNAポリメラーゼミックス、20 µLのライゲーション反応液、2 µLの水、1.5 µLのフォワードPCRプライマー、および1.5 µLのリバースPCRインデックスプライマーをピペッティングします。サーマルサイクラーを以下のプログラムで運転します：95 °Cで3分間、続いて98 °Cで20秒、67 °Cで20秒、72 °Cで30秒のサイクルを20回繰り返します。指定のサイクル数経過後、サイクラーから7 µLずつ分注して回収します。産物を2%アガロースゲルで分離し、PCR産物の泳動を確認します。指数関数的増幅が始まるサイクル数（本例では12サイクル）を決定し、このサイクル数を大規模PCR反応に使用します。2%アガロースゲルを用いて大規模PCR反応の産物を分離し、200〜350ヌクレオチドのDNA産物を含むゲルスライスを切り出します。その後、テキストプロトコルに記載されている通り、ゲル抽出キットを用いてゲルスライスからDNAを抽出します。本ビデオでは、最も重要な計算ステップのみを示します。詳細はテキストプロトコルをご参照ください。まず、Gitリポジトリをクローンし、新しく作成されたディレクトリに移動します。次に、ソフトウェアを含む環境を作成し、この環境をアクティブにします。A-seq2データが得られた生物のゲノム配列をダウンロードします。設定ファイルを開き、テキストプロトコルに記載されている通りに入力パラメータを設定してください。解析を開始します。HNRNPCタンパク質のノックダウンに対する特定遺伝子NUP214の応答を、コントロールsiRNAまたはHNRNPC siRNAで処理した2つのHEK-293細胞サンプルのa-seq2リードを解析することで検討した。解析パイプラインによってアノテーションされたpoly(A)部位を記録したリードはBAM形式で保存され、IGDゲノムブラウザへの入力として使用された。リードピークの3'末端は、EnsemblでアノテーションされているmRNAの3'末端にマッピングされた。これらのプロファイルは、HNRNCRのノックダウンに伴い、長い3' UTRアイソフォームの使用が増加していることを示しています。A-seqプロトコルに習熟すれば、細胞培養とオーバーナイトのライゲーション時間を除き、実作業時間は8時間、期間としては約2〜3日で完了します。本プロトコルを実施する際は、まず使用する施設のシーケンシングプラットフォームに適合したプライマーセットを設計することが重要です。mMRAの3'末端を取得した後は、クロスリンクや免疫共沈降などの他の手法を用いて、pre-mRNAの3'末端プロセシングの制御因子を特定することができます。A-seq2は、RNAプロセシング分野の研究者が、個々の細胞型における選択的ポリアデニル化の制御とその影響を探索するための道を開きました。このビデオを視聴することで、mRNA 3'末端ライブラリの構築方法、シーケンシングデータの解析方法、新規poly(A)サイトの特定、およびその利用率の定量化について、十分に理解できるはずです。A-seq2がmRNAプロセシングの制御に関する研究の開始を容易にし、多くの新たな知見につながることを願っております。

3-end-sequencing-library-preparation-with-a-seq2

Research

JoVE Journal

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