ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化
2019年1月3日
Botin ストレプトアビジン戦略を使用して精製した RNA ・ タンパク質複合体は、更なる精製および機能解析の不適切なフォームで変性条件下に溶出されます。ここでは、ネイティブと完全に機能 RNA ・ タンパク質複合体をもたらす RNA と穏やかな UV-溶出のステップの写真分解リンカーを利用してこの戦略の変更について述べる。
この方法は、RNAタンパク質複合体を単離し、質量分析によってその組成を同定しようとしている研究者に興味深いはずです。私たちのプロトコルは、限られた量の細胞に存在し、長い多段階の精製手順の間に解約する傾向がある複合体を浄化するのに特に有用であると考えています。この方法の主な利点は、単一の精製ステップのみを含み、任意の長さおよび配列のRNA結合部位で使用できることです。
いくつかのステップを実証するのは、私たちのグループの上級研究技術者であるXiao-cui Yangです。65ヌクレオチドよりかなり長い結合部位については、テキストプロトコルに概説されているように、T7生成されたRNAおよびアダプタPCBオリゴヌクレオチドを得る。結合バッファーの100マイクロリットルを含む1.5ミリリットルチューブにアダプターオリゴヌクレオチドの100ピコモールとRNAの20ピコモールを混合します。
沸騰したお湯にチューブを入れ、5分間インキュベートさせます。その後、水を室温まで冷却します。最初のサプリメント 1 ミリリットルのマウス核エキス 80 ミリモル EDTA で pH 8 で最終濃度 10 ミリモル.
次に、PCB部分でタグ付けされたRNA基質の5〜10個のピコモールを加えます。氷の上で5分間インキュベートし、サンプルを時折混ぜるようにします。次に、摂氏4度で予冷したマイクロ遠心分離機を使用して、混合物を10,000倍のgで10分間遠心し、潜在的な沈殿物を除去します。
慎重にペレットを転送しないように注意しながら、氷上の新しいチューブに上清を収集します。約100マイクロリットルのストレプトアビジンアガロースビーズ懸濁液を1.5ミリリットルチューブに移します。約1ミリリットルの結合バッファーを加えると、ビーズの洗浄を開始します。
チューブを2〜3分間25回gで遠心分離し、上清を吸引する。この洗浄および遠心分離プロセスを2〜3回繰り返し、ビーズを結合バッファーと平衡化した。平衡ビーズ上に組み立てられた複合体を含む、以前に収集された上清をロードします。
チューブ回転器を使用して、チューブを摂氏4度で1時間回転させ、RNAと結合複合体をビーズに固定します。次に、チューブを2〜3分間25回gで回転し、チューブの底部にあるビーズを収集します。上清を吸引する。
ビーズを結合バッファーで2回リンスし、先に説明した洗浄プロセスを用いた。2回目の洗浄の上清を取り除いた後、1ミリリットルの結合バッファーを加え、サンプルを摂氏4度で1時間回転させます。2〜3分間、25回gでサンプルをスピンダウンします。
次に、1ミリリットルの結合バッファーを追加し、懸濁液を新しいチューブに移します。サンプルを摂氏4度で1時間回転させます。固定化された複合体を25回gで2〜3分間遠心する。
次いで吸気上清、200マイクロリットルの結合緩衝液を加えた。ビーズを500マイクロリットルチューブに移します。365ナノメートルでUV光を発する高輝度のUVランプをオンにし、それが完全な輝きに達することを可能にします。
ペトリ皿の底を、皿のふたの上にしっかりと詰めた氷で満たします。固定化された複合体を含む管を簡単に渦する。その後、氷の上に水平に置き、あらかじめ温めたランプで覆い、サンプルが電球の表面から2〜3センチメートルであることを確認します。
均一な露出を確保し、過熱を防ぐために、チューブを頻繁に反転させ、ボルテックスしながら、サンプルを合計30分間照射します。この後、25回gで2〜3分間ビーズを回転させ、上清を集めます。遠心分離この上清は、同じ条件を使用してもう一度。
得られた上清を収集し、残存ビーズの転写を避けるために、チューブの底部に少量を残すことを確認してください。SDS-PAGE電気泳動を使用して、UV溶出した上清の一部と、UV溶出後のビーズに残された材料から対応する分数を分離します。次に市販の銀染色キットを用いてゲルを染色する。
UV溶出した上澄み物に存在するタンパク質と、UV照射後のビーズに残っているタンパク質の強度を比較して、UV溶出の効率を評価します。目的のタンパク質バンドを物品化し、質量分析法によってそのアイデンティティを決定します。この後、質量分析法によりUV溶出した上澄みの分画を直接分析し、精製物のプロテオーム全体を公平に決定する。
本研究では、フォトクレアブルビオチンでタグ付けされた幹細胞ループRNAを、マウス骨髄腫細胞から得られた細胞質S100抽出物の1ミリリットルでインキュベートした。そして、UV溶出の効果と効率を、銀染色により解析する。UV溶出前にレンサビジンビーズで多くのタンパク質が検出されます。
長波UVによる照射は、これらのタンパク質の一部のみを上清に放出し、ビーズに非特異的な背景を残します。これは UV 溶出ステップの重要性を強調する。質量分析は、主要なUV溶出タンパク質を3'hExoおよびSLBPと同定し、SLBPは全長タンパク質と多数の短い分解産物の両方で表される。
様々なRNA結合タンパク質として同定された他のタンパク質の少量も、UV照射によって選択的に溶液中に放出される。核抽出物でインキュベートされたフォトクレアブルビオチンでタグ付けされた固定化ショウジョウバエヒストンプレmRNAのUV溶出は、ビーズに残っている非特異的タンパク質の強烈な背景を有する少数のタンパク質のみを上清に選択的に放出した。質量分析は、U7 snRNPの成分であるこれらのタンパク質を同定する。
それらはヒストンプレmRNAへのU7 snRNPの結合をブロックする処理競争相手の存在下で検出されない。高輝度のUVランプを使用し、照射されたサンプルに近い距離に置き、過熱しないようにすることも重要です。UV溶出法は、主要な汚染物質を欠く天然RNAタンパク質複合体を生成し、追加の精製工程および機能アッセイに直接適しています。
紫外線照射時の眼や皮膚への露出は避けてください。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、光分解可能なリンカーと穏やかなUV溶解を利用したRNA/タンパク質複合体の精製のための改良戦略を紹介します。この方法は、さらなる分析に適した、ネイティブで完全に機能する複合体を生成することを目指しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生化学
- 分子生物学
- RNAバイオロジー
背景
- 従来の精製方法はRNA/タンパク質複合体を破壊する可能性があります。
- 既存の戦略では、機能分析に適した複合体が得られないことがあります。
- 光分解可能なリンカーは穏やかな溶解のための潜在的な解決策を提供します。
- この方法は、限られた量の複合体に特に有用です。
研究の目的
- RNA/タンパク質複合体の精製を改善すること。
- 精製後の複合体の機能性を維持すること。
- 精製プロセスを単一のステップに簡素化すること。
使用された方法
- RNAにおける光分解可能なリンカーの利用。
- 複合体を放出するための穏やかなUV溶解ステップ。
- 結合バッファー中でRNAとアダプターオリゴヌクレオチドを混合すること。
- 組成分析のための質量分析法の適用。
主要な結果
- 改良された方法は、ネイティブなRNA/タンパク質複合体を成功裏に生成します。
- 単一ステップの精製は、様々な長さの複合体に対して効果的です。
- 機能性の維持により、さらなる分析が可能になります。
- プロトコルは、上級研究技術者が実演しました。
結論
- この方法はRNA/タンパク質複合体の分離を強化します。
- これは、特に精製が難しい複合体に有益です。
- このアプローチは、RNAバイオロジーの将来の研究を促進する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Single-step purification of RNA/protein complexes using RNA attached to biotin via a photo-cleavable linker addresses a critical bottleneck in isolating native macromolecular assemblies for downstream functional and proteomic analysis. This approach enables the recovery of intact complexes free from major contaminants, supporting high-confidence target validation and mechanistic de-risking in early discovery workflows. The method is particularly valuable for complexes present in limited abundance or prone to dissociation during multi-step purification, enhancing portfolio decision-making at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables isolation of native RNA/protein complexes for unbiased composition analysis by mass spectrometry.
- Supports functional interrogation of complexes without denaturation, reducing mechanistic ambiguity.
- Facilitates target validation by providing high-purity complexes suitable for direct functional assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RNA/protein complexes for downstream screening and assay development workflows.
- Improves reproducibility and standardization by minimizing non-specific background proteins.
- Delivers quantitative, contamination-free samples for reliable compound evaluation and assay calibration.
Translational & Preclinical Research
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by preserving native complex integrity.
- Supports translational biomarker identification through mass spectrometry of purified complexes.
- Reduces risk of false negatives in functional studies by maintaining complex activity post-purification.
Pipeline & Workflow Integration
This UV-elution purification method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing native complexes for both mechanistic studies and downstream screening. It is positioned as a reusable capability for isolating diverse RNA/protein assemblies across multiple targets and model systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling native complex recovery.
- Screening: Delivers assay-ready complexes with minimal background for robust screening workflows.
- Analytics: Provides high-quality samples for quantitative mass spectrometry and comparative analysis.
- Translational Research: Maintains biological relevance for preclinical and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various RNA and DNA binding complexes, supporting broad R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with single-step purification and scalable protocols.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing high-integrity data for early-stage evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling functional and proteomic assessment of candidate complexes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA synthesis, photo-cleavable linker chemistry, and UV handling.
- Needs access to high-intensity UV lamps and mass spectrometry infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and safety during UV exposure.
- Adaptable to both short and long RNA substrates, with protocol variants for each.
- Careful optimization of UV exposure is necessary to prevent sample overheating and ensure efficient elution.
