pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

偏光ベース全内部反射蛍光顕微鏡（pTIRFM）は、細胞膜動態のリアルタイム検出を可能にする。この記事では、調節性エキソサイトーシスの間に膜のリモデリングの研究のためpTIRFMの実装について説明します。技術は、直接的または間接的に、膜形状の変化を伴う細胞生物学における他のプロセスに一般化である。

この手順の目的は、偏光ベースの全反射蛍光顕微鏡が、制御されたエキソサイトーシス中の膜リモデリングの研究にどのように実装されるかを示すことです。これは、まず、光学素子、すなわち1/4波長板と偏光キューブが、離散的なpおよびs励起偏光を生成するように正しく配置されていることを確認することによって達成されます。第2ステップは、pビームとsビームが顕微鏡の光軸を通過し、全反射蛍光またはTIRFのときに視野の同じ部分を照らすコラインであることを確認することです。

次に、イメージングする細胞をカルボシアン化物ダイ、ダイDで染色し、脱分極刺激で刺激してエキソサイトーシスを誘発します。最後のステップは、TIRFで密集したコア小胞が融合する画像をキャプチャすることです。最終的に、P-T-I-R-Fは、クロミン細胞のエキソサイトーシスに起因する膜トポロジーの変化を監視するために、リアルタイムで画像を取得するために使用されます。

パイロメトリーや膜キャパシタンスなどの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、ptro Fが膜の湾曲を報告し、ひいては融合ポートの拡張を直接報告することです。この手法の学習曲線の最も急な部分は、最初にpとsの励起偏光を整列させることを学習することです。これにより、pとsの励起偏光は顕微鏡の光軸を通って移動し、イメージングフィールドの同じ部分を照らします。よく発生する2つ目の問題は、細胞染色、すなわち細胞をddにどのくらいの時間さらすか、そしてよく染色された細胞と染色が不十分な細胞とでは何が構成されるかという問題です。

その手順を実演するのは、当研究室の大学院生であるTA square rowさんです。すべての顕微鏡コンポーネントの電源を開始するために、レーザーとコンピューターは、488ナノメートルレーザーからのビームを1.49開口レンズの後焦点面に向けます。レーザービームが後焦点面に集束すると、レーザービームは出現し、照合され、対物レンズの真上の天井に小さくて明確なスポットとして表示されます。

次に、Xガルバノミラーを調整して、レーザービームが軸から外れ、対物レンズの法線に対して徐々に急な角度で対物レンズから出てくるようにします。次に、全反射またはTIRが達成されたことを確認します。1ミリリットルの生理食塩水とガラス底の皿に10マイクロリットルの蛍光マイクロスフェアを追加すると、TIR界面に最も近い皿の底にあるマイクロスフェアからの蛍光のみが検出されます。

浮遊する微小球の検出は、入射光と対物法線との間の角度が不十分であることを示しています。偏光ベースのイメージングでは、整列した488ナノメートルビームをガイドとして使用し、生の561ナノメートルレーザービームの位置を調整して、同一の光路に沿って移動するようにします。561ナノメートルのレーザーは、シアン化カルボ色素のイメージングに使用されます。

発散レンズとミラーは、561ナノメートルレーザーの下流にあります。ミラーの調整ノブを使用して、ビームが488ナノメートルのビームと同一位置合わせされ、スポットが天井に焦点が合うようにビームを調整します。検流計のミラーがゼロ位置にあるとき、偏光キューブは電界の垂直成分を反射し、水平成分を通過します。

楕円偏光ビームの下流側にある小さな並進ステージに配置されます。その後の偏光の位置合わせを容易にするために、ビームパスは2番目の偏光キューブとミラーを使用してビームを再結合します。シャッターは、最初の偏光キューブと垂直コンポーネントミラーの間に配置されます。

2 番目のシャッターは、水平コンポーネント ミラーと 2 番目の偏光キューブの間に配置されます。これらのシャッターはイメージングソフトウェアによって制御されるため、ユーザーはビーム偏光をすばやく選択できます。偏光フィルターを使用して、各ビーム経路の電界の向きを確認します。

偏光フィルターは、フィルターの軸に沿った伝送のみを許可します。レーザービームの垂直成分と水平成分が互いに位置合わせされ、488ナノメートルビームと位置が合っていることを確認し、必要に応じて調整します。3 つのビームはすべて後焦点面に焦点を合わせ、対物レンズから天井の同じ場所に照合されて現れる必要があります。

このスポットは、将来の配置を容易にするためにXでマークできます。次に、対物レンズに液浸油を一滴垂らします。蛍光マイクロスフィアを含む皿を置きます。

対物レンズで、TIRのミラー移動ソフトウェアでX検流計ミラーを動かしてTIRに入ります。ビームの垂直成分はS偏光であり、ビームの水平成分はP偏光中心、ビーム経路のA/4波長板またはqwになります。レーザー開口のすぐ下流には、偏光した各エバネッセントフィールドとロッドドミンサンプルがあり、これはランダムに配向すると予測されます。

qw プレートを回転させて、平均ピクセル強度に合わせます。ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントするテキストプロトコルに記載されているように、猫の副腎から健康なクロミン細胞を単離し、目的のタンパク質をコードするDNAを含むトランスフェクション細胞を調製しますトランスフェクション効率と細胞生存率の最適なバランスを提供する設定。

ウシクロミン細胞のこの調製のために、1、100ボルト、40ミリ秒、および1パルスは、ポリデリシンおよびコラーゲン処理皿上に穏やかにトランスフェクションプレート細胞を温めたエレクトロパレード培地の1ミリリットルで。皿を摂氏37度のインキュベーターに入れます。各皿に2つのx抗生物質培地の1ミリリットルを追加します6時間後、翌日培地を通常の培地に交換します。

クロミン細胞は通常、エレクトロポレーションの48時間から5日後に、イメージングシステムオンスタート取得ソフトウェアでイメージングされます。レーザーが位置合わせされていることを確認します。ミクロスフェアを使用してエバネッセントフィールドプロファイルを確認します。

グローバルおよびローカルの増殖システムを準備します。ろ過された脱イオン水で溶液リザーバーを洗浄し、基礎的で刺激的な生理食塩水で満たします。イメージングする前に、クロミン細胞は、P偏光とS偏光励起が視野の同じ領域を照らすこと、および照明強度がテキストプロトコルに詳述されているようにほぼ同等であることを確認してください。

次に、ウシクロマ細胞をDD.Rinseで染色し、クロミン細胞を含む皿から培養培地をリンスし、2ミリリットルの基礎生理食塩水と交換します。10マイクロリットルの10ミリモルDDを細胞を含む皿に直接加えます。溶液を取り除く前に、皿を2〜10秒間静かに攪拌します。

皿を基礎生理食塩水で3〜4回洗って残留DDを取り除くと、細胞が染色され、使用できるようになります。対物レンズにイマージョンオイルを一滴加えます。Dai D染色クロミン細胞を含むディッシュを対物レンズの上に置きます。

局所灌流針を細胞から約100ミクロン離れるように配置します。細胞膜に焦点を合わせ、細胞刺激画像取得の直前にオートフォーカスハードウェアをアクティブにします。画像取得灌流細胞を基礎溶液で10秒間開始し、次に脱分極56ミリモル塩化カリウム溶液で60秒間開始します。

561ナノメートルのP偏光と561ナノメートルの偏光の間を高速でシャッターしながら画像を取得し、DDと488ナノメートル励起のpおよびs放射の変化を監視します。トランスフェクションされた小胞プローブを画像化するために、この例ではDaiとの短時間のインキュベーション後にクロミン細胞のあふれんばかりの膜標識が達成されます D.In、細胞膜はよく染色されます。健康な接着細胞は、pとsの排出量に明確な違いを示します。

P 発光画像は、セルの残りの部分に対してセルの境界が明るくなっています。S発光画像は、Sおよびpプラス2sのピクセル間Pで計算された、細胞フットプリント全体でほぼ均一な蛍光を示しています。画像は、それぞれ膜の湾曲と染料濃度に敏感です。

示されているCHROおよび細胞は、分泌小胞を標識するために、シナプOIN1フローリンでもトランスフェクションされています。CHROと細胞は塩化カリウムで刺激され、細胞膜を脱分極し、エキソサイトーシスを引き起こします。密集したコアベシクルが融合すると、正しく蛍光を発する多くのスポットが突然明らかになります。

1つの融合イベントの周りに白いボックスが描かれていますこの融合イベントをフレームごとに分析するために、1つのフローリン、po、VS、およびpプラス2の画像強度でフレームごとに変化を調べました。CIT oneの蛍光蛍光強度は、タンパク質が融合部位から離れて拡散するにつれて急速に減少します。融合小胞の原形質膜複合体を表すくぼみは、比較的ゆっくりと

この図は、これらの測定値の 1 つの解釈を示しています。急速かつ局所的な膜変形は、刺激誘発カルシウム流入膜脱分極の結果であり、G Camp 5G蛍光の大幅な増加を引き起こし、亜プラズマカルシウムレベルの増加を意味します。セルの 30 x 20 ピクセルの領域が選択され、G camp、5G、PS、および p プラス 2 s でフレームごとに変化します。

ピクセル強度は、画像とグラフに示されています。タイムズゼロは、PSの変化が明らかになる前のフレームを示します。白い矢印は、膜の変形がpと2つのS放出の減少を伴うことを示しています。

細胞質のG CAMP 5Gタンパク質は、融合した高密度コア小胞によってその領域から除外されます。また、Gキャンプの5G強度がゼロの時点で突然減少することにも注目してください。POSの長期にわたる増加とpプラス2sの減少は、図に示すようにゆっくりと拡張する融合孔を示唆しています。

このビデオを見た後、PTU Fシステムの構築方法と、開発後の芝生での膜トポロジーの変化を観察するための細胞の画像化方法についてよく理解できるはずです。この技術は、細胞生物学の分野の研究者が、エキソサイトーシス、エンドサイトーシス、サイトカインシス、および生細胞の細胞運動性における膜形状の変化を調査する道を開きました。